CN103239518A - 治疗禽流感的中药组合物 - Google Patents

Abstract

一种治疗禽流感的中药组合物，治疗动物疾病的中药组合物，按照不同重量份数制成活性成分的原料组成：新疆一支蒿醇提物35-55份、金银花水提物20-35份、黄芩水提物20-35份。本发明的中草药组合物对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度为0.49mg/mL、1.95mg/mL，小于三种单药分别对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度中的任何一种，因而可证实中药组合物抑制H9N2流感病毒作用强于新疆一支蒿醇提物、黄芪水提物与金银花水提物三者分别对H9N2流感病毒抑制作用之和。且本发明中药组合物经临床观察无毒副作用，治愈率达到90%以上，有独特疗效。

Description

治疗禽流感的中药组合物

技术领域

本发明涉及治疗动物疾病的中药组合物，特别涉及一种治疗禽流感的中药组合物。 

背景技术

禽流感，全名鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。其后，该病一直在亚洲区零星爆发，2003年12月开始，禽流感在东亚多国，主要在越南、韩国、泰国严重爆发，并造成越南多名病人丧生。2012年3月，台湾首度发生H5N2高致病性禽流感，引发重视。2012年9月18日广东省农业厅通报，湛江发生高致病性禽流感。近几年，由于畜牧业集约化生产，使禽流感由零星发生发展为地方性流行，对养禽业造成极大的危害。到目前为止，对禽流感的防治工作还没有有效的预防方法，也没有满意的特效抗病毒药物。 

本病的主要分类及危害有以下几种： 

禽流感是一种由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。 

非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。 

低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡。 

高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽感染的死亡率几乎是100%。 

禽流感的死亡率甚至高于非典，因而具有极大危害性。目前多采用西药进行治疗，不但毒副作用较大，还会造成禽体内药物残留以及环境污染。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种治疗禽流感的中药组合物，本发明利用三种对流感病毒具有抑制作用的中药联合用药能够有效抑制禽流感病毒，且中药具有残留小、毒副作用小对环境污染低的优势。 

本发明是通过以下技术方案来实现的： 

一种治疗禽流感的中药组合物，其原料组成及重量份数：新疆一支蒿醇提物35-55份、金银花水提物20-35份、黄芩水提物20-35份。 

进一步，所述的中药组合物原料组成及份数：新疆一支蒿醇提物50份、金银花水提物25份、黄芩水提物25份 

进一步，所述的新疆一支蒿醇提物制备方法：将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，用70％-98％的乙醇提取，新疆一枝蒿全草粉末：70％-98％的乙醇为1:10，得新疆一枝蒿乙醇浸膏，并制成粉末； 

所述的金银花水提物制备方法：传统煎煮法提取，金银花：水为1:15-25，得到金银花浸膏，并制成粉末； 

黄芩水提物制备方法：传统煎煮法提取，黄芩：水为1:15-25，得到黄芩浸膏，并制成粉末。 

本发明还提供一种上述中药组合物在治疗禽流感中的应用，用法及用量为每公斤体重0.5g投服。 

药物的特性如下： 

新疆一支蒿：辛，微温。为菊科艾属植物岩蒿Artemisia rupestris L.，以全草入药，主治清热解毒。现代研究对新疆一支蒿有了新的认识。文献报道一枝蒿全草含有黄酮类、酮酸类、甾醇类、多种生物碱、内酯类及氨基酸等化合物。具有抗炎、抗过敏、抗菌、抗癌、增强免疫力、解蛇毒、保肝、抗氧化等活性。一枝蒿中提取的一枝蒿酮酸体外具有抗禽流感病毒作用。 

金银花：甘，微苦，清香，辛，寒。归肺，胃，心，大肠经。主治清热解毒、疏散风热。金银花用药历史悠久，可用于风热感冒、热毒痢疾等疾病。现代研究表明其水煎剂(1:20)在人胚肾原单层上皮细胞组织培养上,对流感病毒、疱疹病毒有抑制作用。 

黄芩：苦，寒。归肺、胆、脾、胃、大肠、小肠经。主治清热燥湿，泻火解毒。现代研究表明黄芩对Ⅰ型、Ⅱ型单纯疱疹病毒有抑制作用，并能抑制感染细胞的病毒复制，且临床应用不产生抗药性。 

黄芩与金银花已广泛用于抗病毒型感冒，考虑到新疆一支蒿中含有的一枝蒿酮酸，其衍生物已被证实具有抗流感病毒作用，因而考虑将三味中药进行组方，进行抗病毒试验，对其抗病毒作用进行验证。 

