KR20130099270A - 오메가-3 지방산을 농축하기 위한 공정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 수용성 AgNO3 용액과 같은 수용성 은 염 용액과 지방산 오일 혼합물로부터 오메가-3 지방산을 농축하기 위한 공정에 관한 것이다.

Description

오메가-3 지방산을 농축하기 위한 공정{PROCESS FOR CONCENTRATING OMEGA-3 FATTY ACIDS}
본 발명은 일반적으로 수용성 AgNO3 용액과 같은 수용성 은 염 용액과 지방산 오일 혼합물로부터 오메가-3 지방산과 같은 다중불포화 지방산을 농축하기 위한 공정에 관한 것이다.
본 출원은 2010년 9월 24일 출원된 미국 가특허출원 제61/386,096호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본 출원에 참고 문헌으로서 포함된다.
오메가-3 지방산은 약제학적 및/또는 영양학적 첨가제를 포함하는 다양한 용도에 있어서 유용하다. 예를 들어, 오메가-3 지방산은 혈장 지질 수치, 심혈관계 및 면역 기능, 인슐린 작용, 신경 발달 및 시각 기능을 조절할 수 있다. 오메가-3 지방산은 고혈압 및 고트리글리세리드혈증 및 응고인자 VII 인지질 복합체 활성에 유익한 영향을 줄 수 있다. 또한, 오메가-3 지방산은 혈청 트리글리세리드 저하, 혈청 HDL 콜레스테롤 증가, 수축기 및 확장기 혈압 및/또는 맥박수를 저하시킬 수 있으며, 혈액 응고인자 VII 인지질 복합체의 활성을 저하시킬 수 있다. 또한, 오메가-3 지방산은 일반적으로 심각한 부작용을 수반하지 않으면서, 매우 효과적이다.
또한, 어유(fish oil)로 통칭되는 해양유는 지질 대사를 조절하는 것으로 밝혀진 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)를 포함하는 오메가-3 지방산의 소스이다. 식물성 오일, 미생물성 오일 및 조류성 오일 역시 오메가-3 지방산의 소스이다. 오메가-3 지방산의 몇몇 제형이 개발되어 왔다. 예를 들어, 오메가-3 지방산 오일 혼합물의 일 형태는 상호 Omacor® / Lovaza™ / Zodin® / Seacor®로 판매되는 것으로서, DHA 및 EPA를 포함하는 어유로부터의 1차 오메가-3, 긴 사슬, 다중불포화 지방산의 농축액이다. 예를 들어, 미국 특허 번호. 5,502,077, 5,656,667 및 5,698,594 참조. 특히, Lovaza™의 각 1000 mg 캡슐은 적어도 90% 오메가-3 에틸 에스테르 지방산(84% EPA/DHA); 대략 465 mg EPA 에틸 에스테르 및 대략 375 mg DHA 에틸 에스테르를 포함한다.
다른 오메가-3 지방산은 활성을 제공할 수 있다. 예를 들어, Kaur et al. (Prog. Lipid Res. (2011) vol. 50(1), pp. 28-34) 은 n-3 DPA에 특정 생물학적 효과가 있음을 언급하고 있다. 이는 n-3 DPA가 EPA보다 상처 치료 과정에 중요시될 수 있는 내피 세포 이동 능력이 10배 이상 높음을 근거로 한다. 게다가, n-3 DPA는 EPA 및 DHA보다 더 효과적으로 혈소판 응집을 저해할 수 있다고 알려져 있다. 또한, n-3 DPA는 공간 학습 및 장기 강화의 노화에 따른 저감을 감쇠하는데 중요한 작용을 할 수 있다. 다만, n-3 DPA는 순수한 화합물의 제한된 가용성 때문에 광범위하게 연구되지 못하였다.
또한, 오메가-3 지방산의 소스의 대부분은 오메가-6 지방산의 소스이다. 다만, 특정 생물학적 작용에 있어서, 오메가-3 및 오메가-6 지방산은 서로 상반되는 활성을 나타낼 수 있으므로, 오메가-6 지방산이 낮은 농도, 즉 높은 n-3/n-6 비, 인 것이 바람직하다. Ph. Eur. Monograph 1250과 같이 시판되는 상품은 일반적으로 24-40 범위의 n-3/n-6 비를 가진다.
오메가-3 산의 농축액을 제조하는 방법에 대한 개요는 Breivik (Long-Chain Omega-3 Specialty Oils, The Oily Press, PJ Barnes & Associates, Bridgwater UK, pp. 111-140, 2007) 에 기재되어 있다. 해양유의 지방산 조성물 복합체 때문에 하나의 농축 기술을 사용하여 고도로 농축된 오메가-3 지방산 조성물을 제조하는 것은 어렵다. 보통, 탄소 사슬의 길이에 따른 분류(예를 들어, 분자/단형 증류 밑/또는 초임계 유체 추출)와 불포화에 따른 분류(예를 들어, 효소적 분리 및/또는 요소 분획화)를 조합하는 대부분의 기술들의 조합이 사용된다. 종래 기술은 대개 최초 오일의 양과 비교할 때, 낮은 수득률의 오메가-3 지방산을 포함하는 농축액을 제공한다는 단점을 수반한다. 특히, 요소 분획화(urea fractionation) 및 단형 증류(short path distillation)과 같은 저-수득 기술을 조합할 때 문제될 수 있다.
