CN103221524A - 用于浓缩omega-3脂肪酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体涉及用银盐水溶液(例如AgNO3水溶液)从脂肪酸油混合物中浓缩omega-3脂肪酸的方法。

Description

用于浓缩omega-3脂肪酸的方法
本申请要求2010年9月24日提交的美国临时申请第61/386,096号的优先权，将其全文引入本文作为参考。
本发明总体涉及用银盐水溶液(例如AgNO3水溶液)从脂肪酸油混合物中浓缩多不饱和脂肪酸(例如omega-3脂肪酸)的方法。
omega-3脂肪酸可用于多种应用，包括药物和/或营养补充产品。例如，omega-3脂肪酸可调节血浆脂质水平、心血管和免疫功能、胰岛素作用、神经元发育和视觉功能。omega-3脂肪酸可对心血管疾病(例如高血压和高甘油三酯血症)的风险因素和对凝血因子VII磷脂络合物活性产生有益的效果。omega-3脂肪酸还可以降低血清甘油三酯，增加血清HDL胆固醇，降低收缩期和舒张期血压和/或脉搏率，并且可降低凝血因子VII-磷脂络合物的活性。另外，omega-3脂肪酸通常可良好地耐受，且不引起严重的副作用。
海产品油(通常也指鱼油)是omega-3脂肪酸(包括二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA))的来源之一，已发现其可调节脂类代谢。植物油、微生物油和藻类油也是omega-3脂肪酸的来源。已研发了多种omega-3脂肪酸的制剂。例如，omega-3脂肪酸油混合物的一种形式是从含有DHA和EPA的鱼油中得到的主要omega-3、长链、多不饱和脂肪酸的浓缩物，例如以商标
Figure BDA00003221493100011
/LovazaTM/
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/
Figure BDA00003221493100013
销售的商品。参见，例如，美国专利第5,502,077号、第5,656,667号和第5,698,594号。特别地，每1000mg的LovazaTM胶囊含有至少90%的omega-3脂肪酸乙酯(84%的EPA/DHA)；约465mg EPA乙酯和约375mg DHA乙酯。
其他的omega-3脂肪酸可提供活性。例如，Kaur等人(Prog.Lipid Res.(2011)vol.50(1)，pp.28-34)认为n-3DPA具有某些生物效应。有证据表明，n-3DPA具有比EPA大10倍的内皮细胞迁移能力，这可能在伤口愈合过程中是很重要的。此外，报道了n-3DPA在抑制血小板聚集方面比EPA和DHA更有效。另外，n-3DPA可在减弱与年龄相关的空间学习(spatial learning)和长时程增强(long-term potentiation)的下降方面发挥作用。然而，由于纯化合物的供应量有限，还未对n-3DPA进行广泛的研究。
omega-3脂肪酸的许多来源也是omega-6脂肪酸的来源。然而，在一些生物学过程中，omega-3和omega-6脂肪酸可表达相反的活性，因而低浓度的omega-6脂肪酸(即高n-3/n-6比例)是期望的。符合欧洲药典专论1250的市售产品通常具有范围为24-40的n-3/n-6比例。
Breivik(Long-Chain Omega-3Specialty Oils，The Oily Press，PJ Barnes&Associates，Bridgwater UK，pp.111-140，2007)给出了用于制备omega-3酸浓缩物的方法的综述。由于海产品油的脂肪酸组成很复杂，难以仅用一种浓缩技术制备高度浓缩的omega-3脂肪酸组分。通常情况下，使用技术的组合，最经常使用结合了根据不饱和度分离(例如，酶分离和/或尿素分馏)和根据碳链长度分离(例如，分子/短程蒸馏和/或超临界流体提取)的技术。与起始油的量相比，常规技术通常具有获得含低收率omega-3脂肪酸的浓缩物的缺点。这在结合低收率的技术(如尿素包合和短程蒸馏)时可能尤为突出。
此外，分离方法(如短程蒸馏和主要基于链长分离脂肪酸酯的其他方法)通常无法分离具有相同碳原子数的omega-3和omega-6脂肪酸，例如C20:4n-3和C20:4n-6，或C22:5n-3和C22:5n-6。例如，尿素分馏可导致omega-6脂肪酸比同系物omega-3脂肪酸具有更高的浓缩因子，因为脂肪酸衍生物与尿素形成固体络合物的倾向随着脂肪酸酯的第一双键与羰基的距离(通常被称为Δ值)而增大。如果omega-6脂肪酸的Δ值为Δ’，则相应的omega-3脂肪酸的Δ值为(Δ’+3)，从而导致与尿素形成络合物的程度更高。这种倾向对于omega-3脂肪酸的高度浓缩物尤其显著，其中使用了相对量很高的尿素。
已进行了使用银盐从混合物中分离多不饱和脂肪酸的研究。参见，例如，Quinn等人(pp.133-169，Perry等人，Progress in separetion andPurification4，Wiley-Interscience，New York，1971)；Peers等人(J.FoodTechnology(1986)vol.21pp.463-469)；Suzuki等人(Bioseparetion(1993)vol.3，pp.197-204)；Teramoto等人(Ind.Eng.Chem.Res.(1994)，vol.33pp.341-345)；Teramoto等人(J.Membrane Sci.，(1994)vol.91，pp.209-213)；Kubota等人(Sep.Sci.Technol.(1997)，vol.32，pp.1529-1541)；Chen等人(J.JiangsuUniversity of Science and Technology(Natural Science)(2000)，vol.21，pp.18-22)；Tao等人(Chinese J.Marine Drugs，(2004)No.3，pp.28-30)；Huong(J.Chemistry(2007)，vol.45，pp.757-762)；Li等人(Sep.Sci.Technol.(2008)vol.43，pp.2072-2089)；EP0454430B1；EP0576191A2；Seike等人(Journalof Chemical Engineering of Japan(2007)，Vol.40，pp1076-1084)；和Kamio等人(Ind.Eng.Chem.Res.，(2011)vol.50(11)，pp.6915-24)。然而，先前已知的方法未提供浓缩omega-3脂肪酸的足够选择性和/或有效的方法。
因此，在本领域中仍需要从脂肪酸油混合物中浓缩omega-3脂肪酸的更有效的方法。
应理解，前面的总体描述和下面的详细描述仅仅是示例性和说明性的且对所要求保护的本发明不具限制性。
本发明总体涉及从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括：(a)混合脂肪酸油混合物和银盐(例如AgNO3或AgBF4)水溶液以形成水相和有机相，其中在水相中，所述银盐水溶液与至少一种omega-3脂肪酸形成络合物；(b)分离有机相和水相；(c)用置换液提取水相，或将水相的温度升高到至少30°C，或用置换液提取与升高温度相结合，从而形成至少一种提取物；(d)合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界CO2提取水相相结合，以解离络合物，其中水相包含所述银盐和至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液；和(e)从包含所述银盐的水相中分离所述至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液。
附图说明
图1为通过将水相加热至70°C所回收的脂肪酸浓缩物的气相色谱，如实施例1所述。
图2为在除去图1所示的浓缩物后通过将水相在水中稀释所获得的脂肪酸浓缩物的气相色谱，如实施例1所述。
图3为通过用己烷作为置换溶剂提取所获得的成分的气相色谱，如实施例2A表4A所述。
图4为浓缩物4的气相色谱，如实施例3表5所述。
图5为表示具体选定的脂肪酯的乙酯的相对浓度的图表，如实施例2B表4E所述。
详细说明
下文将更详细地描述本发明的具体方面。本申请中使用的和本文阐明的术语和定义旨在表示在本发明之内的含义。在本文和上文中参考的专利和科学文献并入本文作为参考。本文提供的术语和定义若与引入参考中的术语和/或定义相冲突，以本文为准。