本发明的有益效果是：本发明由新疆一支蒿醇提物、金银花水提物、黄芩水提物组方，制备工艺简单，适用范围广。本发明采用纯中草药材制成，来源广泛、成本低，治愈率高，药物无残留，无毒副作用，三味中药相伍，可增强其杀灭禽流感病毒作用。本发明的中草药组合物对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度为0.49mg/mL、1.95mg/mL，小于三种单药分别对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度中的任何一种，因而可证实中药组合物抑制H9N2流感病毒作用强于新疆一支蒿醇提物、黄芪水提物与金银花水提物三者分别对H9N2流感病毒抑制作用之和。且本发明中药组合物经临床观察无毒副作用，治愈率达到90%以上，有独特疗 效。 

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下： 

新疆一支蒿醇提物制备方法：将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，用70％-98％的乙醇提取，得新疆一枝蒿乙醇浸膏，并制成粉末。 

金银花水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到金银花浸膏，并制成粉末。 

黄芩水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到黄芩浸膏，并制成粉末。 

组方中的三味中药粉末按照新疆一支蒿醇提物35-55份、金银花水提物20-35份、黄芩水提物20-35份进行组方。 

实施例1：（按每份10g计）新疆一支蒿醇提物35份，金银花水提物20份，黄芩水提物20份，混合均匀即可。 

实施例2：（按每份10g计）新疆一支蒿醇提物45份，金银花水提物22份，黄芩水提物22份，混合均匀即可。 

实施例3：（按每份10g计）新疆一支蒿醇提物50份，金银花水提物25份，黄芩水提物25份，混合均匀即可。 

实施例4：（按每份10g计）新疆一支蒿醇提物50份，金银花水提物35份，黄芩水提物35份，混合均匀即可。 

实验一体外抗病毒试验 

（实施例3）：采用血凝试验的方法，测定不同配比的中药组合物在体外和鸡胚内抑制禽流感病毒（H9N2）的效价，分析中药组合物对病毒增殖的影响。 

1实验材料 

甲型流感病毒（H9N2）；中药组合物（新疆一支蒿醇提物5g，金银花水提物2.5g，黄芩水提物2.5g），利巴韦林注射液（广东三才医药集团有限公司，国药准字H19999240）；9日龄来亨鸡胚； 

所述的新疆一支蒿醇提物制备方法：将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，用70％-98％的乙醇提取，新疆一枝蒿全草粉末：70％-98％的乙醇为1:10，得新疆一枝蒿乙醇浸膏，并制成粉末； 

所述的金银花水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到金银花浸膏，并制成粉末； 

黄芩水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到黄芩浸膏，并制成粉末。 

1%鸡红细胞悬液：采健康公鸡血，阿氏液抗凝，生理盐水1500转/分钟离心洗涤3次，弃上清，以无菌生理盐水配制成1%悬液，4℃冷藏备用。 

2实验方法 

2.1病毒H9N2的50%鸡胚感染量（EID₅₀）测定 

将H9N2流感病毒原液作10倍系列对数稀释（10^-1-10^-12），分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内，0.1mL/胚，每组5胚，并做生理盐水对照。将鸡胚放入33-35℃温箱内孵育48h，置4℃冰箱内过夜；收取尿囊液，每胚0.1mL依次加入作好标记的血凝板上，再加入预先配制好的1%的鸡红细胞悬液0.1mL，轻摇后40min观察结果，用Reed-Muench法测得EID₅₀为10^-6.89，实验用100EID₅₀。 

2.2药物对鸡胚最大无毒浓度的测定 

用含PS10%的生理盐水将药物原液作连续10倍系列稀释，分5个浓度组，每次抽取0.2mL分别接种在预先作好标记的鸡胚上，0.1mL/胚，每组5胚，并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入33-35℃温箱内孵育48h，每12h观察记录鸡胚存 活情况，24h内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。因三味中药提取物组自原液起未发现死亡鸡胚，故将原液浓度500mg/mL作为药物最大无毒浓度，利巴韦林注射液最大无毒浓度：50mg/mL。 

