CN103226100A - 一种量子产率的测试方法 - Google Patents
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Abstract
公开了一种量子产率的测试方法，用于测试待测样品的量子产率Q，包括：提供量子产率为Qr的参比样品；提供折射率为nr的第一溶剂和折射率为n的第二溶剂，获得参比样品溶液/胶体和待测样品溶液/胶体；获得参比样品溶液/胶体的吸光度Ar，和待测样品溶液/胶体的吸光度A；制备稀释因子为Tr的参比样品稀释液，和稀释因子为T的待测样品稀释液；获得参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I；计算单分子水平下的量子产率
该测试方法简单，测量准确性较高，为量子产率计算提供了理论方法。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，尤其涉及一种量子产率的测试方法。
背景技术
荧光材料的量子产率是其最基本和重要的性质参数。理论上量子产率定义为发射总光子数与吸收总光子数之比。目前，测定量子产率的直接方法有积分球法、热透镜法、光声光谱法等，这些方法需要直接测定光子数的专业仪器，一般的实验室很难进行。
测定量子产率的间接方法有传统光谱参比法，这类方法简单快速，花费低，但是由于光谱测量需要高浓度样品溶液，其碰撞淬灭、重吸收、及内滤光效应降低了测量的准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种量子产率的测试方法，可以精确的测试量子产率。
为了解决上述技术问题，本发明的实施例提供了一种量子产率的测试方法，用于测试待测样品的量子产率Q，包括：
提供一量子产率为Qr的参比样品；
提供折射率为nr的第一溶剂和折射率为n的第二溶剂，将所述参比样品溶于所述第一溶剂，制备得到参比样品溶液/胶体，将所述待测样品溶于所述第二溶剂，制备得到待测样品溶液/胶体；
测试所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱，获得所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar，和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A；
分别稀释所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体，制备得到稀释因子为Tr的参比样品稀释液，和稀释因子为T的待测样品稀释液；
测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，获得所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I；
根据获得的上述参数，计算单分子水平下量子产率Q如下：
其中，所述提供一量子产率为Qr的参比样品包括：
将所述待测样品溶于所述第二溶剂中，制备得到所述待测样品溶液/胶体，并测量所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱和发射光谱，以查表择取所述参比样品，所述参比样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围一致，或所述参比样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围一致，所述参比样品溶液/胶体的量子产率为Qr。
其中，所述第一溶剂为水、乙醇、环己烷、氯仿或甲苯中的一种，所述第二溶剂为水、乙醇、环己烷、氯仿或甲苯中的一种。
其中，所述吸收光谱包括紫外可见吸收光谱和红外吸收光谱，所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A均小于0.1。
其中，所述测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，获得所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I包括：
滴加所述参比样品稀释液于第一玻片上，滴加所述待测样品稀释液于第二玻片上，所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的体积相等；
采用单分子荧光检测设备分别测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，所述单分子荧光检测设备的激发光波长、激光功率、曝光时间和发射滤光片范围均相等；
选取测量范围相同的所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的所述荧光图像各10-20张；
采用模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子个数进行计数，并计算平均值，以得到所述参比样品稀释液的分子或粒子数Nr和所述待测样品稀释液的分子或粒子数N；
采用所述模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子的荧光强度进行测量，并计算平均值，以获得所述参比样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度Ir和所述待测样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度I。