单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有指出。
术语“约(approximately)”和“约(about)”表示与提到的数字或数值近似相同。本文所用的术语“约”通常应理解为包含具体数量、频率或数值的±30%范围内。
术语“脂肪酸”包括例如含有至少一个羧酸基团的短链和长链的饱和及不饱和的(例如，单不饱和的和多不饱和的)烃。
术语“omega-3脂肪酸”包括天然的和合成的omega-3脂肪酸，以及药学上可接受的酯、游离酸、甘油三酯、衍生物、缀合物(参见例如Zaloga等人，美国公开第2004/0254357号，以及Horrobin等人，美国专利第6,245,811号，各自并入本文作为参考)、前体、盐及其混合物。omega-3脂肪酸油的实例包括但不限于：omega-3多不饱和脂肪酸，例如α-亚油酸(ALA，18:3n-3)、十八碳四烯酸(即stearidonic acid，STA，18:4n-3)、二十碳三烯酸(ETE，20:3n-3)、二十碳四烯酸(ETA，20:4n-3)、二十碳五烯酸(EPA，20:5n-3)、二十一碳五烯酸(HPA，21:5n-3)、二十二碳五烯酸(DPA，clupanodonic acid，22:5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)；omega-3脂肪酸与甘油的酯，例如单-、二-或三-甘油酯；以及omega-3脂肪酸与伯醇、仲醇和/或叔醇的酯，例如脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯。
术语“omega-6脂肪酸”包括天然的和合成的omega-6脂肪酸，以及药学上可接受的酯、游离酸、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐及其混合物。omega-6脂肪酸油的实例包括但不限于：omega-6多不饱和的长链脂肪酸，例如亚油酸(18:2n-6)、γ-亚油酸(18:3n-6)、二十碳二烯酸(20:2n-6)、二高-γ-亚油酸(20:3n-6)、花生四烯酸(20:4n-6)、二十二碳二烯酸(22:2n-6)、肾上腺酸(22:4n-6)和二十二碳五烯酸(即osbond acid，22:5n-6)；以及酯、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐和/或其混合物。
本发明公开的多不饱和脂肪酸(例如，omega-3脂肪酸和/或omega-6脂肪酸)、酯、甘油三酯、衍生物、缀合物、前体、盐和/或其混合物可以以它们的浓缩和/或纯化形式和/或作为油(例如海产品油(例如，鱼油)、藻类油、微生物油和/或植物油)的组分使用。
脂肪酸油混合物
根据本发明公开的脂肪酸油混合物可来自动物油和/或非动物油。在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酸油混合物来自至少一种选自海产品油、单细胞油、藻类油、植物油、微生物油及其组合的油。海产品油包括，例如，鱼油、磷虾油以及来自鱼的脂类组分。植物油包括，例如，亚麻籽油、菜籽油、芥子油和大豆油。单细胞/微生物油包括，例如，Martek、Nutrinova和Nagase&Co的产品。单细胞油通常被定义为来自微生物细胞的油且其可供人类食用。参见，例如，Wynn and Ratledge，“Microbial oils：production，processing and markets for specialty long-chain omega-3polyunsatutrated fattyacids”，pp.43-76，Breivik(Ed.)，Long-Chain Omega-3Specialty Oils，The OilyPress，P.J.Barnes&Associates，Bridgewater UK，2007中。
其他油包括植物油甘油三酯，通常被称为长链甘油三酯，例如蓖麻油、玉米油、棉子油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化大豆油和氢化植物油；中链甘油三酯(例如来自椰子油或棕榈籽油的那些)，甘油一酯，甘油二酯和甘油三酯。除混合的甘油酯外，有其他油例如丙二醇酯，比如丙二醇的辛酸/癸酸混合二酯，饱和的椰子油与棕榈仁油衍生的辛酸、亚油酸、琥珀酸的酯，或癸脂肪酸的丙二醇酯。
脂肪酸油混合物中的脂肪酸可被酯化，例如形成烷基酯，例如乙酯。在一些实施方式中，所述脂肪酸为甘油酯形式，例如选自单-、二-和三甘油酯。在其他实施方式中，所述脂肪酸为游离酸形式。
脂肪酸油混合物中的不饱和脂肪酸可以是顺式和/或反式构型。全顺式构型的omega-3脂肪酸的实例包括但不限于：(全-Z)-9,12,15-十八碳三烯酸(ALA)、(全-Z)-6,9,12,15-十八碳四烯酸(STA)、(全-Z)-11,14,17-二十碳三烯酸(ETE)、(全-Z)-8,11,14,17-二十碳四烯酸(ETA)、(全-Z)-,7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA)、(全-Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z)-6,9,12,15,18-二十一碳五烯酸(HPA)。全顺式构型的omega-6脂肪酸的实例包括但不限于：(全-Z)-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸(osbond acid)、(全-Z)-9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)、(全-Z)-5,8,11,14-二十碳四烯酸(AA)和(全-Z)-6,9,12-十八碳三烯酸(GLA)。顺式构型的单不饱和脂肪酸的实例包括但不限于：(Z)-9-十六碳烯酸(棕榈油酸)、(Z)-9-十八碳烯酸(油酸)、(Z)-11-十八碳烯酸(异油酸)、(Z)-9-二十碳烯酸(鳕油酸)、(Z)-11-二十碳烯酸(二十碳-11-烯酸)、(Z)-11-eicoesenoic acid、(Z)-11-二十二碳烯酸(鲸蜡烯酸)、Z-13-二十二碳烯酸(芥酸)和(R-(Z))-12-羟基-9-十八碳烯酸(蓖麻油酸)。
根据本发明公开的脂肪酸油混合物的实例包括但不限于欧洲药典Omega-3酸乙酯60、欧洲药典Omega-3酸专论中的鱼油富集物(Fish OilRich)、美国药典鱼油专论、欧洲药典Omega-3酸甘油三酯、欧洲药典Omega-3酸乙酯90和美国药典Omega-3酸乙酯专论中规定的脂肪酸。
含有不同脂肪酸的脂肪酸油混合物的市售实例包括但不限于：IncromegaTMomega-3海产品油浓缩物，例如IncromegaTMTG7010SR、IncromegaTME7010SR、IncromegaTMTG6015、IncromegaTMEPA500TG SR、IncromegaTME400200SR、IncromegaTME4010、IncromegaTMDHA700TG SR、IncromegaTMDHA700E SR、IncromegaTMDHA500TG SR、IncromegaTMTG3322SR、IncromegaTME3322SR、IncromegaTMTG3322、IncromegaTME3322、IncromegaTMTrio TG/EE(Croda International PLC，Yorkshire，England)；EPAX6000FA、EPAX5000TG、EPAX4510TG、EPAX2050TG、EPAX5500EE,EPAX5500TG、EPAX5000EE、EPAX5000TG、EPAX6000EE、EPAX6000TG、EPAX6500EE、EPAX6500TG、EPAX1050TG、EPAX2050TG、EPAX6015TG/EE、EPAX4020TG和EPAX4020EE(EPAX为Trygg Pharma AS的全资子公司；
Figure BDA00003221493100061
/LovazaTM/最终药物产品，K85EE、AGP103、K30EE、K50EE和K70EE(Pronova BioPharma Norge AS)；
Figure BDA00003221493100063
EPA/DHA鱼油浓缩物(Ocean Nutrition Canada)；DHA FNO“功能性营养油(Functional Nutritional Oil)”和DHA CL“清液(Clear Liquid)”(Lonza)；SuperbaTM磷虾油(Aker Biomarine)；Martek生产的含DHA的omega-3产品；Neptune磷虾油(Neptune)；