게다가, 주로 사슬 길이에 따른 지방산 에스테르를 분리하는 단형 증류 및 다른 방법과 같은 분리 방법은 일반적으로 C20:4n-3 및 C20:4n-6 또는 C22:5n-3 및 C22:5n-6와 같이 탄소 원자의 수가 동일한 오메가-3 및 오메가-6 지방산을 분리하지 못한다. 예를 들어, 요소 분획화는 지방산 유도체가 요소와 고체 복합체를 형성하는 경향이 지방산 에스테르의 카보닐기와 첫번째 이중결합 사이의 거리(일반적으로 Δ 값이라고 알려짐)를 증가시키기 때문에, 동종체 오메가-3 지방산보다 오메가-6 지방산에 대한 더 큰 농축계수를 야기할 수 있다. 만약 오메가-6 지방산이 Δ'의 Δ 값을 가질 경우, 이에 상응하는 오메가-3 지방산은 요소와의 높은 복합체를 형성 정도를 야기하는 (Δ' + 3)의 Δ 값을 가진다. 특히 이러한 경향은 오메가-3 지방산의 고농축액을 위해 상대적으로 많은 양의 요소가 사용되어야 함을 나타낸다.
은 염(silver salt)을 사용하여 혼합물로부터 다중불포화 지방산을 분리하기 위한 연구들이 수행되어 왔다. 예를 들어, Quinn et al. (pp. 133-169 in Perry et al., Progress in Separation and Purification 4, Wiley-Interscience, New York, 1971); Peers et al. (J. Food Technology (1986) vol. 21 pp. 463-469); Suzuki et al. (Bioseparation (1993) vol. 3, pp. 197-204); Teramoto et al. (Ind. Eng. Chem. Res. (1994), vol. 33 pp. 341 -345); Teramoto et al. (J. Membrane Sci., (1994) vol. 91, pp. 209-213); Kubota et al. (Sep. Sci. Technol. (1997), vol. 32, pp. 1529-1541); Chen et al. (J. Jiangsu University of Science and Technology (Natural Science) (2000), vol. 21, pp. 18-22); Tao et al. (Chinese J. Marine Drugs, (2004) No. 3, pp. 28-30); Huong (J. Chemistry (2007), vol. 45, pp. 757-762); Li et al. (Sep. Sci. Technol. (2008) vol. 43, pp. 2072-2089); EP 0454430B1; EP 0576191A2; Seike et al. (Journal of Chemical Engineering of Japan (2007), Vol. 40, pp 1076-1084); 및 Kamio et al. (Ind. Eng.Chem.Res., (2011) vol. 50(11), pp. 6915-24) 참조. 다만, 종래 공지된 방법은 충분히 선택적 및/또는 효과적인 오메가-3 지방산을 농축하기 위한 공정을 제공하지 못한다.
따라서, 기술분야에서는 지방산 오일 혼합물로부터 보다 효과적으로 오메가-3 지방산을 농축하기 위한 공정에 대한 필요성이 요구되고 있다.
상기 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명은 단지 예시하고 설명하기 위한 것이며, 본 명세서를 제한하지 않으며, 청구된 바와 같은 것으로 이해된다.
본 발명의 개시는 일반적으로 (a) 수용성상 및 유기상(organic phase)을 형성하기 위한 지방산 오일 혼합물 및 수용성 은 염 용액(AgNO3 또는 AgBF4)을 혼합하는 단계, 여기서 상기 수용성상(aqueous phase) 내에서 수용성 은 염(aqueous silver salt) 용액이 적어도 하나의 오메가-3 지방산과 복합체를 형성하고; (b) 유기상으로부터 수용성상을 분리하는 단계; (c) 전이 액체(displacement liquid)로 수용성상을 추출하거나, 수용성상을 적어도 30 ℃로 승온하거나, 또는 전이 액체로 수용성상을 추출하고 승온하여 적어도 하나의 추출물을 얻는 단계; (d) 상기 복합체를 분해하기 위해 수용성상을 물과 혼합하거나, 수용성상을 초임계 CO2로 추출하거나, 또는 수용성상을 물과 혼합하고 수용성상을 초임계 CO2로 추출하는 단계, 여기서 은 염(silver salt)을 포함하는 수용성상 및 지방산 농축액을 포함하는 적어도 하나의 용액이 형성되고; 및 (e) 상기 은 염을 포함하는 수용성상으로부터 상기 지방산 농축액을 포함하는 적어도 하나의 용액을 분리하는 단계;를 포함하는 지방산 오일 혼합물로부터 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 농축하는 공정에 관한 것이다.
