CN103224551A - 与提高种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子脂肪酸含量相关由序列2衍生的蛋白质。本发明所提供的蛋白可提高植物种子的脂肪酸含量，该蛋白具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于棉花的与提高植物种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
棉花是我国重要的经济作物与油料作物。我国常年植棉600万公顷，约产皮棉760万吨、棉籽1300万吨。作为棉花生产的主要副产品，棉籽富含油脂与蛋白（许红霞、袁杨伟、华袁王，等．我国油用棉子质量状况分析．中国棉花，2009，36（7）：2～3），剥壳后的棉仁脂肪含量30％～40％，可生产油脂。近年来，随着世界油脂资源和能源资源的日益紧迫，棉籽油等油料作物的生产越来越受到重视，扩大油料作物的种植面积已经成为解决我国油脂资源紧张的重要途径。本着“不与粮食作物争地”的原则，为增加单位种植面积内棉花种子的油脂含量，通过克隆调控植物脂肪酸合成的转录因子，应用遗传转化手段导入棉花受体植株中，从而提高植物的脂肪酸含量，进而增加棉籽仁中的油脂含量，提高油料作物的油脂产量，可以增加我国油脂自给供应，具有重要经济效益与社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种与提高植物种子脂肪酸含量相关的蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，来源于棉花（Gossypium hirsutum L.），名称为GhKAR，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子脂肪酸含量相关由序列2衍生的蛋白质。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
序列表中序列2由283个氨基酸组成。
为了便于所述GhKAR蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tagII | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明中，所述核酸分子是编码所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的第70-921位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述GhKAR蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述GhKAR蛋白的DNA分子。
序列1由1119个核苷酸组成，其中第70-921位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述核酸分子（基因）构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子。
更为具体的，所述重组表达载体可为在p2301M载体的多克隆位点处插入所述基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Xba I和Kpn I。
其中，对所述p2301M载体的结构描述如下：在pCAMBIA2301载体的多克隆位点EcoR I与HindⅢ之间反向插入序列表中序列3的第12-1177位核苷酸后得到的重组质粒。具体的，所述p2301M载体的构建方法如下：将序列表中序列3所示DNA片段用限制性内切酶EcoR I与HindⅢ进行双酶切，回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA2301载体（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号：Biovector008）骨架片段相连，得到的重组质粒即为p2301M载体。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
所述蛋白质，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）调控植物种子脂肪酸含量；
a2）选育种子脂肪酸含量高的植物品种。
在本发明的一个实施例中，所述调控植物种子脂肪酸含量具体为提高植物种子脂肪酸含量。
所述选育种子脂肪酸含量高的植物品种的方法，可包括将所述蛋白质表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育种子脂肪酸含量提高的转基因植物的方法。