Figure BDA00003221493100071
生产的鱼肝油产品和抗反流(anti-reflux)鱼油浓缩物(TG)；Lysi omega-3鱼油；Seven Seas
Figure BDA00003221493100072
鱼肝油混合物(Seven Seas)；Fri Flyt omega-3
Figure BDA00003221493100073
以及Epadel(Mochida)。这些市售的具体实例提供了多种omega-3脂肪酸、组合以及酯基转移方法或制备方法得到的其他成分，其中所述方法或制备方法是为了从多种来源(例如海产品、藻类、微生物(单细胞)和/或植物来源)得到omega-3脂肪酸。
在本发明公开的一些实施方式中，所述脂肪酸油混合物含有至少一种omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。在至少一个实施方式中，所述脂肪酸油混合物含有EPA和DHA。，所述脂肪酸油混合物可进一步包含至少一种其他脂肪酸，例如EPA和DHA以外的多不饱和脂肪酸(PUFA)。这种PUFA的实例包括但不限于：其他omega-3脂肪酸，例如EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸，和omega-6脂肪酸。
在本发明的一些实施方式中，所述方法制备C22:5n-3(n-3DPA)的浓缩物。
用于浓缩omega-3脂肪酸的方法
本发明公开的一些实施方式涉及从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法。
根据一个实施方式，所述方法包括混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液，例如硝酸银(AgNO3)溶液。虽然本讨论集中在AgNO3上，但本领域技术人员将认识到，可使用其他合适的银盐，例如四氟硼酸银(AgBF4)。银离子可以与脂肪酸油混合物中的多不饱和脂肪酸形成络合物，所述多不饱和脂肪酸如omega-3脂肪酸，例如EPA和/或DHA。由此形成的银络合物可存在于水相中，而脂肪酸油混合物中的其他脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、短链脂肪酸、单不饱和脂肪酸和/或其他不饱和脂肪酸，如双键比所述复杂的PUFA更少的脂肪酸)可作为不溶的脂肪酸存在于有机相中。
所述银盐溶液(例如AgNO3溶液)的浓度范围可以为约10%重量至约90%重量，例如约60%重量至约80%重量。在一些实施方式中，例如，AgNO3水溶液的浓度为约60%重量、约70%重量、约75%重量或约80%重量。在一些实施方式中，脂肪酸油混合物与AgNO3的重量比为至少0.4。例如，在一些实施方式中，脂肪酸油混合物与AgNO3的重量比范围为约0.4至约1.6。所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液可在室温(例如，约20°C至约25°C)，或通过冷却在低于室温的温度，例如约-25°C至约20°C，或在高于室温的温度，例如约25°C至约90°C混合。
在与脂肪酸油混合物混合之前和/或之后，至少一种有机溶剂(例如极性有机溶剂)可以加入到AgNO3溶液中。合适的有机溶剂的实例包括但不限于醇，例如乙醇和甲醇。极性有机溶剂的加入可例如提高脂肪酸从脂肪酸油混合物到AgNO3水溶液的溶解度。
所述脂肪酸油混合物和AgNO3溶液通常混合大约数分钟至几小时，例如，约15分钟至约2小时，从而得到有机相和水相，例如油-水乳液。本领域技术人员将认识到，所需的混合时间将取决于所涉及的体积和混合效率。例如，在通过微型反应器制备的节涌流(slug flow)中，当用硝酸银水溶液提取DHA乙酯和EPA乙酯时，可能需要小于20秒即达到平衡(Seike等人(2007)Journal of Chemical Engineering of Japan，Vol.40，pp1076-1084)。对于汇聚在一起使混合效率较低的大体积，脂肪酸与银离子水溶液的转移和络合将花费基本上更长的时间以达到平衡，例如2小时或更长。
沉降后，所述有机相和水相可根据本领域中已知的方法进行分离。例如，相分离可通过将所述混合物放置足够长的时间以获得两个基本透明的相、通过离心分离、通过膜技术或通过其他合适的方法进行。
除去有机相后，水相可用置换液(例如有机溶剂)提取，从而形成至少一种提取物。例如，所述置换液可通过优先除去某种脂肪酸(如EPA和DHA以外的omega-6脂肪酸和/或omega-3脂肪酸)，提供升高的选择性。不受理论所束缚，所述置换液可通过影响脂肪酸在水相中的相对溶解度和/或通过与银络合物相互作用来提供选择性。在一些情况下，可选择置换液使其不与银离子形成络合物，或与比待浓缩的omega-3脂肪酸相比，使其与银离子形成弱的络合物。合适的置换液的实例包括但不限于：烷烃、烯烃、环烷烃、环烯烃、二烯烃、芳烃(aromates)和卤代溶剂。可以非限制性地提及具体实例，例如二氯甲烷和含有一个或多个氯原子的其他溶剂和/或一种或更多种其他的卤化物、己烷、己烯、庚烷、庚烯、环己烷、环己烯、1,7-辛二烯、1,5-环辛二烯，以及包含一个或多个双键的其他烯烃，例如包含一个、两个或甚至三个双键的烯烃，以及含有氧和氮的溶剂，例如酮和酰胺/胺。所述水相可提取超过一次，即，至少两次连续提取。以溶于银离子水相的脂肪酸油混合物的重量计，每次提取中置换液的量的范围可以为约0.1至约5倍。
可以根据在浓缩一种或多种具体omega-3脂肪酸时所需的选择性使用不同的置换液和/或置换液的组合。
在分离所述水相和有机相前，可将其加热。在这种情况下，确定适当的温度时可考虑所述有机相的沸点。一般来说，可将所述水相/有机相混合物加热至约30°C至约90°C的温度范围。
在一些实施方式中，除去所述有机相后加热所述水相，从而形成至少一种提取物。例如，所述水相可加热至至少30°C的温度，例如约30°C至约90°C的温度范围。在这种情况下，加热可导致omega-6脂肪酸和/或具体omega-3脂肪酸(例如EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸)浓缩的脂肪酸油混合物从所述水相中释放。加热应在无氧和足够温和的条件下谨慎完成以避免多不饱和脂肪酸发生氧化、异构化和/或降解。
进一步根据所述方法，水相可用水稀释以离解AgNO3络合物，从而游离脂肪酸浓缩物，即，至少一种omega-3脂肪酸浓缩的脂肪酸油混合物。在一些实施方式中，稀释所述水相超过一次，即，至少两次连续稀释。稀释时使用水的量的范围可以为所使用的固体硝酸银(AgNO3(s))的重量的约1至约20倍。确切量取决于多种因素，包括银离子浓度和脂肪酸油混合物的性质。所述脂肪酸浓缩物随后可以从水相中分离以形成至少一种溶液。在一些实施方式中，可回收银离子用于在随后方法中再次使用。例如，可通过再生(包括例如通过电解再生)、过滤、离心分离和/或纯化回收银离子用于再次使用。
进一步根据所述方法，水相可在超临界压力下用二氧化碳(CO2)提取以离解Ag+络合物，从而游离全部或部分脂肪酸浓缩物。二氧化碳可含有至少一种极性调节剂，例如水或醇，例如乙醇。用二氧化碳提取的益处可包括无需大量的水来裂解络合物。CO2易于通过释放压力从乙酯中除去。CO2无毒并且可以为保护活性Ag+不生成非活性Ag2O提供所需的惰性气氛。
根据本发明的方法可浓缩至少一种omega-3脂肪酸，同时降低至少一种omega-6脂肪酸在脂肪酸油混合物中的浓度。例如，相对于脂肪酸油混合物，所述方法可提高脂肪酸浓缩物中omega-3与omega-6脂肪酸的比例。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物混合物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸(n-3/n-6)的比例大于约40，例如大于约80、大于约100、大于约150或大于约200。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度可小于约3%重量，例如小于约2%重量，或小于约1%重量。
本发明公开的方法还可以浓缩一种或多种omega-3脂肪酸，同时降低其他omega-3脂肪酸的浓度。在一些实施方式中，例如，所述方法浓缩EPA和DHA，同时降低EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的浓度。在一些实施方式中，脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于3%重量，例如小于2.5%重量，例如小于0.5%重量。