도 1은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수용성상을 70°C로 가열함으로써 회수된 지방산 농축액의 가스 크로마토그래피이다.
도 2는 실시예 1에 기재된 바와 같이 도 1의 농축액을 제거한 후 상기 수용성상을 물에 희석시킴으로 얻어진 지방산 농축액의 가스 크로마토그래피이다.
도 3은 실시예 2A, 표 4에 기재된 바와 같이 전이 용매로서 헥산으로 추출함으로써 얻어진 분획의 가스 크로마토그래피이다.
도 4는 실시예 3, 표 12에 기재된 바와 같이 농축액 4의 가스 크로마토그래피이다.
도 5는 실시예 2B, 표 8에 기재된 바와 같이 특이적 선택된 지방산 에스테르의 에틸 에스테르의 비교 농축을 나타내는 차트이다.
명세서의 특정 측면은 하기에서 보다 더 자세히 기재되었다. 본 출원에서 사용되고 여기에 명확히 한 용어 및 정의는 본 명세서 내의 의미를 나타내는 것으로 의도된다. 여기에 참조된 특허 및 과학적 문헌은 참조로 포함되었다. 참조로 포함된 용어 및/또는 정의와 혼동되는 경우, 여기에 제공된 용어 및 정의로 한다.
단수 형태들 "하나의" 및 "상기" 는 분명하게 달리 표현하지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
용어 "대략" 및 "약" 은 표현된 수 또는 값과 거의 동일한 것을 나타낸다. 여기서 사용된 용어 "대략" 및 "약"은 일반적으로 명시된 양, 빈도 또는 값의 ±30%를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "지방산(들)" 은 예를 들어, 적어도 하나의 카복실기를 포함하는 짧은 사슬 및 긴 사슬 포화 및 불포화(예를 들어, 단일불포화 및 다중불포화) 탄화수소를 포함한다.
용어 "오메가-3 지방산" 은 천연 및 합성 오메가-3 지방산 및 이의 약학적으로-허용가능한 에스테르, 유리산(free acid), 트리글리세리드, 유도체, 컨쥬게이트(예를 들어, Zaloga et aI., 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0254357, 및 Horrobin et aI., 미국 특허 번호 6,245,811 참조, 각각은 여기에 참조로 포함되었다), 전구체, 염 및 이의 혼합물을 포함한다. 오메가-3 지방산 오일의 예는 α-리놀렌산(ALA, 18:3n-3), 옥타데카테트라엔산(즉, 스테아리돈산, STA, 18:4n-3), 에이코사트리엔산(ETE, 20:3n-3), 에이코사테트라엔산(ETA, 20:4n-3), 에이코사펜타엔산(EPA, 20:5n-3), 헤네이코사펜타엔산(HPA, 21:5n-3), 도코사펜타엔산(DPA, 클루파노돈산, 22:5n-3) 및 도코사헥사엔산(DHA, 22:6n-3)과 같은 오메가-3 다중불포화된, 긴 사슬 지방산; 모노-, 디- 및 트리글리세리드와 같은 오메가-3 지방산과 글리세롤의 에스테르; 및 예를 들어, 지방산 메틸 에스테르 및 지방산 에틸 에스테르와 같은 오메가-3 지방산과 1차, 2차 및/또는 3차 알코올의 에스테르를 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
용어 "오메가-6 지방산(들)"은 천연 및 합성 오메가-6 지방산 및 이의 약학적으로-허용가능한 에스테르, 유리산, 트리글리세리드, 유도체, 컨쥬게이트, 전구체, 염 및 이의 혼합물을 포함한다. 오메가-6 지방산 오일의 예는 리놀레산(18:2n-6), 감마-리놀렌산(18:3n-6), 에이코사디엔산(20:2n-6), 디호모-감마-리놀렌산(20:3n-6), 아라키돈산(20:4n-6), 도코사디엔산(22:2n-6), 아드렌산(22:4n-6) 및 도코사펜타엔산(즉, 오스본드산, 22:5n-6)과 같은 오메가-6 다중불포화된, 긴 사슬 지방산; 및 이의 에스테르, 트리글리세리드, 유도체, 컨쥬게이트, 전구체, 염 및/또는 혼합물을 포함하지만 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 다중불포화 지방산(예를 들어, 오메가-3 지방산 및/또는 오메가-6 지방산), 이의 에스테르, 트리글리세리드, 유도체, 컨쥬게이트, 전구체, 염 및/또는 혼합물은 이들의 농축 및/또는 정제된 형태 및/또는 예를 들어, 해양유(예를 들어, 어유), 조류성 오일, 미생물성 오일 및/또는 식물성 오일과 같은 오일의 성분으로서 사용될 수 있다.