该方法可包括将编码所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，种子脂肪酸含量提高。
所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述蛋白质的基因是所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的第70-921位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述GhKAR蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且所述GhKAR蛋白的DNA分子。
所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体（植物表达载体）导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。
所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物。所述双子叶植株如拟南芥或棉花。
在本发明的一个实施例中，所述植物具体为Col型拟南芥。在本发明的另一个实施例中，所述植物具体为棉花品种苏棉20号（原名：徐棉244）。
在本发明中，所述脂肪酸为如下中的至少一种：C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0和C20:1。
本发明所提供的蛋白可提高植物种子的脂肪酸含量，该蛋白具有良好的应用前景。
附图说明
图1为棉花RNA的电泳图谱。其中，A为经DNase I消化前的RNA；B为经DNaseI消化前的RNA。A和B中，泳道1-3表示3次重复；上面的一个条带均为28S RNA，下面的一个条带均为18S RNA。
图2为PCR扩增GhKAR基因的电泳图谱。其中，泳道1为PCR扩增GhKAR基因的结果；泳道M为1kb DNA ladder分子量标准。
图3为GhKAR基因在棉花幼胚不同时期的表达水平分析。
图4为油分在棉花不同时期幼胚中的积累情况分析。
图5为重组表达载体p2301M-KAR的酶切鉴定图。泳道1为重组表达载体p2301M-KAR的酶切（Xba I和Kpn I）鉴定结果；泳道M为D15000plus DNA分子量标准。
图6为转GhKAR基因T1代拟南芥植株的PCR鉴定结果。其中，泳道M为D2000plus DNA Ladder分子量标准；泳道1为阳性质粒对照；泳道2为未转基因的阴性对照植株；泳道3-10为8个阳性转GhKAR基因植株，依次为K1-2、K1-8、K2-1、K2-11、K3-1、K3-12、K3-21、K3-22。
图7为T3代纯合转GhKAR基因株系的生长表型观察结果。有两个株系K1-8和K2-1，每个株系都有三次重复，其中左边四株均为未转基因的野生型（Col型）拟南芥对照，右边四株均为转GhKAR基因拟南芥植株。
图8为T4代转GhKAR基因拟南芥株系种子脂肪酸含量分析结果。其中，Col表示未转基因的野生型拟南芥植株对照；K21-6、K21-17、K21-22分别表示3个T4代转GhKAR基因拟南芥株系。
图9为T1代转GhKAR基因棉花植株的PCR鉴定结果。其中，泳道M为D2000plusDNA Ladder分子量标准；泳道1为未转基因的阴性对照植株；泳道2为阳性质粒对照；泳道3-9为7个阳性的转GhKAR基因棉花植株，依次为L716-1、L716-2、L721-1、L721-2、L721-5、L721-6、L721-8。
图10为转GhKAR基因T2代棉花材料的粗油含量分析结果。其中，苏棉20号（原名：徐棉244）表示未转基因的受体阴性对照材料；L716-2、L721-1、L721-2分别表示3个T2代转GhKAR基因棉花材料。*表示在0.05水平上与苏棉20号（原名：徐棉244）差异显著，**表示在0.01水平上与苏棉20号（原名：徐棉244）差异显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用术语DPA（days post anthesis）表示开花后天数。
陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种“珂字201”（Coker201）：记载于“吕复兵，张献龙，刘金兰．陆地棉原生质体培养与植株再生．华北农学报，1999，14（1）：73-78”，公众可从中国农业大学获得。