本发明公开的方法进一步提供通过浓缩相对于其他的omega-3脂肪酸的更多或更少的一种omega-3脂肪酸，来调整脂肪酸油混合物中的EPA/DHA比例。例如，所述EPA/DHA比例可通过改变温度、置换液和/或水稀释比例，和用含有或不含有极性调节剂(例如水或醇，例如乙醇)的CO2提取进行调整。在一些实施方式中，至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液中的EPA/DHA比例范围为约0.1至约10，以重量计。
所述脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液可使用至少一种纯化方法进行纯化。所述纯化方法可除去例如残留的银化合物、残留的置换液、短链脂肪酸(例如，脂肪酸16:4n-1)、通过与银离子络合而富集的低分子量化合物、环境污染物、胆固醇和/或维生素。这种纯化方法包括但不限于：短程蒸馏、分子蒸馏、超临界流体提取、酶分离方法、碘内酯化分馏(iodolactonization fractionation)和制备色谱法。
可重复本发明公开的方法以进一步浓缩至少一种omega-3脂肪酸和/或浓缩一种或多种其他的omega-3脂肪酸。所述方法还可以用于浓缩至少一种omega-6脂肪酸。例如，所述脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液可包含在一种或多种上述的随后方法中的脂肪酸油混合物。从根据本发明公开的一种或多种浓缩方法获得的脂肪酸浓缩物可包含至少80%的至少一种omega-3脂肪酸，例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一种omega-3脂肪酸。
从本申请公开的方法获得的脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液还可以通过至少一种常规分馏方法例如短程蒸馏、分子蒸馏、碘内酯化分馏、酶分馏方法、提取和/或色谱法进行处理。由此获得的脂肪酸浓缩物可包含至少80%的至少一种omega-3脂肪酸，例如至少90%、至少95%或甚至至少98%的至少一种omega-3脂肪酸。在一个实施方式中，例如，至少一种分馏方法制备包含至少90%(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)，例如至少95%DHA，或例如至少98%DHA的脂肪酸浓缩物。在另一个实施方式中，至少一种分馏方法制备包含至少80%(全-Z)-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA)，例如至少90%DPA，例如至少95%DPA，或例如至少98%DPA的脂肪酸浓缩物。本领域技术人员将认识到，通过至少一种常规分馏方法处理根据本发明公开获得的浓缩物能够制备符合例如欧洲药典专论1250，Omega-3-酸乙酯90专论和/或美国药典Omega-3-酸乙酯专论的组合物。
本发明公开的方法可减少至少一种环境污染物在脂肪酸油混合物中的浓度，使得所述脂肪酸油浓缩物、至少一种提取物和/或至少一种溶液包含比脂肪酸油混合物浓度更低的至少一种环境污染物。环境污染物包括但不限于：多氯联苯(PCB)化合物、多氯二苯并二
Figure BDA00003221493100111
(PCDD)化合物、多氯二苯并呋喃(PCDF)化合物、溴化阻燃剂如多溴二苯醚(PBDE)、四溴双酚A(TBBP-A)和六溴环十二烷(HBCD)，以及杀虫剂如DDT(2,2双-(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷)和DDT的代谢产物。本发明公开的方法还可降低总胆固醇(即，游离和/或结合的胆固醇)在脂肪酸油混合物中的浓度，使得脂肪酸浓缩物包含比脂肪酸油混合物浓度更低的总胆固醇。在本发明的一些实施方式中，在与AgNO3水溶液结合前，所述脂肪酸油混合物在至少一种剥离(stripping)方法步骤(例如蒸馏)中被剥离，其中所述剥离方法步骤降低至少一种环境污染物和/或总胆固醇在脂肪酸油混合物中的量。
下面的实施例旨在举例说明本发明，而且本质上并非是限制性的。应理解，本领域技术人员会理解与本文提供的公开相一致的其他实施方式。下表中给出的组成值是基于气相色谱(GC)面积百分比。本领域技术人员将理解，GC面积百分比不同于GC质量百分比，例如，它们可高于相应的GC质量百分比。在欧洲药典专论2.4.29“Composition of Fatty Acids in OilsRich in Omega-3-Acids”中提供了分析GC质量百分比的步骤。
实施例
实施例1：温度
相分离前。将K50EE用70%重量AgNO3溶液(K50EE:AgNO3=3:5)混合约1.5小时并升至所需温度(参见表1，即，8°C、21°C、50°C、60°C或70°C)。将油/水混合物静置约2小时分成水相和有机相，并除去有机相。水相用水稀释(水:AgNO3(s)=约7.5:1，以重量计)，导致有机物质(即脂肪酸浓缩物)游离。收集浓缩物并通过GC分析(GC面积%)测定其组成，如表1所示。结果显示，较高的温度降低了n-6脂肪酸和/或具体的n-3脂肪酸(例如，EPA和DHA以外的长链(LC)脂肪酸)的相对浓度。
表1：脂肪酸浓缩物的组成；在各种温度混合K50EE:AgNO3=3:5(GC面积%)。
脂肪酸乙酯 K50EE 8°C 21°C 50°C(I) 50°C(II) 60°C 70°C
18:2n-6 1.14 0.27 0.26 0.08 ** 0.03 0.05
18:3n-3 0.62 0.26 0.21 0.11 0.07 0.07 0.05
18:4n-3 1.78 2.08 1.92 1.76 1.80 1.71 1.48
20:4n-6 1.66 1.01 0.84 0.48 0.45 0.40 0.30
20:4n-3 1.19 1.08 0.90 0.62 0.59 0.54 0.43
EPA 32.80 44.53 44.31 45.87 46.57 46.08 44.61
21:5n-3 1.32 1.96 1.77 1.72 1.74 1.68 1.55
22:5n-6 0.62 0.65 0.54 0.40 0.37 0.33 0.25
22:5n-3 4.64 6.64 5.71 5.07 4.98 4.67 4.08
DHA 25.48 34.72 36.69 41.31 41.66 42.50 44.80
EPA+DHA 58.28 79.25 81.00 87.18 88.23 88.58 89.41
∑n-3 70.83 91.27 91.51 96.46 97.41 97.25 97.00
∑n-6 3.42 1.93 1.64 0.96 0.82 0.76 0.60
∑n-3/∑n-6 20.7 47.2 55.8 100 119 128 162
**0.02%或以下的GC面积。
相分离后。将K30EE用70%重量AgNO3溶液(K30EE:AgNO3=1.2:1)在室温搅拌并分离成水相和有机相。除去有机相。随后将水相加热至70°C，与采用如本实施例同样的步骤但不加热所制备的浓缩物(“室温浓缩物”)相比，其引起n-6脂肪酸和具体n-3脂肪酸富集的脂肪酸浓缩物(“浓缩物-1”)游离。将所述水相在水中稀释(水:AgNO3(s)=约7.5:1，以重量计)以获得相对于第一浓缩物具有增加的n-3/n-6比例和降低的EPA和DHA以外的n-3脂肪酸浓度的第二浓缩物(“浓缩物-2”)。参见表2。
表2：脂肪酸浓缩物的组成；水相加热至70°C。
脂肪酸乙酯 K30EE 室温浓缩物 浓缩物-1 浓缩物-2
16:4n-1 1.24 5.07 3.57 6.74
18:1n-9 11.94 0.73 3.20 -
18:3n-3 0.59 0.07 0.37 -
18:4n-3 2.15 3.31 5.75 2.81
20:4n-6 1.03 0.33 1.29 0.13
20:4n-3 0.50 0.37 1.66 0.20
EPA 18.51 45.36 42.68 45.67
21:5n-3 0.71 1.57 1.96 1.44
22:5n-6 0.3* 0.35 1.01 0.21
22:5n-3 2.29 3.69 6.58 2.94
DHA 12.21 34.81 15.75 38.51