지방산 오일 혼합물
본 발명에 따른 지방산 오일 혼합물은 동물성 오일(들) 및/또는 비-동물성 오일(들)로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 지방산 오일 혼합물은 해양유, 단세포성 오일, 조류성 오일, 식물성 오일, 미생물성 오일 및 이의 혼합불로부터 선택된 적어도 하나의 오일로부터 유래될 수 있다. 해양유는 예를 들어, 어유, 크릴유 및 어류로부터 유래되는 지질 조성물을 포함한다. 식물성 오일은 예를 들어, 아마씨 오일(flaxseed oil), 카놀라 오일, 겨자씨 오일 및 대두 오일을 포함한다. 단세포성/미생물성 오일은 예를 들어, Martek, Nutrinova 및 Nagase & Co 제품을 포함한다. 단세포성 오일은 보통 인간에 의해 소비되는 미생물 세포로부터 유래되는 오일로서 정의된다. 예를 들어, Wynn 및 Ratledge, "Microbial oils: production, processing and markets for specialty long-chain omega-3 polyunsatutrated fatty acids," 페이지 43-76 in Breivik (Ed.), Long-Chain Omega-3 Specialty Oils, The Oily Press, P.J. Barnes & Associates, Bridgewater UK, 2007 참조.
추가적인 오일은 피마자 오일(castor oil), 옥수수 오일, 면씨 오일, 올리브 오일, 피넛 오일, 홍화씨 오일, 참기름, 대두 오일, 경화 대두 오일 및 경화 식물성 오일과 같이 일반적으로 긴 사슬 트리글리세리드로 알려진 트리글리세리드 식물성 오일; 코코넛 오일 또는 팜 오일(palm seed oil)로부터 유래되는 것과 같은 중사슬 트리글리세리드, 모노글리세리드, 디글리세리드 및 트리글리세리드를 포함한다. 또한 혼합 글리세리드로서, 프로필렌 글리콜의 카프릴릭(caprylic)/카프릭(capric)산의 혼합 디에스테르, 프로필렌 글리콜의 포화 코코넛 및 팜핵유(palm kernel oil)-유래된 카프릴릭, 리놀레, 숙신 또는 카프릭 지방산의 에스테르와 같은 프로필렌 글리콜의 에스테르와 같은 다른 오일이 있다.
상기 지방산 오일 혼합물의 지방산은 예를 들어 에틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르로 에스테르화될 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 지방산은 모노-, 디- 및 트리글리세리드로부터 선택되는 것과 같은 글리세리드 형태이다. 다른 실시예에 있어서, 상기 지방산은 유리산 형태이다.
지방산 오일 혼합물의 불포화 지방산은 시스 및/또는 트렌스 형태일 수 있다.
all-시스 형태인 오메가-3 지방산의 예는 (all-Z)-9,12,15-옥타데카트리엔산(ALA), (all-Z)-6,9,12,15-옥타데카테트라엔산(STA), (all-Z)-11,14,17-에이코사트리엔산(ETE), (all-Z)-8,11,14,17-에이코사테트라엔산(ETA), (all-Z)-,7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(DPA), (all-Z)-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA), (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA) 및 (all-Z)-6,9,12,15,18-헤네이코사펜타엔산(HPA)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. all-시스 형태인 오메가-6 지방산의 예는 (all-Z)-4,7,10,13,16-도코사펜타엔산(오스본드산), (all-Z)-9,12-옥타데카디엔산(리놀레산), (all-Z)-5,8,11,14-에이코사테트라엔산(AA), 및 (all-Z)-6,9,12-옥타데카트리엔산(GLA)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시스 형태인 단일불포화 지방산의 예는 (Z)-9-헥사데센산(팔미토레산), (Z)-9-옥타데센산 (올레산), (Z)-11-옥타데센산(바세닉산), (Z)-9-에이코센산(가돌레산), (Z)-11-에이코센산 (곤도산), (Z)-11-에이코센산, (Z)-11-도코센산(세톨레산), Z-13-도코센산(에루크산) 및 (R-(Z))-12-히드록시-9-옥타데센산(리시놀레산)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 지방산 오일 혼합물의 예는 유럽 약전(European Pharmacopoeia) 오메가-3 산 에틸 에스테르 60, 유럽 약전 오메가-3 산이 풍부한 어유 논문, USP 어유 논문, 유럽 약전 오메가 -3 산 트리글리세리드, 유럽 약전 오메가-3-산 에틸 에스테르 90 및 USP 오메가-3-산 에틸 에스테르 논문에서 정의된 지방산을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