棉花品种苏棉20号（原名：徐棉244）：记载于“李卫华，胡新燕，王阶祥，杨峰，张正敏，丁震乾.高产抗病棉花新品种苏棉20号.中国棉花，2003，30（1）：8”。公众可从中国农业大学获得。
实施例1、棉花KAR蛋白的编码基因GhKAR的获得
1、总RNA提取：选用陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种“珂字201”(吕复兵，张献龙，刘金兰．陆地棉原生质体培养与植株再生．华北农学报，1999，14（1）：73-78)为实验材料，取开花后20天的幼胚材料，速冻于液氮中，应用CTAB法（张玉刚，成建红，韩振海，许雪峰和李天忠，小金海棠总RNA提取方法比较及cDNA的LD-PCR扩增．生物技术通报，2005：50-53）提取RNA，按照如下方法消化去除总RNA中基因组DNA：
1)1.5ml离心管中依次加入以下试剂：
2)37℃温浴20-30min。
3)加入50μl的DEPC处理的H2O，100μl（等量）的酚：氯仿：异戊醇（体积比25：24：1），充分混匀。
4)4℃12000rpm离心20min。
5)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇（体积比24：1），充分混匀。
6)4℃14000rpm离心20min。
7)取上清，加10μl（1/10）量的3M NaOAc，2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，-20℃沉淀30-60min。
8)4℃12000rpm离心20min。
9)弃液体，加1ml4℃预冷的70%乙醇，重悬沉淀。
10)4℃8000-9000rpm离心3min。
11)弃液体，吸干残液。
12)超净工作台吹干沉淀。
13)适量DEPC水重悬总RNA。
14)琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，核酸蛋白浓度测定仪测定总RNA浓度。电泳图谱如图1所示，从图可知成功提取了总RNA。
2、利用Promaga的RT-PCR反应体系将步骤1提取的RNA反转录合成cDNA。
3、RT-PCR扩增：
利用拟南芥油脂代谢数据库中AtKAR的cDNA序列在NCBI的棉花EST数据库中进行比对，下载一致性高的EST，用CAP3 Sequence assembly进行拼接，用ORF finder软件预测ORF区，设计如下引物1和引物2：
引物1：5’-ATTCCCTCGTAGACTGT-3’（序列1的第3-19位）
引物2：5’- TGACGGTAGCAAACAAACT -3’（序列1的第1101-1119位的反向互补序列）
以步骤2获得的陆地棉（Gossypium hirsutum L.）品种“珂字201”的cDNA为模版，用引物1和引物2进行PCR扩增。反应体系：2.5μl10×PCR缓冲液（含MgCl2），各0.5μl引物1和引物2（10μM），4μl2.5mM dNTPs，1μlcDNA样品，0.25μlLA酶（TaKaRa），16.25μl双蒸水。反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃1min30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。
经上述PCR反应扩增出大小约为1119bp的目的条带（如图2所示）。将PCR产物回收后与pMD18-T载体（TaKaRa）连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆，送样测序。结果表明，该PCR产物中含有序列表中序列1的DNA片段，将该DNA片段所在基因命名为GhKAR基因。序列1的第70-921位核苷酸为GhKAR基因的编码区序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质，命名为GhKAR蛋白。
实施例2、棉花幼胚不同时期GhKAR基因的表达分析及油份积累情况分析
1、棉花幼胚不同时期GhKAR基因的表达分析
以高含油量棉花（Gossypium hirsutum L.）品种绵阳73-39和低含油量棉花（Gossypium hirsutum L.）品种10H1022不同时期幼胚（5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、30DPA、35DPA）为实验材料。提取其RNA，经Promaga的RT-PCR反应体系反转录合成cDNA，针对GhKAR基因设计引物GhK3F和GhK3R，以UBQ7为内参基因，设计引物UBQ7F和UBQ7R，采用荧光定量QRT-PCR分析GhKAR基因在不同含油量的棉花品种不同时期幼胚中的表达情况。