EPA+DHA 30.72 80.17 58.43 84.18
∑n-3 36.96 89.18 74.75 91.57
∑n-6 1.3 0.68 2.30 0.34
∑n-3/∑n-6 28 131 32.5 269
*由峰值大小估算
图1和2分别显示浓缩物-1和浓缩物-2的气相色谱。图1和2的比较表明，本发明公开的方法选择性地除去脂肪酸化合物以得到相对于起始混合物具有较低含量的特定脂肪酸的浓缩物(例如，图2)。
水相的高盐浓度降低了熔点，以至于与上述方法类似的分离方法可在恰好低于0°C的温度进行。水相中多不饱和脂肪酸/脂肪酸衍生物的含量也可能将更进一步降低熔点。当使用本发明公开的方法时，例如用70%硝酸银水溶液在-20°C进行实验，而不会发生任何水相固化或部分固化。很可能地，所述温度可更进一步降低。本领域技术人员将认识到，这样的温度降低可增加如上所讨论的温度调节方法的技术价值。
在本领域中，人们已经认识到，低温将促进EPA和DHA乙酯的吸收(Seike等人(2007)Journal of Chemical Engineering of Japan，Vol.40，pp1076-1084)。然而，在本领域中，未被理解的是，温度调节可用于分离脂肪酸衍生物，如表2所示，例如用于改变n3/n6比例，制备适合作为用于分离EPA和DHA以外的其他脂肪酸(例如，22:5n-3)的起始原料的中间产物，以及制备含有较低含量的其他长链omega-3脂肪酸的EPA和DHA的浓缩物。
实施例2A：用置换液提取
将K30EE用70%重量AgNO3溶液(K30EE:AgNO3(s)=1.2:1)在室温搅拌。让混合物沉降并除去有机相。水相用1-己烯(己烯:AgNO3(s)=约0.54:1，以重量计)提取，随后在水中稀释(水:AgNO3(s)=约7.5:1，以重量计)。收集通过稀释游离的脂肪酸浓缩物并通过GC分析。参见表3。
表3：脂肪酸浓缩物的组成；己烯提取物。
Figure BDA00003221493100141
**0.02%或以下的GC面积。
Figure BDA00003221493100142
仅包括面积高于0.05%的峰。
表4A显示不同置换液的比较：有机溶剂己烷、1-己烯和环己烯。下面步骤用于所有三种溶剂。将约30.2g的AgNO3溶于12.9g水中以制备70%重量AgNO3溶液。将所述溶液用约24.1g的K30EE在70°C搅拌。在70°C发生相分离，并除去有机相(约17.1g至17.7g)。随后水相用四体积的溶剂(分别为4x15.8ml己烷，4x16.1ml己烯，4x19.5ml环己烯)提取。所述四种提取物的合并代表每种溶剂的“提取物”，如表4A中所示。剩余的水相用225ml水稀释并在室温在暗处静置过夜。分离从水相中回收的脂肪酸浓缩物，并代表每种溶剂的“提取物”，如表4A中所示。组成记录为GC面积%。
通过己烷制备的提取物的气相色谱如图3中所示。由表4A中给出的GC面积可以看出，例如，对于己烷制备的提取物，比例DPAn-3/DHA为约3.3:1，并且比例DPAn-3/DPAn-6为约3.0:1。此处，可使用所谓的“碘内酯化反应”(参见Breivik2007)来分离多不饱和脂肪酸。通过加入合适量的试剂，将形成更稳定的DHA和DPAn-6的五元碘-γ-内酯，而DPAn-3将保持基本不受影响。所述DHA和DPAn-6的碘代内酯可从未反应的脂肪酸中除去。在与图3类似的脂肪酸组合物中，所述碘内酯化反应可用于制备脂肪酸组合物，所述脂肪酸组合物基本上包含DPAn-3(22:5n-3)作为唯一的链长为22个碳原子的脂肪酸。本领域技术人员将认识到，所述产物将特别适于制备纯的DPAn-3。
表4A：脂肪酸浓缩物的组成；置换液己烷、1-己烯、环己烯。K30EE来自如表2中的同一批。
Figure BDA00003221493100151
**0.02%或以下的GC面积。
Figure BDA00003221493100161
仅包括面积高于0.05%的峰。
如表4A所示，所有三种浓缩物均包含94%以上的n-3脂肪酸，但不同的n-3和n-6脂肪酸的相对浓度显著不同。己烷是相对n-6脂肪酸，以及除去DHA以外的n-3脂肪酸的最有效溶剂，在终产物中基本没有损失EPA或DHA(损失约15%)。DPA(n-3):DHA=3.3:1的高比例表明，所述己烷提取物可适用于纯化DPA(n-3)。同样地，比例(EPA+DHA):(其他的LC n-3)为1.7的低值表明，所述己烷提取物可适用于制备具有高相对含量的其他LComega-3脂肪酸的浓缩物。己烯提取物比己烷提取物包含更高总浓度的n-3脂肪酸，比例DPA(n-3):DHA约为1:1。己烯提取物也可以是制备这类浓缩物和各个纯的脂肪酸酯的原材料。环己烯得到比其他溶剂具有更低的n-6脂肪酸(n-6脂肪酸基本上不存在)，和低的EPA和DHA以外的n-3脂肪酸的浓缩物，但也提供了终产物中产率较低的EPA和DHA(损失约68%)。浓缩物中EPA+DHA的总量为约91.0%，而其他C20-C22n-3脂肪酸(“其他的LC n-3”)的总量仅为2.7%。
表3和4A中的结果表明，改变温度和使用不同相对量的起始脂肪酸混合物和溶剂影响所获得的浓缩物的组成。例如，使用与表4A中相同体积的K30EE和1-己烯，但仅使用2/3体积的70%重量AgNO3溶液获得表3中所示的结果。使用的温度也不同(室温对比70°C)。
还用1,7-辛二烯进行了研究；然而，所述溶剂产生剧烈的放热反应。所述放热反应表明环辛二烯和其他二烯/多烯类化合物与银离子具有高亲和力，假若采取适当的安全措施，这些化合物也能够用作置换液。也参见实施例2B的表4B。
实施例2B：关于置换液使用的额外实施例
用表4B中列出的有机溶剂进行了大量的实验。对于每个实验，使用下列近似量的试剂和乙酯起始原料：60g硝酸银，溶解在水中，得到70%浓度(25.7g水)，以及48g的K30EE乙酯(批次2101071)。在表4C中给出了精确的量以及回收的提取物的量。
用磁力搅拌器在室温搅拌1.5小时后，将硝酸银水溶液和K30EE的每种混合物转移至分液漏斗中，并在暗处静置直至发生相分离。除去上层有机相(“不溶解的酯”)。收集用于分析的样本，用于所述系列中的第一个实验。
除所述系列中的第一个实验外，用三份溶剂提取所述水相。每份包含约0.36mol溶剂。据估计，除去不溶解的酯后，大约20g的乙酯留在水相中。假设乙酯的平均分子量为330g/mol，则20g乙酯相当于0.06mol。这意味着，相对于最初溶解在水相中的乙酯，每次提取使用了估计6倍过量的溶剂来进行。参见表4B。
提取完成后，将600ml水加入到水相中，并在剧烈搅拌后，将所述混合物在暗处静置过夜以完成新的相分离。
将所有涉及溶剂的提取物使用旋转蒸发器在真空下蒸发。将提取物称重后，对样本进行分析。
表4C中给出了选定的脂肪酸乙酯的分析结果。
表4B.溶剂的量
Figure BDA00003221493100171
1将1,5-环辛二烯加入到包含硝酸银水溶液的相中导致放热反应，并且为了安全原因，放弃了所述实验。然而，所述放热反应表明环辛二烯和其他二烯/多烯类化合物与银离子具有高亲和力，假若采取适当的安全措施，这些化合物也能够用作置换液。
2加入丙酮没有导致相分离。可进行进一步的实验，例如，将丙酮与其他溶剂结合或使用丙酮以外的其他酮类。
Figure BDA00003221493100181
从表4D可以看出，各种溶剂以不同方式作为置换液起作用。在众多不同的使用这些溶剂来制备用于各种脂肪酸乙酯(或乙酯的组合)的浓缩物的原料的可能性中，下面的讨论仅集中于少数可能性。本领域技术人员将意识到，所述结果可表明制备用于许多其他脂肪酸乙酯或脂肪酸乙酯的组合的原料的可能性。
虽然发现己烷具有制备相对于DHA富含DPA(22:5n-3)的馏分的有用性质，并因此被视为可用于制备DHA的浓缩物(以及从表中的值可见也可用于制备富含20:4n-3的浓缩物)，然而二氯甲烷(CH2Cl2)可以例如适于制备含有少量其他n-3脂肪酸以及少量n-6脂肪酸的EPA和DHA的浓缩物。此外，相对于其他置换液，CH2Cl2也具有减少高不饱和脂肪酸16:4n-1的相对量的效果。因此，CH2Cl2或具有类似效果的置换液可用于制备EPA和DHA的高浓缩物，因为它们可以无需使用补充的分离技术(根据链长工作)来减少16:4n-1。分子蒸馏/短程蒸馏是一种常用的根据链长的分离技术。然而，由于这种技术的分离能力可能一般，通过分子蒸馏/短程蒸馏除去脂肪酸16:4n-1也可能会损失一些所需的脂肪酸。因此，价值在于相对于其他置换液，使用如CH2Cl2的置换液降低16:4n-1的含量。