서로 다른 지방산을 포함하는 지방산 오일 혼합물의 상용화된 예는, Incromega™ TG7010 SR, Incromega™ E7010 SR, Incromega™ TG6015, Incromega™ EPA500TG SR, Incromega™ E400200 SR, Incromega™ E4010, Incromega™ DHA700TG SR, Incromega™ DHA700E SR, Incromega™ DHA500TG SR, Incromega™ TG3322 SR, Incromega™ E3322 SR, Incromega™ TG3322, Incromega™ E3322, Incromega™ Trio TG/EE 와 같은 Incromega™ (Croda International PLC, Yorkshire, 영국) 오메가-3 해양유 농축액; EPAX6000FA, EPAX5000TG, EPAX4510TG, EPAX2050TG, EPAX5500EE, EPAX5500TG, EPAX5000EE, EPAX5000TG, EPAX6000EE, EPAX6000TG, EPAX6500EE, EPAX6500TG, EPAX1050TG, EPAX2050TG, EPAX6015TG/EE, EPAX4020TG 및 EPAX4020EE (EPAX는 Trygg Pharma AS의 전액 출자된 자회사); 약제학적 제품으로 완성된 Omacor®/Lovaza™/Zodin®/Seacor®, K85EE, AGP　103, K30EE, K50EE 및 K70EE (Pronova BioPharma Norge AS); MEG-3® EPA/DHA 어유 농축액(Ocean Nutrition Canada); DHA FNO "기능 영양학적 오일" 및 DHA CL "Clear Liquid" (Lonza); Superba™ 크릴 오일(Aker Biomarine); Martek 에 의해 제조된 DHA를 포함하는 오메가-3 제품; Neptune 크릴 오일(Neptune); Møllers 에 의해 제조된 코드리버(cod-liver) 오일 제품 및 항-환류(anti-reflux) 어유 농축액(TG); Lysi 오메가-3 어유; Seven Seas Triomega® 코드리버 오일 혼합물 (Seven Seas); Fri Flyt 오메가-3 (Vesteralens); 및 에파델(Mochida)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 상용화된 예는 해양, 조류, 미생물(단세포) 및/또는 식물성 소스로부터 오메가-3 지방산(들)을 얻기 위한 제조 공정 또는 방법의 트렌스에스테르화에 의한 결과로서 다양한 오메가-3 지방산, 혼합물 및 다른 성분을 제공한다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 지방산 오일 혼합물은 EPA 및/또는 DHA와 같은 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 포함한다. 적어도 하나의 실시예에 있어서, 상기 지방산 오일 혼합물은 EPA 및 DHA를 포함한다. 상기 지방산 오일 혼합물은 예를 들어, EPA 및 DHA가 아닌 다른 다중불포화 지방산(PUFA)와 같은 적어도 하나의 지방산을 더 포함할 수 있다. 상기 PUFA의 예는 EPA 및 DHA가 아닌 C20-C22 오메가-3 지방산 및 오메가-6 지방산과 같은 다른 오메가-3 지방산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 상기 공정은 C22:5n-3 (n-3 DPA)의 농축액을 제조한다.
오메가-3 지방산(들)을 농축하는 공정
본 발명의 몇몇 실시예는 지방산 오일 혼합물로부터 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 농축하는 공정에 관한 것이다.
일 실시예에 따르면, 상기 공정은 지방산 오일 혼합물 및 질산은 염(AgNO3) 용액과 같은 수용성 은 염 용액을 혼합하는 것을 포함한다. 비록 본 발명은 AgNO3에 초점을 두었으나, 통상의 기술자들은 테트라플루오르붕산 은 염과 같은 다른 적합한 은 염이 사용될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 은 이온은 예를 들어 EPA 및/또는 DHA인 오메가-3 지방산과 같은 지방산 오일 혼합물 내의 다중불포화 지방산과 복합체를 형성할 수 있다. 이에 따라 생성된 은 복합체(들)은 수용성상에 남아있을 수 있으며, 반면 지방산 오일 혼합물 내에 존재하는 다른 지방산(예를 들어, 포화 지방산, 짧은-사슬 지방산, 단일불포화 지방산 및/또는 복합체화된 PUFA보다 적은 수의 이중결합을 가지는 다른 불포화 지방산)은 용해되지 않은 지방산으로서 유기상에 남아있을 수 있다.
예를 들어, AgNO3 용액인 은 염 용액의 농도는 약 60 중량% 내지 약 80 중량%와 같은 약 10 중량% 내지 약 90 중량%의 범위일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예에 있어서, 수용성 AgNO3 용액의 농도는 약 60 중량%, 약 70중량%, 약 75 중량% 또는 약 80 중량%이다. 몇몇 실시예에 있어서, AgNO3(s)에 대한 지방산 오일 혼합물의 중량비는 적어도 0.4 이다. 예를 들어, 몇몇 실시예에 있어서, AgNO3에 대한 지방산 오일 혼합물의 중량비는 약 0.4 내지 약 1.6이다. 지방산 오일 혼합물 및 AgNO3 용액은 상온(예를 들어, 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃), 예를 들어, 약 -25 ℃ 내지 약 20 ℃의 냉각에 의해 상온보다 낮은 온도 또는 예를 들어, 약 25 ℃ 내지 약 90 ℃인 상온보다 높은 온도에서 혼합될 수 있다.