GhK3F：5’-CTGGCGTTAGAGGGAATGTGA-3’（序列1的第401-421位）；
GhK3R：5’-TCCAGGTAGTTGCCCACGATT-3’（序列1的第574-594位的反向互补序列）；
UBQ7F：5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’；
UBQ7R：5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’。
结果如图3所示显示，GhKAR基因的表达在不同含油量的两种棉花品种中的表达模式基本一致，只是GhKAR基因在低油棉花品种幼胚的各时期都略低于高油棉花品种。另外，在两种棉花品种中，GhKAR基因的表达水平均在发育初期保持稳定，但在20DPA时开始有大幅增加，这与油分将在这一时期开始积累一致（具体见下述步骤2）。因此，这一结果表明GhKAR基因随棉籽油分的积累表现一定的相关性，即在油分快速积累期高表达而在油分积累末期（棉籽含油量的范围25%—40%，参见“宋俊乔，孙培均，等．棉仁高油分材料筛选及其脂肪酸发育分析．棉花学报，2010，22（4）：291～296”）表达量下降。
2、棉花不同时期幼胚油份积累情况分析
以高含油量棉花（Gossypium hirsutum L.）品种绵阳73-39和低含油量棉花（Gossypium hirsutum L.）品种10H1022不同时期幼胚（5DPA、10DPA、15DPA、20DPA、30DPA、35DPA、40DPA））为实验材料，进行棉花油份积累情况分析。具体操作如下：
1)称取棉籽仁2.00g左右，记录数据A1；称量铝盒的重量，记录数据B，将棉籽仁放入对应的铝盒内，130℃烘箱内烘干2h；
2)将平底烧瓶用蒸馏水洗净，与棉籽仁同时烘干2h；
3)取出样品置于干燥器中冷却30min，称量棉籽仁与铝盒的合重（A2+B）及平底烧瓶的重量，记录数据C；
4)将棉籽仁在研钵中磨碎，装入滤纸斗内，封紧，放入提取筒；
5)向已恒重的平底烧瓶内倒入80-90mL的无水乙醚（乙醚不能与提取筒下端接触），把装有样品的提取筒安装在平底烧瓶上，将冷凝管安装在提取筒上，保证接口不漏气，打开冷凝水。提取装置于恒温水浴锅加热（水温65℃-72℃），提取2.5h；
6)取出装有样品的滤纸斗，连同铝盒置于103℃烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（原来的滤纸）中，提取2.5h；再取出装有样品的滤纸斗，置于烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（换新的滤纸）中提取1h；
7)回收乙醚，打开冷凝管下端开关，至无无水乙醚滴下，表明平底烧瓶中的乙醚已经回收完全，关闭冷凝水和水浴锅；
8)将平底烧瓶置于103℃烘箱内烘30min，密封干燥器中完全冷却约30min后称重，记录平底烧瓶与油份的合重，记为Co。
数据计算：棉籽仁油份含量：
结果如图4所示，棉花油分从开花后20天开始积累，至开花后30天已经积累了大部分油分，这期间高低油材料油份积累速率相差无几，开花后30到40天高油材料油分积累快于低油材料。这一结果与上述步骤1检测发现GhKAR基因自20DPA时起开始有大幅增加表现一定的相关性。
实施例3、转GhKAR基因拟南芥的获得及其功能验证
MS筛选培养基：在MS基本培养液（配方见如下表1）中加入终浓度为10g/L的蔗糖，终浓度为7.6g/L的琼脂粉，终浓度为50mg/L的卡那霉素，pH5.85-5.95。
渗透培养基：MS液体培养基，含有5%（5g/100ml）蔗糖，0.05%（体积百分含量）Silwet L-77。
表1MS基本培养液的溶质及浓度
| 大量元素MSI | 培养基中浓度（g·L-1） |
| NH4NO3 | 1.65 |
| KNO3 | 1.9 |
| KH2PO4 | 0.17 |
| MgSO4.7H2O | 0.37 |
| CaCl2 | 0.44 |
| 微量元素MSII | 培养基中浓度（mg·L-1） |
| FeSO4·7H2O | 27.8 |
| Na2EDTA | 37.3 |
| MnSO4·4H2O | 22.3 |
| ZnSO4·4H2O | 8.6 |
| H3BO3 | 6.2 |
| KI | 0.83 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| 有机成分 | 培养基中浓度（mg·L-1） |
| 甘氨酸 | 2.0 |
| 盐酸硫胺素 | 0.1 |
| 盐酸吡哆素 | 0.5 |