2.3不同浓度药物对病毒H9N2的抑制作用 

鸡胚随机分为8组，每组5胚，具体分组见表1。 

表1实验分组及处理 

3实验结果 

中药组合物500mg/mL，50mg/mL，5mg/mL，其血凝效价因数分别为1.7566±0.3481、1.8161±0.3562、1.9564±0.3521，与病毒对照组比较，有显著性差异（P<0.001）；利巴韦林注射液50mg/mL时，其血凝效价因数为2.4102±0.2587，与病毒对照组比较差异显著（P<0.01）；中药组合物500mg/mL时对流感病毒的预防作用明显优于阳性对照利巴韦林注射液组（P<0.05），而50mg/mL，5mg/mL两个浓度与阳性对照组比较无显著差异（P>0.05）。结果见2： 

表2不同药物对病毒抑制作用 

注：与病毒组比，*P<0.01，**P<0.001；与阳性对照组比，^#P<0.05 

与病毒对照组相比，中药组合物组血凝效价明显下降，其抑制作用时间可从 1h可持续到24h，其对病毒的抑制作用随着药物浓度的降低而逐渐减弱，并证实中药组合物抗禽流感病毒的效果最强。 

实验二（应用实施例三）：中药组合物作为抗病毒药物，采用细胞病变效应(CPE)抑制实验测出中药组合物在鸡胚成纤维细胞(CEF)上培养对禽流感病毒(H9N2)的最小直接杀灭浓度和最小阻断浓度，以证明本发明的中药组合物联合用药的药效大于三种单药的药效之和。即本发明中药组合物对病毒的最小直接杀灭浓度和最小阻断浓度小于3种单药对病毒的最小直接杀灭浓度和最小阻断浓度中的最小值。 

1实验材料 

甲型流感病毒（H9N2）；中药组合物（新疆一支蒿醇提物5g，金银花水提物2.5g，黄芩水提物2.5g）；新疆一支蒿醇提物；金银花水提物；黄芩水提物；鸡胚成纤维细胞(CEF)原代培养，生长液（用于鸡胚成纤维细胞的培养）含10%小牛血清的DMEM营养液(购自GIBCO公司)，维持液为2%小牛血清的DMEM营养液。 

所述的新疆一支蒿醇提物制备方法：将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，用80％的乙醇提取，新疆一枝蒿粉末：80％的乙醇为1:10，得新疆一枝蒿乙醇浸膏，并制成粉末； 

所述的金银花水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到金银花浸膏，并制成粉末； 

黄芩水提物制备方法：传统煎煮法提取，生药：水为1:15-25，得到黄芩浸膏，并制成粉末。 

2实验方法 

2.1中药组合物对细胞无毒测定 

96孔培养板上进行，将用维持液倍比稀释的药液分别加入长成良好的鸡胚成纤维单层细胞中，每个浓度2孔，同时设对照，在5%CO₂37℃培养72h，每天观察 鸡胚成纤维细胞形态变化及有无细胞病变。通过观察细胞病变程度，以能维持良好单层鸡胚成纤维细胞的药物的最高浓度作为药物的无毒浓度。抗病毒试验采用不高于无毒浓度的药液进行。药物的稀释浓度见表3。 

表3中药组合物及三种单药的稀释浓度 

2.2中药组合物及各单药对病毒的直接杀灭作用测定 

96孔细胞细胞培养板进行试验，用100TCID₅₀稀释的病毒将各组药物（中药组合物及3种单药）于灭菌的离心管中倍比稀释，稀释浓度见表3，将离心管置于5%CO₂培养箱培养1h，然后加入到一块各孔长成单层细胞的96孔细胞培养板内，并设细胞对照(记为C)、病毒对照(记为V)。每孔200μl，每个稀释度2孔，72h后记录细胞病变，出现75%以上细胞病变记为++++，50%以上病变记为+++，25%以上病变记为++，0-25%记为+，无病变记为-。 

2.3中药组合物及各单药对病毒的阻断作用 

将中药组合物及各单药用维持液作倍比稀释，稀释浓度见表3，然后加入长成单层的鸡胚成纤维细胞培养板,每孔100μ1，置5%CO₂培养箱中作用1h，然后加入稀释的病毒，每孔100μ1，并设对照，72h后记录细胞病变，记录方法同上。 

3实验结果 

3.1TCID₅₀及中药组合物对鸡胚成纤维细胞的无毒浓度结果 

实验测得病毒的TCID₅₀为10^-3.72/0.1mL，中药组合物对CEF细胞的无毒浓度为62.5mg/mL。 

3.2中药组合物及各单药对病毒的最小直接杀灭作用测定结果 

中药组合物、新疆一支蒿醇提物、金银花水提物和黄芩水提物对病毒的最小直接杀灭浓度分别为0.49mg/mL、3.9mg/mL、1.95mg/mL和7.81mg/mL见表4。 