극성 유기 용매와 같은 적어도 하나의 유기 용매는 지방산 오일 혼합물과 AgNO3 용액을 혼합하기 전 및/또는 후에 첨가될 수 있다. 적합한 유기 용매의 예는 에탄올 및 메탄올과 같은 알코올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 극성 유기 용매의 첨가는 지방산 오일 혼합물로부터 수용성 AgNO3 용액으로의 지방산의 용해도를 증가시킬 수 있다.
지방산 오일 혼합물 및 AgNO3 용액은 수중유적형(oil-water) 에멀젼과 같은 유기상 및 수용성상을 생성하기 위해 일반적으로 수분 내지 수시간, 예를 들어 약 15 분 내지 약 2 시간 동안 혼합될 수 있다. 통상의 기술자들은 필요한 혼합 시간이 포함된 부피 및 혼합의 효율성에 따라 결정된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 미세반응기에 의해 제조되는 슬러그 유동(slug flow)에 있어서, 수용성 질산은염 용액에서 DHA 에틸 에스테르 및 EPA 에틸 에스테르를 추출할 때 평형에 도달하기 위해 20초 미만이 요구될 것이다(Seike et al. (2007) Journal of Chemical Engineering of Japan, Vol. 40, pp 1076-1084). 저효율성의 혼합을 수반하는 큰 부피에 대하여, 수용성 은 이온 용액에서 지방산의 전이 및 복합체화는 평형에 도달하기 위해 예를 들어 2 시간 이상의 상당히 긴 시간이 필요할 것이다.
침강하자마자, 유기상 및 수용성상은 공지된 기술에 따라 분리될 수 있다. 예를 들어, 상의 분리는 원심분리, 막 기술 또는 다른 적합한 수단에 의해 실질적으로 2 개의 전이상을 얻기 위해 충분한 시간 동안 혼합물을 둠으로써 일어날 수 있다.
유기상을 제거한 후, 적어도 하나의 추출물을 형성하기 위해 수용성상은 유기 용매와 같은 전이 액체로 추출될 수 있다. 예를 들어, 전이 액체는 오메가-6 지방산 및/또는 EPA 및 DHA가 아닌 다른 오메가-3 지방산과 같은 특정 지방산을 우선적으로 제거함에 따라 증가된 선택성을 제공할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 전이 액체는 수용성상 내의 지방산의 상대적인 용해도에 영향 및/또는 은 복합체와의 상호작용을 통해 선택성을 제공할 수 있다. 몇몇 예에 있어서, 전이 액체는 은 이온과 복합체를 형성하지 않거나 농축되는 오메가-3 지방산보다 은 이온과 약한 복합체를 형성하는 것들이 선택될 수 있다. 적합한 전이 액체의 예는 알칸, 알켄, 사이클로알칸, 사이클로알켄, 디엔, 방향족성 물질 및 할로겐화된 용매를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시예를 구성하는 비제한적인 예로 디클로로메탄 및 하나 이상의 염소 원자 및/또는 하나 이상의 다른 할라이드를 포함하는 다른 용매, 헥산, 헥센, 헵탄, 헵텐, 사이클로헥산, 사이클로헥센, 1,7-옥타디엔, 1,5-사이클로옥타디엔과 1, 2 또는 3개의 이중결합을 포함하는 알켄과 같은 하나 이상의 이중결합을 포함하는 알켄 및 케톤 및 아마이드/아민과 같이 산소 및 질소를 포함하는 용매가 있다. 수용성상은 1회 이상, 즉 적어도 2회의 연속적인 추출로 추출될 수 있다. 각 추출에 대한 전이 액체의 양은 수용성 은 이온상 내에 용해되어 있는 지방산 오일 혼합물의 중량대비 약 0.1 배 내지 약 5 배일 수 있다.
서로 다른 전이 액체 및/또는 전이 액체의 조합은 하나 이상의 특정 오메가-3 지방산을 농축하기 위해 요구되는 선택성에 따라 사용될 수 있다.
수용성상 및 유기상은 서로 분리되기 전에 가열될 수 있다. 상기의 경우, 유기상의 끓는점은 적절한 온도를 결정하기 위해 고려될 수 있다. 일반적으로, 수용성상/유기상 혼합물은 약 30 ℃ 내지 약 90 ℃의 온도 범위에서 가열될 수 있다.