| 烟酸VB5 | 0.5 |
| 肌醇 | 100 |
MS固体培养基（1L）：MSI（大量）50mL，MSII（微量）5mL，Fe2+盐5mL，B5维生素5mL，2.7g植物凝胶，蔗糖20g，调节pH至5.85-5.95。
一、重组表达载体p2301M-KAR的构建
以实施例1获得的GhKAR基因的编码区序列（序列1）为模板，用如下引物3和引物4扩增得到含有Xba I和Kpn I酶切位点的GhKAR基因片段；用限制性内切酶XbaI和Kpn I双酶切对应的PCR产物，将酶切后的GhKAR基因片段与经过同样双酶切的p2301M载体的骨架片段连接。对连接产物进行转化、摇菌、挑取质粒，Xba I和Kpn I双酶切酶切鉴定。将经酶切鉴定表明含有大小约为1119bp的目的条带（图5）的重组质粒送样测序。将经测序表明含有序列表中序列1所示的GhKAR基因的重组质粒命名为重组表达载体p2301M-KAR。在重组表达载体p2301M-KAR中启动所述GhKAR基因转录的启动子为35S启动子。
引物3：5’-GCTCTAGAGCCGATTCCCTCGTAGACTGT-3’（下划线处为Xba I的识别位点，第11-29位为序列1的第1-19位）
引物4：5’-GGGGTACCCCTGACGGTAGCAAACAAACT-3’（下划线处为Kpn I的识别位点，第11-29位为序列1的第1101-1119位的反向互补序列）
其中，p2301M载体是按照如下方法制备而成的：将序列表中序列3所示DNA片段用限制性内切酶EcoR I与HindⅢ进行双酶切，回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA2301载体（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号：Biovector008）骨架片段相连，将得到的重组质粒命名为p2301M。对p2301M的结构描述如下：在pCAMBIA2301载体的多克隆位点EcoR I与HindⅢ之间反向插入序列表中序列3的第12-1177位核苷酸后得到的重组质粒。
二、转GhKAR基因拟南芥的获得
1、重组表达载体p2301M-KAR转化拟南芥
将上述步骤一获得的重组表达载体p2301M-KAR转化至农杆菌EHA105（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，产品货号Biovector008）。同时设置转化p2301M空载体的对照。具体操作如下：
a)冰上融化农杆菌EHA105感受态细胞，加入1-2μl上述步骤一获得的重组表达载体p2301M-KAR或p2301M空载体，冰浴45min；
b)液氮中冷冻1min，再37℃水浴3min；
c)加入1ml无抗生素的LB，28℃，200转/分，3h；
d)将转化后的菌液涂于附加抗生素Kan（50mg/L）的固体LB培养基上，置于28℃下培养2-3天；
e)挑单菌落，进行菌落PCR反应验证，采用的引物为上述引物3和引物4。
将经上述鉴定表明含有重组表达载体p2301M-KAR的农杆菌（扩增产物为大小约1119bp目的条带）命名为EHA105/p2301M-KAR；将转入p2301M空载体的农杆菌命名为EHA105/p2301M。
将农杆菌EHA105/p2301M-KAR和EHA105/p2301M分别转化至Col型拟南芥（从Tair网站注册购买，tair登录号：SpeciesVariant:90）中，至成熟收获种子（T1代）。具体操作如下：
a)菌液的准备：挑取农杆菌EHA105/p2301M-KAR或EHA105/p2301M于20mL含有100mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，28°C，220rpm小量震荡过夜培养，然后以体积比1：50的比例接入500ml含有100mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中大量摇培至菌液OD600在1.6-2.0左右时使用；
b)集菌：将500mL农杆菌菌液于室温5000rpm离心15分钟，弃上清液；
c)悬浮：用200mL渗透培养基悬浮沉淀至0.8-1.0左右；
d)转化：将农杆菌悬浮液倒在培养皿中，然后将拟南芥的地上部分浸没于农杆菌中10分钟。取出植株，用保鲜袋包好以保持湿度，横放在塑料盘中，置于温室中暗培养24小时。第二天去掉保鲜袋，继续暗培养24小时，然后让其于正常条件下生长。培养三至四周，待种子成熟后，收取种子（T1代），干燥器中存放2周。
2、转GhKAR基因拟南芥植株的鉴定