其中，所述单分子荧光检测设备包括全内反射荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜。
其中，所述模拟软件包括Matlab、IDL或Image J软件。
其中，所述参比样品包括染料罗丹明101，所述待测样品包括高氯酸恶嗪、605量子点、罗丹明6G或655量子点。
本发明实施例提供的量子产率的测试方法，方法简单。在单分子水平下，碰撞淬灭、重吸收、及内滤光效应的影响均较小，提高了测量的准确性，为量子产率计算提供了理论方法，适用于有机染料、量子点等各种荧光材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的量子产率的测试方法流程图；
图2为本发明实施例一提供的量子产率的测试方法中，所述高氯酸恶嗪溶液和所述罗丹明101溶液的归一化吸收光谱(Abs)和荧光发射光谱（Em）；
图3是本发明实施例一提供的量子产率的测试方法中，全内反射荧光显微镜下罗丹明101稀释液的荧光图像；
图4是本发明实施例一提供的量子产率的测试方法中，全内反射荧光显微镜下高氯酸恶嗪稀释液的荧光图像；
图5是本发明实施例一提供的量子产率的测试方法中，单个罗丹明101稀释液分子的荧光强度；
图6是本发明实施例一提供的量子产率的测试方法中，单个高氯酸恶嗪稀释液分子的荧光强度；
图7是本发明实施例二提供的量子产率的测试方法中，所述605量子点溶液和所述罗丹明101溶液的归一化吸收光谱(Abs)和荧光发射光谱（Em）；
图8是本发明实施例二提供的量子产率的测试方法中，全内反射荧光显微镜下罗丹明101稀释液的荧光图像；
图9是本发明实施例二提供的量子产率的测试方法中，全内反射荧光显微镜下605量子点稀释液的荧光图像；
图10是本发明实施例二提供的量子产率的测试方法中，单个罗丹明101溶液稀释液分子的荧光强度；
图11是本发明实施例二提供的量子产率的测试方法中，单个605量子点稀释液粒子的荧光强度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
参见图1，为本发明实施例一提供的量子产率的测试方法，用于测试待测样品的量子产率Q，包括以下步骤：
（1）提供一量子产率为Qr的参比样品。该步骤具体为：将所述待测样品溶于所述第二溶剂中，制备得到待测样品溶液/胶体。参见图1，测量所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱和发射光谱，以查表择取所述参比样品。选择的所述参比样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围一致，或所述参比样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围一致。所述参比样品的量子产率为Qr。本实施例中，所述待测样品为高氯酸恶嗪，简称LD690。相对应择取的参比样品为罗丹明101，简称R101。
（2）提供折射率为nr的第一溶剂和折射率为n的第二溶剂，将所述参比样品溶于所述第一溶剂，制备得到参比样品溶液/胶体。将所述待测样品溶于所述第二溶剂，制备得到待测样品溶液/胶体。本实施方式中，所述第一溶剂的折射率nr与所述第二溶剂的折射率为n相等，具体的，所述第一溶剂和第二溶剂均为折射率为1.333的水。在其他实施方式中，所述第一溶剂和第二溶剂为不同的溶剂，可选的溶剂有乙醇（折射率为1.3616）、环己烷（折射率为1.4262）、氯仿（折射率为1.4458）或甲苯（折射率为1.4969）。
（3）测试所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱，获得所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar，和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A。另外，还获得所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A均较强时，对应的吸收波长值。所述吸收光谱包括紫外可见吸收光谱和红外吸收光谱。参见图2，在本实施方式中，所述吸收光谱为紫外可见吸收光谱。由于吸收波长范围较大，每个吸收波长对应的吸光度都不同。在所述罗丹明101溶液和所述高氯酸恶嗪溶液中，当吸收波长为532nm时，吸光度都较强，故选择532nm波长对应的所述罗丹明101溶液的吸光度Ar，和所述高氯酸恶嗪的吸光度A。吸收波长532nm也作为后续测试荧光图像时的激发波长。
（4）分别稀释所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体，制备得到稀释因子为Tr的参比样品稀释液，和稀释因子为T的待测样品稀释液。
（5）测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，获得所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I。具体的，该测试步骤包括：
滴加所述参比样品稀释液于第一玻片上，滴加所述待测样品稀释液于第二玻片上，所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的体积相等。本实施方式中，所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的体积为80μL，所述第一玻片和所述第二玻片经相同的方式处理过。