表4C显示，当使用二氯甲烷作为置换液时，在第一馏分(馏分A)中获得相对大量的乙酯。表4E显示用二氯甲烷作为置换试剂的进一步实验的结果。除了将使用23.1ml CH2Cl2的第一次提取替换为三次提取(每次使用8mlCH2Cl2)外，步骤与表4B和4C中给出的步骤相同。
浓缩物的最终量(6.34g)与使用CH2Cl2的第一实施例中获得的量接近。EPA和DHA的浓度以及其他脂肪酸的浓度也与第一实施例中获得的浓度非常接近(参见表4D)。提取物A的组分显示出低量的EPA和DHA，和相对量高的其他长链omega-3脂肪酸和长链omega-6脂肪酸。因此，例如，发现小体积的二氯甲烷可用于改善EPA和DHA的含量，并减少其他长链n-3脂肪酸和长链n-6脂肪酸的含量。通过改变CH2Cl2的量，将获得不同的组分，或者作为提取物或者作为浓缩物。从所述实施例的信息，通过利用相对于起始原料的量和浓度的特定比例的CH2Cl2，人们可以制备具有具体脂肪酸含量的组合物。从表4E和表4D可以看出，用CH2Cl2进一步提取在很大程度上除去了其他长链n-3脂肪酸和长链n-6脂肪酸，水稀释后得到含有多于90%的EPA和DHA的乙酯的浓缩物(GC面积%)。因此中间提取物代表了制备富含此类长链n-3和n-6脂肪酸的馏分的有用起始原料。并且，所述中间产物富含EPA，使得它们可用作制备含有高浓度EPA的产品(例如产品Epadel)的中间体。
图5表示与表4E相同的数据，其中各列代表相同选定脂肪酯的乙酯的相对浓度。从所述图和表中，基于当获得特定成分的最大提取时，和相对于K30EE和提取物A中的相对浓度，以及提取物E和最终浓缩物中的相对浓度之间的比例，可推断出便于使用CH2Cl2作为置换液除去脂肪酸乙酯的“等级顺序”(“pecking order”)。
所述“等级顺序”似乎是：
18:3n-3>20:4n-6>22:5n-6>20:4n-3>18:4n-3>22:5n-3>21:5n-3>16:4n-1>EPA>DHA
19:5脂肪酸以如此低的量存在以至于在所述“等级顺序”中一直未能找到其位置。
高效分子排阻色谱(HPSEC)分析显示，当使用CH2Cl2作为置换液时，偏甘油酯(partial glycerides)(其为乙基化油中的典型次要成分)富含在浓缩物中。对于所使用的其他溶剂，相对于起始K30EE，浓缩物中偏甘油酯的浓度似乎未被影响到显著的程度。表4F中给出的分析结果说明了这一点。
表4F.偏甘油酯。根据欧洲药典专论1250和美国药典Omega-3酸乙酯专论中的步骤进行分析。
Figure BDA00003221493100211
1表4D的浓缩物
2表4E的提取物和浓缩物
通过直接进样如欧洲药典专论2.4.29和美国药典专论Omega-3酸乙酯所述的乙酯样本获得表4D和4E中的GC面积结果。如果样品中的偏甘油酯与起始K30EE的组成相似，本领域技术人员将意识到在分析中包含偏甘油酯可导致测得的EPA和DHA含量减少。之所以会这样的原因是在GC色谱图中将无法观察到偏甘油酯，并且基于所述原因，所述乙酯峰的相对面积百分比将高于色谱图中所有组分都可观察到的情况。本领域技术人员将意识到，将偏甘油酯包括在分析中的方法为将样品甲基化，从而将乙酯和偏甘油酯均转化为甲酯。因此，当进行通过使用CH2Cl2作为置换液获得浓缩物的操作时，很有可能出现EPA和DHA的含量少于表4D和4E中给出的结果。
然而，当将使用CH2Cl2作为置换液得到的浓缩物甲基化时，所得到的甲酯不具有降低的EPA和DHA含量。相反，虽然EPA的浓度似乎或多或少未受影响，但DHA的浓度似乎增加了(表4G)。与此同时，16:4n-1的相对浓度似乎未增加，而是稍有减少。如此看来，当使用置换液如CH2Cl2时，偏甘油酯的浓度例如在最终浓缩物中增加，并且相对于起始K30EE，这些偏甘油酯具有大大增加的例如EPA和DHA浓度。因此，根据本发明公开的方法，在传统的浓缩操作如分子蒸馏和尿素分馏中伴随偏甘油酯馏分损失的有价值的脂肪酸被保留和浓缩。
表4G.使用CH2Cl2作为置换液获得的浓缩物。根据欧洲药典专论2.4.29甘油三酯的衍生化以及美国药典专论Omega-3酸乙酯中分析偏甘油酯时的衍生化的操作进行甲基化。
Figure BDA00003221493100221
从所述实施例看出，相对于仅含有碳和氢的碳氢化合物，CH2Cl2作为置换液例如改善了效果。本领域技术人员将认识到，可通过其他的卤代溶剂以及含有其他极性官能团(如氧或氮)的溶剂得到类似的改善效果。
实施例2C.使用甘油三酯作为起始原料富集EPA和DHA
在70°C，将60.3g的鱼肝油(Tran)加入到23g H2O和59g AgNO3的混合物中。将混合物搅拌1小时并随后静置直至发生相分离。将下层的水相与上层的有机相分离并加入400g的水以裂解Ag+络合物并游离在EPA和DHA中富集的甘油三酯。表4H中给出了起始原料的脂肪酸特性和得到的油。EPA和DHA显示出多于两倍的增加。所述实施例显示，用甘油三酯也发生了络合作用。为了完成EPA和DHA的富集，甘油三酯中的脂肪酸分布不能是完全任意的。一些甘油三酯必须主要具有连接于主链的饱和或不饱和脂肪酸。甘油三酯中的脂肪酸分布可根据种类而变化。
表4H.使用鱼肝油作为起始原料富集EPA和DHA的实施例
脂肪酸 鱼肝油(TG) 浓缩物 变化
C14:0 3.0 1.4 -53%
C16:0 9.7 5.0 -49%
C16:1 8.2 3.8 -54%
C18:0 2.1 1.5 -29%
C18:1n-9 17.8 9.6 -46%
C18:1n-7 4.9 3.1 -37%
C18:2 1.8 1.0 -45%
C18:3n-3 0.8 0.6 -18%
C8:4n-3 2.5 3.7 51%
C20:1 13.3 6.5 -51%
C20:4n-3 0.8 0.9 11%
C20:5n-3 9.4 19.8 110%
C22:1 7.2 2.9 -60%
C22:5n-3 1.3 2.0 51%
C22:6n-3 13.0 33.7 160%
实施例2D用超临界CO2提取
在50°C使用45%/19%/36%(基于重量)比例的AgNO3/H2O/EE，68%的乙酯留在有机层中。将水层转移至SFE(超临界流体提取)柱进行提取。与Suzuki(Suzuki等人(1993)，Bioseparation3，pp197-204)的发现相反，并不是所有络合物中的乙酯均可以被提取。约70%的乙酯已被提取后，剩余的混合物已变成凝胶状的固体。提取的温度和压力可用于改变EPA/DHA比例。在280巴下将提取温度从60°C增加到70°C将所提取的乙酯中的EPA/DHA从53/15变化到55/23。为了提取所有的乙酯，有必要在提取期间加入水。将0.5%H2O加入到CO2流中足以完全提取所述乙酯。下面的实施例6的结果表明，加入乙醇也可能是有用的。
实施例3：在水中稀释
已经发现，用水部分稀释水相将游离富集在n-6脂肪酸和/或具体omega-3脂肪酸(例如，EPA和DHA以外的长链n-3脂肪酸)中的有机馏分。
将K85EE与60%重量AgNO3溶液(K85EE:AgNO3=约7:10，以重量计)一起搅拌。将水相与有机相分离并逐步用水稀释。用水稀释一次后得到“浓缩物-1”(水:AgNO3(s)=约1.2:1，以重量计)。通过进一步稀释水相得到第二脂肪酸浓缩物(水:AgNO3(s)=约2.8:1，以重量计)(未分析)。通过进一步稀释得到“浓缩物-4”(水:AgNO3(s)=约20:1，以重量计)。表5对比了K85EE起始混合物、分离的有机相(“不溶解的酯”)、浓缩物-1和浓缩物-4的组成(GC面积%)。在括号中给出了相对于K85EE起始混合物重量的收率。浓缩物-4的气相色谱显示在图4中。
表5：脂肪酸浓缩物的组成；逐步用水稀释。
Figure BDA00003221493100241
Figure BDA00003221493100251
**0.02%或以下的GC面积。
Figure BDA00003221493100252
仅包括面积高于0.05%的峰。
表5中的结果显示，相对于K85EE起始混合物，所述有机相富集n-6脂肪酯。对于DHA以外的n-3脂肪酸，观察到类似的结果。浓缩物4含有70%DHA(GC面积%)和非常少的DPA，使得所述馏分和类似馏分适于作为制备纯DHA的中间体。
实施例4：AgNO3浓度
将K85EE与60%重量或70%重量AgNO3溶液一起搅拌，K85EE:AgNO3=2:1(20.0g比10.1g)。让油/水混合物分离并除去有机相。水相用100ml水稀释，并收集通过稀释游离的脂肪酸浓缩物(“浓缩物-1”)。将另外的50ml水加入到水相中以获得第二浓缩物(“浓缩物2”)。通过GC分析(GC面积%)测定K85EE起始混合物、分离的有机相(“不溶解的酯”)以及浓缩物1和2的组成，如表6和7中所示。在括号中给出了相对于K85EE起始混合物重量的收率。