表4中药组合物及各单药对病毒的直接杀灭作用结果 

3.3中药组合物及各单药对病毒的阻断作用 

中药组合物、新疆一支蒿醇提物、金银花水提物和黄芩水提物对病毒的最小阻断浓度为1.95mg/mL、15.62mg/mL、7.81mg/mL和15.62mg/mL，见表5。 

表5中药组合物及各单药对病毒的最小阻断作用结果 

从实验结果可以看出，本发明的中草药组合物对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度为0.49mg/mL、1.95mg/mL，小于三种单药分别对H9N2流感病毒的最小直接杀灭和最小阻断浓度中的任何一种，因而可证实中药组合物抑制H9N2流感病毒作用强于新疆一支蒿醇提物、黄芪水提物与金银花水提物三者分别对H9N2 流感病毒抑制作用之和。 

实验三：急性毒性试验（应用实施例三）：采用改良寇氏法测定中药组合物对实验小鼠的半数致死量LD₅₀，验证中药组合物对小鼠的毒性。 

1实验材料 

中药组合物（新疆一支蒿醇提物5g，金银花水提物2.5g，黄芩水提物2.5g，单药提取方法同上述实验）； 

健康、清洁级昆明小鼠，体重20±2g，雌雄各半，试验前适应实验环境5d，以了解其正常活动情况和健康状况。 

2试验方法 

2.1灌胃给药预试验 

取30只试验小鼠按随机的原则分为6组，每组5只。参考临床剂量用不同浓度的受试药液给小鼠经口灌胃给药染毒，观察并记录死亡情况。 

2.2内服急毒正式试验中试验动物的处理 

取试验小鼠60只，体重22±2g，雌雄各半，分笼饲养。自然光照，室温22℃左右。于试验前对小鼠进行3d的喂养观察，在观察期内小鼠自由采食、饮水。小鼠具体分组及处理如下：中药组合物组共分5个浓度组，编号1-5号，浓度依次减少，每组10只，按体重计算灌胃剂量，大约为0.2mL/10g，灌胃前禁食12h，但不禁水；对照组用生理盐水代替中药组合物。 

2.3试验剂量的选择 

通过多次预试验结果，测得中药组合物的Dm(100%死亡率)为10000mg/kg，Dn(0死亡率)为3336mg/kg，r=1.32。 

2.4经口服急性毒性试验LD₅₀的处理 

中药组合物组：取禁食12h的小鼠60只，雌雄各半，并随机分为5组，组间 距按1:0.76分为10000、7672、5813、4404、3336mg/kg体重5个剂量组，按照体重计算灌胃剂量（小鼠灌胃容量VmL=体重g×20mL/1000g），即刻观察各组出现的毒性反应，并连续观察7d，记录受试小鼠的毒性反应及死亡情况；空白组灌胃生理盐水。 

2.5统计学分析 

采用改良寇氏法公式计算半数致死量(LD₅₀)： 

LD₅₀=lg^-1[Xm-i(Σp-0.5)]；LD₅₀的95%可信限=lg^-1(lg^-1LD₅₀±1.96×Sx50)；其中i=Sx50；式中:Xm为最大剂量组剂量的对数值；i为剂间比的对数值；Σp为各组死亡率之和；p为各组死亡率；q为各组存活率，q=1-p；n为各组动物数；Sx50为lgLD₅₀的标准误差，Sx50=i[(∑p-∑p²)/n-1]。 

2.6急性毒性分级的判定 

按照外源性化学物急性毒性的分级标准，对中药组合物经口毒性进行判定。毒性级别判定标准：小鼠经口LD₅₀（mg/kg）＜1，剧毒；1-50，高毒；50-500，中等毒；500-5000，低毒；＞5000，实际无毒。 

3实验结果 

在给药4h后，给药组小鼠均表现出不同程度的站立不稳、左右摇晃，抽搐、僵直等现象。低剂量组大部分受试小鼠在24h后上述症状逐渐消失，中剂量组部分受试小鼠在48h内症状消失，存活小鼠直到7d后亦未见有明显的异常表现，小鼠饮食饮水均正常。但高剂量组大部分小鼠均出现抽搐、僵直，甚至死亡。将第一天死亡的小鼠解剖，未见有主要脏器发生明显的变化，病理组织学检查也未见明显的病理学改变。小鼠灌胃LD₅₀测定结果见表6。 