몇몇 실시예에 있어서, 수용성상은 적어도 하나의 추출물을 생성하기 위해 유기상을 제거한 후 가열될 수 있다. 예를 들어, 90 ℃. 수용성상은 약 30 ℃ 내지 약 90 ℃ 범위의 온도와 같이 적어도 30 ℃의 온도로 가열될 수 있다. 상기의 경우, 가열은 수용성상으로부터 오메가-6 지방산 및/또는 EPA 및 DHA가 아닌 다른 C20 ~ C22 오메가-3 지방산과 같은 특정 오메가-3 지방산으로 농축된 지방산 오일 혼합물의 방출을 야기할 수 있다. 가열은 다중불포화 지방산의 산화, 이성질체화 및/또는 분해를 방지하기 위해 산소 결핍 및 충분히 온화한 조건에서 조심스럽게 수행되어야 한다.
추가 공정에 따르면, 수용성상은 AgNO3 복합체(들)을 분리하여 지방산 농축액, 즉 적어도 하나의 오메가-3 지방산으로 농축된 지방산 오일 혼합물을 방출하기 위해 물로 희석될 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 수용성상은 1회 이상, 즉 적어도 2회의 연속적인 희석으로 희석된다. 희석에 사용되는 물의 양은 사용되는 고체 질산은염(AgNO3(s))의 중량의 약 1 배 내지 20 배일 수 있다. 정확한 양은 은 이온 농도 및 지방산 오일 혼합물의 특성을 포함하는 복수의 인자에 따라 결정된다. 이에 따라 지방산 농축액은 수용성상으로부터 분리되어 적어도 하나의 용액을 형성할 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 은 이온은 차후의 공정에서 재사용하기 위해 회수될 수 있다. 예를 들어, 은 염은 재사용하기 위해 재생성(예를 들어, 전기분해를 통한 재생성), 여과, 원심분리 및/또는 정제를 통해 회수될 수 있다.
추가 공정에 따르면, 수용성상은 Ag+ 복합체(들)을 분리하여 지방산 농축액 전체 또는 일부분을 방출하기 위해 초임계 압력 조건 하에서 이산화탄소(CO2)로 추출될 수 있다. 이산화탄소는 물 또는 예를 들어, 에탄올인 알코올과 같은 적어도 하나의 극성 변형제(polar modifier)를 포함할 수 있다. 이산화탄소를 통한 추출의 장점은 복합체를 분해하기 위한 다량의 물의 필요성을 제거할 수 있다는 것이다. CO2는 압력을 제거함으로써 에틸 에스테르로부터 쉽게 제거된다. CO2는 비독성이며 활성인 Ag+가 비활성 Ag2O를 생성하는 것을 보호하기 위해 필요한 비활성 가스를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 공정은 지방산 오일 혼합물 내의 적어도 하나의 오메가-6 지방산의 농도를 감소시킴과 동시에 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 농축할 수 있다. 예를 들어, 상기 공정은 지방산 오일 혼합물에 대한 지방산 농축액에 있어서, 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비율을 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 지방산 농축액 혼합물 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비율(n-3/n-6)은 예를 들어 약 80보다 크거나, 약 100보다 크거나, 약 150보다 크거나 약 200보다 큰 것과 같이 약 40보다 클 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산의 총 농도는 예를 들어 약 2 중량% 미만 또는 약 1 중량% 미만과 같이 약 3 중량% 미만일 수 있다.
또한, 본 발명에 개시된 공정은 다른 오메가-3 지방산의 농도를 감소시킴과 동시에 하나 이상의 오메가-3 지방산을 농축할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시예에 있어서, 상기 공정은 EPA 및 DHA가 아닌 다른 C20 ~ C22 오메가-3 지방산의 농도를 감소시킴과 동시에 EPA 및 DHA를 농축한다. 몇몇 실시예에 있어서, 지방산 농축액 내의 EPA 및 DHA가 아닌 다른 C20 ~ C22 오메가-3 지방산의 총 농도는 예를 들어 2.5 중량% 미만, 0.5 중량% 미만과 같이 3 중량% 미만이다.
또한, 본 발명에 개시된 공정은 다른 오메가-3 지방산과 비교하여 하나의 오메가-3 지방산을 상대적으로 많이 또는 적게 농축함으로써 지방산 오일 혼합물 내의 EPA/DHA 비를 조절하는 것을 제공한다. 예를 들어, EPA/DHA 비는 온도, 전이 액체 및/또는 물 희석비의 다양화 및 물 또는 예를 들어, 에탄올인 알코올과 같은 극성 변형제와 또는 극성 변형제 없이 CO2로 추출함으로써 조절될 수 있다. 몇몇 실시예에 있어서, 적어도 하나의 지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및 적어도 하나의 용액 내의 EPA/DHA 중량비는 약 0.1 내지 약 10이다.