表6：脂肪酸浓缩物的组成；60%AgNO3溶液。
Figure BDA00003221493100253
Figure BDA00003221493100261
**0.02%或以下的GC面积。
表7：脂肪酸浓缩物的组成；70%AgNO3溶液.
**0.02%或以下的GC面积。
用包含相对低浓度的银离子的水溶液得到脂肪酸浓缩物也是可能的。然而，用水进行稀释可能是优选的以获得两种类型的混合物：含有较高量EPA和DHA的脂肪酸浓缩物(即，较低量omega-6脂肪酸和/或具体omega-3脂肪酸例如EPA和DHA以外的长链omega-3脂肪酸)，和含有较高量omega-6脂肪酸和/或具体omega-3脂肪酸例如EPA和DHA以外的长链omega-3脂肪酸(即，较低量EPA和DHA)的其他浓缩物(例如，分离的有机相)。如下的表8说明了这一点。将K30EE与AgNO3溶液(60%重量70%重量或80%重量)混合，K30EE:AgNO3=0.8，并且分离得到的两相。将水相在水中稀释。对于表8中的每个AgNO3浓度，标记(1)的列给出分离的有机相的组成，而列(2)给出通过在约70°C的温度将水相在水中稀释所回收的脂肪酸浓缩物的组成。如表8中所示，60%AgNO3溶液得到较高的n-3/n-6比例和较高的DHA浓度。
表8：脂肪酸浓缩物的组成；60%、70%、80%AgNO3溶液。
Figure BDA00003221493100271
**0.02%或以下的GC面积百分比。
实施例5：脂肪酸混合物：AgNO3比例
研究通过将比例K30EE:AgNO3从0.4变化到1.6对改变起始脂肪酸混合物与AgNO3(s)的量的影响。在所有实验中使用70%重量的AgNO3水溶液。将合并的K30EE-AgNO3在70°C搅拌1.5小时后，在相同的温度发生相分离。在每个实验中，约1小时后得到两个目测澄清的相。除去有机相后，水溶液用水稀释(水:AgNO3(s)=约7.5:1，以重量计)。得到的浓缩物如表9中所示。通过GC分析(GC面积%)测定组成。表9中的结果表明，增加每AgNO3中K30EE的量得到较高的n-3/n-6比例，以及较高比例的(EPA+DHA)/∑(其他的LC n-3)。
表9：脂肪酸浓缩物的组成；K30EE:AgNO3比例0.4-1.6。
Figure BDA00003221493100281
Ni：未积分；假定为低于0.05面积%的峰
实施例6：醇的加入
将K30EE与如表10中所示的含有相对量增加的乙醇的70%重量AgNO3溶液一起搅拌。除去如上所述的起始有机相后，剩余的水相用水稀释(水:AgNO3(s)=约7.5:1，以重量计)。通过GC分析(GC面积%)测定组成，如表10中所示。
表10：脂肪酸浓缩物的组成；将乙醇加入到水相中。K30EE来自如表9中的同一批。
Figure BDA00003221493100282
Figure BDA00003221493100291
表10中的结果表明，加入乙醇不同地影响多种多不饱和脂肪酸。增加乙醇的相对量可引起更大量的单不饱和脂肪酸(例如，18:1n-9)进入水相。加入乙醇也导致n-6脂肪酸相对于n-3脂肪酸的浓度增加。相对于EPA+DHA的总和，“其他的LC n-3酸”的含量也出现增加。这些影响对于制备具有高含量的“其他的LC n-3酸”和/或高含量的n-6脂肪酸的浓缩物可能是有用的。
实施例7：污染物的去除
将几种持久性有机污染物(POPs)加入到K30EE和根据本发明公开的方法得到的乙酯浓缩物中。测量所得到的油(即，脂肪酸浓缩物)的POPs和胆固醇。根据欧洲药典专论2.4.32Total cholesterol in oils rich in omega-3acids来分析胆固醇。脂肪酸浓缩物中的POPs浓度低并且总胆固醇(游离的加酯化的胆固醇)的浓度为0.06mg/g。K30EE起始原料和所得到的浓缩物中的POPs水平如表11中所示。由于已知银离子与π-键系统相互作用(参见表4C)，可以预测，包含芳香环系统的持久性有机污染物的水平将在此过程中增加。苯并芘减少74%。这表明与银离子的弱络合倾向并且所述苯并芘未完全转移到水相中，而是大部分留在有机相中。牢记的是，卤代溶剂显示出很强的与银离子/多不饱和脂肪酸络合物相互作用能力(参见表4C)，令人惊讶地，小量卤代芳香化合物被转移到水相中并发现于浓缩物中。在此过程中除去了加入到起始原料中的96%或更多的卤代芳香化合物。
表11.起始原料(加入POPs的K30EE)和浓缩物中的持久性有机污染物的水平。
Figure BDA00003221493100301
Figure BDA00003221493100311
除了在实施例中或除了另外说明，说明书和权利要求书中所使用的表示成分、反应条件、分析测量等的所有数字应理解为在所有实施例中被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则列在说明书和所附的权利要求书中的数值参数为近似值，其可能根据本发明试图获得的期望特性而变化。最起码不试图限制应用等同权利要求范围的理论，每个数值参数均应按照有效数字的个数和普通的舍入方法理解。
虽然，本发明的广泛范围所列的数值范围和参数均为近似值，除非另外说明，否则在具体实施例中所列的数值在报道时应尽可能精确。然而，任何数值固有地必然包含一定的误差，其产生于它们各自的试验测量中所出现的标准偏差。

Claims (64)

1.从脂肪酸油混合物中浓缩至少一种omega-3脂肪酸的方法，所述方法包括：
(a)混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液以形成水相和有机相，其中在水相中，所述银盐水溶液与至少一种omega-3脂肪酸形成络合物；
(b)分离有机相和水相；
(c)用置换液提取水相，或将水相的温度升高到至少30°C，或用置换液提取与升高温度相结合，从而形成至少一种提取物；
(d)合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界CO2提取水相相结合，以解离络合物，其中水相包含所述银盐和至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液；和
(e)从包含所述银盐的水相中分离所述至少一种含有脂肪酸浓缩物形式的溶液。
2.根据权利要求1的方法，其中银盐的浓度范围为约10%至约90%，以重量计于水中。
3.根据权利要求2的方法，其中银盐的浓度范围为约60%至约80%，以重量计于水中。
4.根据权利要求3的方法，其中银盐的浓度为约60%，以重量计于水中。
5.根据权利要求1的方法，其中所述银盐选自AgNO3和AgBF4。
6.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自(全-Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)、(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)及其组合。
7.根据权利要求6的方法，其中所述方法浓缩EPA或DHA，或EPA和DHA。
8.根据权利要求7的方法，其中在至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液中的EPA/DHA的比例范围为约0.1至约10，以重量计。
9.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含至少90%omega-3脂肪酸，以重量计。
10.根据权利要求6的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含至少80%EPA和DHA，以重量计。
11.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种omega-6脂肪酸。
12.根据权利要求11的方法，其中所述方法相对于脂肪酸油混合物提高了脂肪酸浓缩物中omega-3与omega-6脂肪酸的比例。
13.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约40。
14.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约80。
15.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约100。
16.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约150。