采用单分子荧光检测设备分别测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像。在分别测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像时，所述单分子荧光检测设备的激发光波长、激光功率、曝光时间和发射滤光片范围均相等。所述单分子荧光检测设备的激发光波长值与所述吸收波长值相等。所述单分子荧光检测设备包括全内反射荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜。本实施方式中，采用的单分子荧光检测设备是全内反射荧光显微镜，激发波长为532nm，激光功率为8mW，曝光时间为200ms，发射滤光片范围为585±20nm，入射角为68度，穿透深度为150nm。在其他实施方式中，所述单分子荧光检测设备可采用其他的荧光检测设备，激发波长、激光功率、曝光时间和发射滤光片范围及其他参数均可根据测试需要调节参数范围。
参见图3和图4，分别为全内反射荧光显微镜下。罗丹明101稀释液和高氯酸恶嗪稀释液的荧光图像。其中，所述白色亮点为罗丹明101或高氯酸恶嗪稀释液的单个分子。选取测量范围相同的所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的所述荧光图像各10-20张。本实施方式中，所述测试范围为32×32μm2，测试的荧光图像为10张。
采用模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子个数进行计数。并计算平均值，以得到所述参比样品稀释液的分子或粒子数Nr和所述待测样品稀释液的分子或粒子数N。
参见图5和图6，采用所述模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子的荧光强度进行测量，其中，横坐标为单个分子或粒子的荧光强度，纵坐标为该荧光强度出现的频率，图5和图6均表明了单个分子或粒子的荧光强度的分布情况，并计算平均值，以获得所述参比样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度Ir和所述待测样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度I。所述模拟软件包括Matlab、IDL或Image J软件。本实施方式中，所述模拟软件为Image J软件。将所述荧光图像导入Image J软件中，设定分析图像的阈值后，利用所述Image J软件的“Analyze particle”功能，计算得出所述罗丹明101稀释液的分子个数Nr，和所述高氯酸恶嗪稀释液的分子个数N。另外，选中要测量的荧光分子，利用所述Image J软件的“Measure”功能，测得单个分子的荧光强度值，进而统计整个所述荧光图像的所有分子的荧光强度值。并以单个分子的荧光强度为横坐标，某一荧光强度出现的频率为纵坐标，做柱状分布图，并对其进行高斯拟合，得到的平均值即为该所述罗丹明101稀释液的单个分子的荧光强度Ir，和高氯酸恶嗪稀释液单个分子的荧光强度I。
（6）根据获得的上述参数，计算待测样品的在单分子水平下的量子产率Q如下：
（7）重复多次步骤（2）～（6）多次，以多次测量所述待测样品的量子产率Q，计算量子产率Q的平均值和标准偏差。本实施方式中，计算得到的所述高氯酸恶嗪的量子产率Q=0.152±0.008。此结果与传统光谱参比法测得的量子产率0.142±0.006一致。
综上，本发明实施例提供一种新的量子产率的测试方法，该方法在已知所述参比样品的量子产率Qr、所述第一溶剂的折射率nr和第二溶剂的折射率n、所述参比样品稀释液的稀释因子Tr和待测样品稀释液的稀释因子T的条件下，测试在相同激发波长下，所述参比样品溶液/胶体吸光度Ar和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A，每张所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和荧光强度Ir，和每张所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和荧光强度I、再代入计算公式，得出待测样品的量子产率Q。
本发明实施例提供一种新的量子产率的测试方法，该测试方法简单。在单分子水平下，碰撞淬灭、重吸收、及内滤光效应的影响均较小，提高了测量的准确性，为量子产率计算提供了理论方法，适用于有机染料、量子点等各种荧光材料。
实施例二
本发明实施例二提供的量子产率的测试方法，与实施例一提供的量子产率的测试方法基本相同，其不同之处在于，所述待测样品为605量子点，简称605QDs。所述参比样品为罗丹明101，简称R101。所述全内反射荧光显微镜的曝光时间为100ms。
其中，图7是实施例二中，所述605量子点溶液和所述罗丹明101溶液的归一化吸收光谱(Abs)和荧光发射光谱（Em），图8是全内反射荧光显微镜下罗丹明101稀释液的荧光图像，图9是全内反射荧光显微镜下605量子点稀释液的荧光图像，图10是单个罗丹明101溶液稀释液分子的荧光强度，图11是单个605量子点稀释液粒子的荧光强度。
计算得到所述605量子点的量子产率为Q=0.163±0.009。此结果与传统光谱参比法测得的量子产率0.149±0.007一致。
实施例三
本发明实施例三提供的量子产率的测试方法，与实施例一提供的量子产率的测试方法基本相同，其不同之处在于，所述待测样品为罗丹明6G，所述参比样品为罗丹明101，计算得到所述罗丹明6G的量子产率Q，Q=0.950±0.049。此结果与传统光谱参比法测得的量子产率0.921±0.019一致。
