CN103232941A

CN103232941A - 一株高产菊粉酶真菌的制备方法

Info

Publication number: CN103232941A
Application number: CN 201310128481
Authority: CN
Inventors: 朱启忠; 赵洁
Original assignee: Shandong University Weihai
Current assignee: Shandong University Weihai
Priority date: 2013-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明所属微生物种类开发技术领域。本发明涉及一株高产菊粉酶真菌的制备方法。在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌15-20天；取土壤10g于内置90毫升无菌蒸馏水与适量玻璃珠的250ml锥形瓶中，30℃，180r/min摇床20分钟；取稀释液适量涂布于筛选培养基，30℃培养4-6天；初筛后所得的菌株经多次纯化得纯种A1；A1进行发酵培养，提取菌株的总DNA送上海生工生物技术公司测序；将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌18S rDNA基因序列相似度高的菌种，采用ClustalW进行多序列比对；结合形态鉴定和18S rDNA序列分析比对，得A1菌株为囊状青霉Eladia saccula SA1201。该菌株菊粉酶活力较高，为11.8395u/mL，适合于进一步优化培养和制备基因工程菌。

Description

一株高产菊粉酶真菌的制备方法

技术领域

本发明所属微生物种类开发技术领域。本发明涉及一株高产菊粉酶真菌的制备方法研究，适合工业化应用。

背景技术

菊粉(Inulin)又名菊糖，源自于菊芋块根，是一种天然果糖聚合物，由D-呋喃果糖分子以β-(2，1)糖苷键连接而成的果聚糖。每个菊粉分子末端以α-(1，2)糖苷键连接一个葡萄糖残基，聚合度通常为2-60，平均聚合度为10，其中聚合度较低时(DP＝2-9)则可称为低聚果糖。作为一种天然可溶性膳食纤维，菊粉几乎不被胃酸水解和消化，而在结肠中被大量有益微生物发酵，因而具备多种保健功能，如控制血脂、降低血糖、改善肠道功能、促进矿物质吸收等。菊粉不仅可以作为脂肪替代品应用于低能量食品生产，而且具有膳食纤维以及益生素的生理功能，是一种优秀的功能性食品基料。目前，菊粉广泛应用于医药保健业、食品工业等领域。。

菊粉酶(Inulinase)是能够水解β-2，1-D-果糖苷键的一类酶，学名为β-2，1-D-果聚糖酶。它主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于植物的菊粉酶，其底物专一性较强，仅作用于菊粉；而由微生物产生的菊粉酶大部分都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷健的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分仅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷键的方式不同，可分为内切和外切两类。外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)作用于菊粉链果糖末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要产物为果糖；内切菊粉酶(EC 3.2.1.7)仅作用于菊粉，随机断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖。因此可通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料，生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等产品。这些产品由于具有广阔的应用前景，促使国外很多学者从20世纪80年代就开始深入开展菊粉酶的研究。毫无疑问，微生物合成是生产大量的工业用酶的唯一方法，30年来许多学者致力于寻找生产菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韩国和欧洲在这方面积累了丰富资料。我国关于菊粉酶的研究始于20世纪90年代，主要研究集中于菌株筛选和酶学性质方面，并且正日益受到人们的重视。但目前能在工业中应用的产菊粉酶的菌株筛选和发酵研究进展比较缓慢，因此选育优良的产菊粉酶菌株和发酵条件是菊芋生产乙醇工程的核心环节。

我们从从自然界中选育得到了一株高产菊粉酶菌株，目前还没对该菌株进行相关报道。

发明内容

1.本发明涉及一株产菊粉酶真菌的制备，其特征在产菊粉酶真菌的制备方法，包括以下过程：

步骤(一)：在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌15-20天；

步骤(二)：取步骤(一)土壤10g于内置90毫升无菌蒸馏水与适量玻璃珠的250ml锥形瓶中，30℃，180r/min摇床20分钟；

步骤(三)：取步骤(二)稀释液0.2-0.4毫升涂布于筛选培养基，30℃培养4-6天；

步骤(四)：将步骤(三)分离、初筛后所得的菌株利用平板划线方法分离纯化；

步骤(五)：重复步骤(四)3-4次，得到纯种A1；

步骤(六)：挑取步骤(五)中的菌株接种于发酵培养基进行发酵培养，30℃摇振培养4-6d，提取菌株的总DNA作为模板，利用通用引物进行PCR反应，纯化；

步骤(七)：将步骤(六)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌18S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对；

步骤(八)：鉴定后的菌种保存备用。

2.根据本发明所述1，A1菌株的18S rDNA序列长度为1300bp，命名为囊状青霉Eladia saccula SA1201。

附图说明

图1是“透明圈”法图；图2是A1菌株18S rDNA分子生物鉴定结果图。

具体实施方式

本发明所述的涉及一株产菊粉酶真菌的筛选和鉴定，包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：产高活力菊粉酶真菌的筛选

1材料和方法

1.1材料

1.1.1分离试样

山东威海滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌15-20d。

1.1.2主要试剂及仪器

菊粉，化学纯，广州泽钰生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸，化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司；智能生化培养箱，宁波海曙莱特仪器厂；恒温振荡器，江苏省金坛市医疗器械仪器厂；