17.根据权利要求11-12中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中omega-3脂肪酸与omega-6脂肪酸的比例大于约200。
18.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约3%重量。
19.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约2%重量。
20.根据权利要求11-17中任一项的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中的omega-6脂肪酸的总浓度小于约1%重量。
21.根据权利要求1的方法，其中脂肪酸油混合物与银盐溶液的比例范围为约0.4至约1.6，以重量计。
22.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)进一步包括将醇加入水相中。
23.根据权利要求22的方法，其中所述醇包括乙醇。
24.根据权利要求1的方法，其中所述置换液包括有机溶剂。
25.根据权利要求24的方法，其中所述有机溶剂选自卤代溶剂、烷烃、烯烃、环烷烃和环烯烃。
26.根据权利要求24的方法，其中所述有机溶剂选自二氯甲烷、己烷、己烯、环己烷、环己烯和二烯烃。
27.根据权利要求1的方法，其中用置换液提取水相包括至少两个连续提取。
28.根据权利要求1的方法，其中所述至少30°C的温度范围为约30°C至约90°C。
29.根据权利要求1的方法，其中至少重复一次合并水相和水，或用超临界CO2提取水相，或合并水相和水与用超临界CO2提取水相相结合，以解离络合物。
30.根据权利要求1的方法，其中，分离包含脂肪酸浓缩物的有机相后，从含有银盐的水相中回收银盐用于再次使用。
31.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物来自动物油、植物油、微生物油、藻类油或其任意组合。
32.根据权利要求31的方法，其中所述动物油是海产品油。
33.根据权利要求32的方法，其中所述海产品油是鱼油。
34.根据权利要求31-33中任一项的方法，其中所述油的形式选自甘油酯、乙酯和游离脂肪酸形式。
35.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种环境污染物。
36.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的胆固醇。
37.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自乙酯、游离酸和甘油酯的形式。
38.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸浓缩物包含相对于脂肪酸油混合物降低了浓度的至少一种(全-Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)以外的C20-C22omega-3脂肪酸。
39.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于3%重量。
40.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于2.5%重量。
41.根据权利要求38的方法，其中所述脂肪酸浓缩物中EPA和DHA以外的C20-C22omega-3脂肪酸的总浓度小于0.5%重量。
42.根据权利要求1的方法，进一步包括：(f)通过至少一种纯化方法纯化所述脂肪酸浓缩物。
43.根据权利要求42的方法，其中所述至少一种纯化方法选自短程蒸馏、分子蒸馏、碘内酯化分离、超临界流体提取、酶分馏和制备色谱法。
44.根据权利要求43的方法，其中所述至少一种纯化方法包含短程蒸馏和分子蒸馏。
45.根据权利要求1的方法，其中所述方法至少重复一次，其中至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液包含随后方法中的脂肪酸油混合物。
46.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少80%的选自(全-Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)和(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z)-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA)的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
47.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少90%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
48.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少95%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
49.根据权利要求45的方法，其中所述方法制备包含至少98%的选自EPA、DHA和DPA的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
50.根据权利要求1的方法，其中所述至少一种脂肪酸浓缩物、至少一种提取物和至少一种溶液通过至少一种分馏方法进行处理。
51.根据权利要求50的方法，其中所述至少一种分馏方法选自蒸馏、提取、碘内酯化和色谱法。
52.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少80%的选自C20-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
53.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少90%的选自C20-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
54.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少95%的选自C20-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
55.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种分馏方法制备包含至少98%的选自C20-C22omega-3脂肪酸的至少一种omega-3脂肪酸的脂肪酸浓缩物。
56.根据权利要求50-51中任一项的方法，其中所述至少一种omega-3脂肪酸选自(全-Z)-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA)和(全-Z)-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸(DPA)。
57.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含至少一种选自二英、PCBs、DDT和PDBE的持久性有机污染物。
58.根据权利要求57的方法，其中所述方法减少脂肪酸油混合物中的至少一种持久性有机污染物达脂肪酸浓缩物中的至少95%。
59.根据权利要求1的方法，其中所述脂肪酸油混合物包含胆固醇。
60.根据权利要求59的方法，其中所述方法将脂肪酸油混合物中的胆固醇减少到在脂肪酸浓缩物中小于0.1mg/g。
61.根据权利要求1的方法，其中超临界CO2包含至少一种极性调节剂。
62.根据权利要求61的方法，其中所述至少一种极性调节剂选自水和醇。
63.根据权利要求1的方法，其中在约-25°C至约20°C，约20°C至约25°C，或约25°C至约90°C的温度范围内混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液。
64.根据权利要求1的方法，其中，混合脂肪酸油混合物和银盐水溶液后，在约-25°C至约20°C，约20°C至约25°C，或约25°C至约90°C的温度范围内分离水相和有机相。
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