实施例四
本发明实施例四提供的量子产率的测试方法，与实施例一提供的量子产率的测试方法基本相同，其不同之处在于，所述待测样品为655量子点，所述参比样品为罗丹明101，计算得到所述655量子点的量子产率Q，Q=0.180±0.010。此结果与传统光谱参比法测得的量子产率0.169±0.009一致。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种量子产率的测试方法，用于测试待测样品的量子产率Q，其特征在于，包括：
提供一量子产率为Qr的参比样品；
提供折射率为nr的第一溶剂和折射率为n的第二溶剂，将所述参比样品溶于所述第一溶剂，制备得到参比样品溶液/胶体，将所述待测样品溶于所述第二溶剂，制备得到待测样品溶液/胶体；
测试所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱，获得所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar，和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A；
分别稀释所述参比样品溶液/胶体和所述待测样品溶液/胶体，制备得到稀释因子为Tr的参比样品稀释液，和稀释因子为T的待测样品稀释液；
测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，获得所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I；
根据获得的上述参数，计算单分子水平下量子产率Q如下：
2.如权利要求1所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述提供一量子产率为Qr的参比样品包括：
将所述待测样品溶于所述第二溶剂中，制备得到所述待测样品溶液/胶体，并测量所述待测样品溶液/胶体的吸收光谱和发射光谱，以查表择取所述参比样品，所述参比样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大吸收峰所覆盖的范围一致，或所述参比样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围与所述待测样品溶液/胶体的最大发射峰所覆盖的范围一致，所述参比样品溶液/胶体的量子产率为Qr。
3.如权利要求1所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述第一溶剂为水、乙醇、环己烷、氯仿或甲苯中的一种，所述第二溶剂为水、乙醇、环己烷、氯仿或甲苯中的一种。
4.如权利要求1所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述吸收光谱包括紫外可见吸收光谱和红外吸收光谱，所述参比样品溶液/胶体的吸光度Ar和所述待测样品溶液/胶体的吸光度A均小于0.1。
5.如权利要求1所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，获得所述参比样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数Nr和单个分子或粒子的荧光强度Ir，和所述待测样品稀释液的荧光图像的分子或粒子个数N和单个分子或粒子的荧光强度I包括：
滴加所述参比样品稀释液于第一玻片上，滴加所述待测样品稀释液于第二玻片上，所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的体积相等；
采用单分子荧光检测设备分别测试所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的荧光图像，所述单分子荧光检测设备的激发光波长、激光功率、曝光时间和发射滤光片范围均相等；
选取测量范围相同的所述参比样品稀释液和所述待测样品稀释液的所述荧光图像各10-20张；
采用模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子个数进行计数，并计算平均值，以得到所述参比样品稀释液的分子或粒子数Nr和所述待测样品稀释液的分子或粒子数N；
采用所述模拟软件分别对每张所述图像中的分子或粒子的荧光强度进行测量，并计算平均值，以获得所述参比样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度Ir和所述待测样品稀释液的单个分子或粒子的荧光强度I。
6.如权利要求5所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述单分子荧光检测设备包括全内反射荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜。
7.如权利要求5所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述模拟软件包括Matlab、IDL或Image J软件。
8.如权利要求1所述的量子产率的测试方法，其特征在于，所述参比样品包括染料罗丹明101，所述待测样品包括高氯酸恶嗪、605量子点、罗丹明6G或655量子点。
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