721分光光度计，北京市六一仪器厂。

1.2培养基

筛选培养基(g/L)：菊粉10.0，MgSO₄·7H₂O0.5，NaNO₃1.5，NH₄H₂PO₄2.0，KCl 0.5，FeSO₄·7H₂O₄0.1，K₂HPO₄1.0，琼脂20.0，初始pH6.0。

发酵培养基(g/L)：菊粉20.0、酵母膏5.0、NaCl 5.0、K₂HPO₄·3H₂O3.0，初始pH6.0。

斜面培养基：查氏培养基^[2]。

以上培养基在配置完成后，均需121℃高压灭菌20min。

1.3菊粉酶活力测定

3，5-二硝基水杨酸法(DNS比色法)：取0.5ml粗酶液，加人4ml用0.1mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液配制的2％的菊粉溶液，50℃水浴中反应20min。沸水浴中5分钟终止反应。取反应液0.5ml加人1.5mlDNS混匀，沸水浴中反应5min，迅速冷却并稀释至20ml，在540nm处，用分光光度计测定其吸光度A，根据葡萄糖标准曲线计算生成的还原糖含量^[3]。

菊粉酶活力单位定义为：在上述条件下，每分钟生成1umol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。

1.4产菊粉酶真菌的筛选

1.4.1分离、初筛

分组取土壤10g于内置90ml无菌蒸馏水与适量玻璃珠的250ml锥形瓶中，30℃，180r/min摇床20min。取上述稀释液梯度稀释3次，编号1、2、3组，浓度分别为10^-1，10^-2，10^-3。分别取三组稀释液各0.2ml涂布于筛选培养基，30℃培养4-6d。

产菊粉酶的菌种的筛选，一般采用“透明圈”法。筛选菌种的土壤稀释样液在菊粉为唯一碳源的琼脂平板上，利用菊粉不溶于冷水易溶于热水的特性，当培养基冷却后平板不透明，若样品中有产菊粉酶的微生物时，就可以利用菌落附近的菊粉，这样在其菌落周围即可形成“透明圈”。经过透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株^[4]。

1.4.2纯化

将分离、初筛后所得的菌株利用平板划线方法分离纯化，并重复进行多次分离，肯定为纯种菌后作为鉴定实验用的菌源。

1.4.3复筛

(1)菌悬液制备：挑取一接种环菌体于50ml无菌生理盐水，充分均匀备用。

(2)发酵培养：发酵培养基装量为50ml的250ml锥形瓶中加入以上菌悬液1ml，30℃发酵培养72h。

(3)粗酶液制备：取发酵液于5000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。进而进行酶活测定，筛选出酶活较高的菌株。

1.5菊粉酶性质的测定

通常用I/S的大小来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I是以菊粉作底物时的酶活，即菊粉酶酶活力；S是以蔗糖作底物时的酶活，即转化酶酶活力。测定筛得酶对2％的菊粉溶液的活性和2％蔗糖溶液的活性，计算出I/S值。一般认为当I/S＞10时，酶表现为内切活性；I/S＜10时，表现为外切酶活性。

2结果与讨论

2.1菌株筛选

2.1.1初筛与纯化

通过“透明圈”(如图1)法筛选产菊粉酶活力较高的菌株，经平板划线纯化培养得到产酶活力较高的25株菌。

2.1.2复筛

将初筛得到的25株菌经进一步进行摇瓶发酵，得到产酶活力相对较高的菌5株，经初步鉴定均为青霉菌。得到产菊粉酶活力见表1。

表1产菊粉酶活力

由此可推断，仅A10所产酶表现为内切酶活性，其它四株菌均表现外切酶活性。

3总结

实验筛选得到三株高产菊粉外切酶的菌株，在30℃下150r/min摇瓶复筛，72h后测定，A1、D17、D19菌株的菊粉外切酶活性分别为11.8395u/mL、10.0580u/mL和10.1053u/mL，其中A1号菌株菊粉酶活力最高，为11.8395u/mL。

实施例2：高产菊粉酶真菌的形态鉴定

2.1培养物观察

将酶活力优秀的待鉴定菌株A1划线培养于察氏培养基平板上，每个菌株接入2个培养基，共10个，编号1～10号，30℃培养，视长势而定，在1——10d内观察菌株在平板中的外部形态。

2.2形态观察

经过观察，A1菌株形态结构如下：

(1)菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色；产孢区长排列成同心轮纹状；菌落反面呈浅黄色。

(2)菌丝透明，有隔，细胞壁光滑。

(3)球形绿色的分生孢子头。

(4)分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分枝多

(5)分生孢子呈球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺，单胞，靠粘液在小埂上聚集。

根据青霉属种类检索表可初步认定该株菌为青霉属的一个种。

实施例3：高产菊粉酶真菌的分子生物学鉴定

经形态学初步鉴定的菌株A1送生工生物工程(上海)股份有限公司进行18S rDNA分子生物学鉴定，结果如图2。测序结果表明，A1的18S rDNA序列长度为1300bp。将该株细菌测序结果在GenBank数据库中进行Blast，根据18S rDNA的序列分析比对，得出该菌株为囊状青霉Eladia saccula SA1201 。

Claims

步骤(五)：重复步骤(四)3-4次，得到纯种A1；

步骤(八)：鉴定后的菌种保存备用。

2.根据本发明所述1，A1菌株的18S rDNA序列长度为1300bp，命名为囊状青霉Eladiasaccula SA1201。