将上述步骤1收获的8个转GhKAR基因拟南芥植株的种子（分别记作K1-2、K1-8、K2-1、K2-11、K3-1、K3-12、K3-21、K3-22）和转入p2301M空载体的拟南芥植株分别经MS筛选培养基（添加终浓度为50mg/L的Kan）筛选获得抗性植株（T1代），移栽并种植后，取叶片样品提取基因组DNA作为模板，以引物KanF和KanR（对应于载体的Kan基因）进行PCR扩增，鉴定阳性植株。同时以未转基因的野生型拟南芥Col植株为阴性对照，以及以步骤一获得的重组表达载体p2301M-KAR为模板的阳性对照（质粒对照）。
Kan1F：5’-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’；
Kan1R：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’
结果如图6所示，转GhKAR基因拟南芥植株和转入p2301M空载体的拟南芥植株（T1代）与阳性质粒对照一样，均扩增出了大小约为500bp的目的条带；而作为阴性对照的未转基因拟南芥Col没有扩增条带。
另外，采用上述引物3和引物4对转GhKAR基因拟南芥植株和转入p2301M空载体的拟南芥植株（T1代）的基因组DNA分别进行PCR检测，结果显示：转GhKAR基因拟南芥植株扩增得到大小约1119bp的目的条带，而转入p2301M空载体的拟南芥植株未能得到目的条带。
三、转GhKAR基因拟南芥植株表型的鉴定及种子含油状况的检测
1、转GhKAR基因拟南芥植株表型的鉴定
将步骤二鉴定正确的T1代转GhKAR基因拟南芥植株自交后，对转基因植株进行卡那霉素抗性筛选鉴定。到T2代时鉴定转基因的分离比，抗感比符合3:1的株系作为后续研究材料，对这些材料进行经自交，获得T3代纯合GhKAR转基因植株及种子。
对两个T3代纯合转GhKAR基因株系拟南芥植株（K1-8和K2-1）的生长表型进行观察。同时以未转基因的野生型（Col型）拟南芥植株，以及转入p2301M空载体的拟南芥植株作为对照。实验重复三次。
结果如图7所示，与两个对照相比，转GhKAR基因拟南芥植株根长及叶片都没有受到影响。这一结果说明GhKAR基因的表达对受体材料苗期的生长没有明显影响。
2、转GhKAR基因拟南芥植株种子含油状况的检测
将步骤1获得的T3代纯合GhKAR转基因植株进行自交，获得T4代GhKAR转基因植株。以气相色谱法测定不同株系T4代转GhKAR基因拟南芥植株种子的脂肪酸含量。具体操作方法如下：
取T4代转GhKAR基因拟南芥植株种子（K21-6、K21-17、K21-22），每个株系为一个单独样品，每个样品称取0.01～0.02g籽粒放入15ml的细胞培养管中，用移液管加2ml无水甲醇∶氯乙酰（体积比为10∶1）的混合液，以及2.5ml浓度为1mg/ml的内标（十九烷酸甲酯，购自百灵威化学技术有限公司，货号：SFA-013N），振荡混匀，80℃水浴2小时。水浴结束后取出，冷却到室温，加2.5ml浓度为7％（7g/100ml）的K2CO3水溶液中和脂肪酸。将细胞培养管中混合溶液漩涡旋均匀后倒入10ml的离心管。2700转/分钟的状态下离心2分钟。吸取上清于样品瓶中，置4℃冰箱待于气相色谱上机。
气相色谱条件如下：
交联石英毛细管柱，PEG-20M为固定相，氮气为载气，恒流流速1.2ml/min，柱温200℃，检测温度350℃，FID检测器。
脂肪酸各组分含量和总含量的计算：
脂肪酸经过气相色谱测定之后，使用HP7890气相色谱仪自带的HP-chemstation软件进行自动积分后，分别用如下公式计算脂肪酸各组分的含量(FA)以及总含量(OIL)。
其中，PAx为脂肪酸单成分的峰面积，PASTD为内标的峰面积，CSTD为内标的浓度，VSTD为所加内标的体积，ms为样品的重量。利用以上公式计算所得结果中的%表示质量百分含量。
同时设置未转基因的野生型拟南芥植株，以及转入p2301M空载体的拟南芥植株作为对照。
检测结果如图8和表2所示，与未转基因的野生型拟南芥植株（Col）相比，转GhKAR基因拟南芥株系的总脂肪酸含量显著提高，具体表现为如下几种脂肪酸含量的提高：C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0和C20:1。另外，转入p2301M空载体的拟南芥植株种子的脂肪酸含量与未转基因的野生型拟南芥植株（Col）相比，无统计学上的差异。
表2T4代转GhKAR基因拟南芥植株种子脂肪酸含量检测结果
注：Col表示未转基因的野生型拟南芥植株对照；K21-6、K21-17、K21-22分别表示3个T4代转GhKAR基因拟南芥株系。
实施例4、转GhKAR基因棉花的获得及其功能验证
一、转GhKAR基因棉花的获得
1、重组表达载体p2301M-KAR转化棉花