表6中药组合物的LD₅₀

按照改良寇氏法公式计算半数致死量(LD₅₀)，按公式代入试验数据，求出试验结果即LD₅₀的值：LD₅₀=5916mg/kg；LD₅₀的95%可信限为5152-6637mg/kg。 

根据小鼠经口药物急性毒性的分级标准，可知中药组合物无毒。 

实验四：体内抗流感病毒试验（应用实施例三）： 

对小鼠进行攻毒，通过检测实验鼠的死亡率、平均存活天数、平均体重、肺指数、肺病变抑制率等指标来观察中药组合物在小鼠体内的抗病毒作用。 

1实验材料 

甲型流感病毒（H9N2）；中药组合物（新疆一支蒿醇提物5g，金银花水提物2.5g，黄芩水提物2.5g，单药提取方法同上述实验），利巴韦林注射液（广东三才医药集团有限公司，国药准字H19999240）； 

SPF级小鼠，6-7周龄，正常饲养3d后供试。 

2试验方法 

2.1攻毒给药 

将小鼠随机分为生理盐水对照组、病毒对照组、利巴韦林阳性对照组和中药组合物组，每组10只。用乙醚轻度麻醉小鼠，滴鼻感染2个LD₅₀的病毒稀释液，生理盐水组滴予等量生理盐水。灌胃给药，病毒对照组灌服等量生理盐水，感染前1d开始给药，2次/d，每次0.2mL，连续给药7d。观察动物发病情况并记录死亡数，共观察21d，根据观察结果计算每组死亡小鼠平均存活天数，死亡保护率和生命延长率。 

死亡保护率(％)=(病毒组死亡数-试验组死亡数)/病毒组死亡数×100 

生命延长率(％)=(试验组平均存活时间-病毒组平均存活时间)/病毒组平均存活时间×100 

2.2统计方法 

统计软件SPSS17.0进行统计分析。 

实验结果：见表7。 

表7药物对感染H9N2病毒小鼠保护作用结果 

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01 

由表7可看出，与病毒组比较，中药组合物组有显著保护作用，且保护作用随浓度增而增强。结果表明，中药组合物在小鼠体内具有抗禽流感病毒(H9N2)的活性，50mg/kg以上剂量组可明显降低禽流感病毒感染小鼠的死亡率，提高小鼠的存活率，且药效随浓度增加成正比。 

实验五：临床试验（应用实施例三）： 

通过实验，25只通过人工感染的H9N2亚型禽流感病毒的试验活鸡，应用本发明中药组合物（新疆一支蒿醇提物5g，金银花水提物2.5g，黄芩水提物2.5g，单药提取方法同上述实验）按每公斤体重0.5g投药，一天基本恢复食欲，连用3天后，试验活鸡全部存活，体内也未检测出禽流感病毒。 

以上实验是以实施例三的中药组合物开展的实验，有实验二可以看到本发明的的利用三种对流感病毒具有抑制作用的中药联合应用可以取得意想不到的效果，即联合用药的效果远远大于三种单药分别作用效果之和，因此，三种单药联合用药时能够产生协同增效的作用，由新疆一支蒿醇提物35-55份、金银花水提物20-35份、黄芩水提物20-35份制成的本发明中药组合物均可对H9N2亚型禽流感病毒起到有效的抑制作用。 

Claims (3)

1.一种治疗禽流感的中药组合物，其特征在于按照不同重量份数制成活性成分的原料组成：新疆一支蒿醇提物35-55份、金银花水提物20-35份、黄芩水提物20-35份。

2.根据权利要求1所述的一种治疗禽流感的中药组合物，其特征在于所述的中药组合物原料组成：新疆一支蒿醇提物50份、金银花水提物25份、黄芩水提物25份。

3.根据权利要求1所述的一种治疗禽流感的中药组合物，其特征在于所述的新疆一支蒿醇提物制备方法：将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，用70％-98％的乙醇提取，新疆一枝蒿全草粉末：70％-98％的乙醇为1:10，,得新疆一枝蒿乙醇浸膏，并制成粉末；

所述的金银花水提物制备方法：传统煎煮法提取，金银花：水为1:15-25，得到金银花浸膏，并制成粉末；

黄芩水提物制备方法：传统煎煮法提取，黄芩：水为1:15-25，得到黄芩浸膏，并制成粉末。