将实施例3步骤一中构建的重组表达载体p2301M-KAR用花粉管通道法（Zhou G Y,etal.Introduction of exogenous DNA into cotton embryos.Methods in Enzymology.1983,101:433～488）转化受体棉花品种苏棉20号（原名：徐棉244），获得T1代植株。同时设置转化p2301M空载体的对照。
2、转GhKAR基因棉花植株的鉴定
将上述步骤1收获的T1代转GhKAR基因棉花或转入p2301M空载体的棉花在大田种植，长出真叶时用5g/L的卡那霉素涂抹，将表现为卡那霉素抗性的鉴定为阳性，作上标记，并取其叶片样品提取DNA作为模板，以引物KanF和KanR（对应于载体的Kan基因，序列同上）进行PCR扩增，鉴定阳性植株。同时以未转基因的野生型苏棉20号（原名：徐棉244）植株为阴性对照，以及以步骤一获得的重组表达载体p2301M-KAR为模板的阳性对照（质粒对照）。
结果如图9所示，T1代转GhKAR基因棉花植株和转入p2301M空载体的棉花植株，与阳性质粒对照一样，均扩增出了大小约为500bp的目的条带；而作为阴性对照的未转基因的野生型苏棉20号（原名：徐棉244）没有扩增条带。
二、转GhKAR基因棉花种子含油状况的检测
用索氏提取器提取T2代转GhKAR基因棉花（L716-2、L721-1、L721-2）的种子脂肪酸，以未转基因的受体材料苏棉20号（原名：徐棉244），以及转入p2301M空载体的棉花植株作为对照。具体操作如下：
1)称取棉籽仁2.00g左右，记录数据A1；称量铝盒的重量，记录数据B，将棉籽仁放入对应的铝盒内，130℃烘箱内烘干2h；
2)将平底烧瓶用蒸馏水洗净，与棉籽仁同时烘干2h；
3)取出样品置于干燥器中冷却30min，称量棉籽仁与铝盒的合重（A2+B）及平底烧瓶的重量，记录数据C；
4)将棉籽仁在研钵中磨碎，装入滤纸斗内，封紧，放入提取筒；
5)向已恒重的平底烧瓶内倒入80-90mL的无水乙醚（乙醚不能与提取筒下端接触），把装有样品的提取筒安装在平底烧瓶上，将冷凝管安装在提取筒上，保证接口不漏气，打开冷凝水。提取装置于恒温水浴锅加热（水温65℃-72℃），提取2.5h；
6)取出装有样品的滤纸斗，连同铝盒置于103℃烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（原来的滤纸）中，提取2.5h；再取出装有样品的滤纸斗，置于烘箱内烘干7-8min，立即研磨装入滤纸斗（换新的滤纸）中提取1h；
7)回收乙醚，打开冷凝管下端开关，至无无水乙醚滴下，表明平底烧瓶中的乙醚已经回收完全，关闭冷凝水和水浴锅；
8)将平底烧瓶置于103℃烘箱内烘30min，密封干燥器中完全冷却约30min后称重，记录平底烧瓶与油份的合重，记为Co。
数据计算：棉籽仁油份含量：
利用以上公式计算所得结果中的%表示质量百分含量。
检测结果如图10和表3所示，与未转基因的的受体对照材料相比，转GhKAR基因的棉籽粗含油量显著提高。另外，转入p2301M空载体的棉花植株种子的含油量与未转基因的棉花植株相比，无统计学上的差异。
表3转GhKAR基因棉花T2代种子粗含油量检测结果
注：苏棉20号表示未转基因的受体阴性对照材料；L716-2、L721-1、L721-2分别表示3个T2代转GhKAR基因棉花材料。
Claims (10)
1.蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物种子脂肪酸含量相关由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列1的第70-921bp位核苷酸所示的DNA分子；
2）序列表中序列1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。
7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用：
a1）调控植物种子脂肪酸含量；
a2）选育种子脂肪酸含量高的植物品种。
8.一种培育种子脂肪酸含量提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，种子脂肪酸含量提高。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述脂肪酸为如下中的至少一种：C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0和C20:1。
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