지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및/또는 적어도 하나의 용액은 적어도 하나의 정제 공정을 사용하여 정제될 수 있다. 상기 정제 공정은 예를 들어, 잔여 은 화합물, 잔여 전이 액체, 짧은 사슬 지방산(예를 들어, 지방산 16:4n-1), 은 이온과의 복합체화에 따라 농축된 저분자량 화합물, 환경오염물, 콜레스테롤 및/또는 비타민을 제거할 수 있다. 상기 정제 공정은 단형 증류, 분자 증류, 초임계 유체 추출, 효소적 분리 공정, 요오드락토닌화 분획화 및 정제 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 개시된 공정은 적어도 하나의 오메가-3 지방산 및/또는 하나 이상의 다른 오메가-3 지방산을 더 농축하기 위해 반복될 수 있다. 또한, 상기 공정은 적어도 하나의 오메가-6 지방산을 농축하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및/또는 적어도 하나의 용액은 상기에 기재한 바에 따른 하나 이상의 연속적 공정 내의 지방산 오일 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바에 따른 하나 이상의 농축 공정으로부터 얻어진 지방산 농축액은 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 적어도 하나의 오메가-3 지방산과 같이 적어도 80%의 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 개시된 공정으로부터 얻어진 지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및/또는 적어도 하나의 용액은 단형 증류, 분자 증류, 요오드락토닌화 분획화, 효소적 분획화 공정, 추출 및/똔느 크로마토그래피와 같은 적어도 하나의 일반적인 분획화 공정으로 처리될 수 있다. 이에 따라 얻어진 지방산 농축액은 예를 들어 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%의 적어도 하나의 오메가-3 지방산과 같이 적어도 80%의 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에 있어서, 적어도 하나의 분획화 공정은 예를 들어, 적어도 95% DHA 또는 적어도 98% DHA와 같이 적어도 90% (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA)를 포함하는 지방산 농축액을 생성한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 적어도 하나의 분획화 공정은 예를 들어, 적어도 90% DPA, 적어도 95% DPA 또는 적어도 98% DPA와 같은 적어도 80% (all-Z)-7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(DPA)을 포함하는 지방산 농축액을 생성한다. 통상의 기술자는 적어도 하나의 일반적인 분획화 공정을 통해 본 발명의 개시에 따라 얻어진 농축액을 처리하는 것이 예를 들어, 유럽 약전 논문 1250, 오메가-3-산 에틸 에스테르 90 논문 및/또는 USP 오메가-3-산 에틸 에스테르 논문을 준수하는 조성물을 생성할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 개시된 공정은 지방산 오일 농축액, 적어도 하나의 추출물 및/또는 적어도 하나의 용액이 지방산 오일 혼합물보다 낮은 농도의 적어도 하나의 환경오염물을 포함하도록 지방산 오일 혼합물 내의 적어도 하나의 환경오염물의 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 환경오염물은 폴리염화비페닐(PCB) 화합물, 폴리염화 디벤조디옥신(PCDD) 화합물, 폴리염화 디벤조푸란(PCDF) 화합물, 폴리브롬화 디페닐 에테르(PBDE)와 같은 브롬화 난연제, 테트라브로모비스페놀 A(TBBP-A) 및 헥사브로모사이클로도데칸(HBCD) 및 DDT (2,2 비스-(p-클로로페닐)-1,1,1-트리클로로에탄) 및 DDT의 대사물과 같은 살충제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 개시된 공정은 지방산 오일 농축액이 지방산 오일 혼합물보다 낮은 농도의 총 콜레스테롤을 포함하도록 지방산 오일 혼합물 내의 총 콜레스테롤(즉, 유리 및/또는 결합성 콜레스테롤)의 농도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 지방산 오일 혼합물은 예를 들어, 수용성 AgNO3 용액과 혼합하기 전 증류와 같은 적어도 하나의 스트리핑(stripping) 공정 단계에서 스트리핑되며, 여기서 상기 스트리핑 공정 단계는 지방산 오일 혼합물 내의 적어도 하나의 환경오염물 및/또는 총 콜레스테롤의 양을 감소시킨다.
하기의 실시예는 본 명세서를 설명하는 것을 의미하나, 사실상 이에 제한되는 것은 아니다. 통상의 기술자는 여기에 제공된 기재와 일치하는 부가적인 실시예를 실시할 수 있는 것으로 이해된다. 하기의 표에 기재되어 있는 조성물의 수치는 가스 크로마토그래피(GC) 면적비에 근거한다. 통상의 기술자는 GC 면적비는 GC 중량비와 구별된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, GC 면적비는 이에 상응하는 GC 중량비보다 크다. GC 중량비를 분석하는 방법은 유럽 약전 논문 2.4.29, Composition of Fatty Acids in Oils Rich in Omega-3-Acids에 기재되어 있다.
실시예
실시예 1 : 온도
상 분리 전 . K50EE는 약 1.5 시간 동안 70 중량% AgNO3 용액과 혼합(K50EE:AgNO3 = 3:5)되었으며, 원하는 온도로 처리되었다(표 1 참조, 즉, 8 ℃, 21 ℃, 50 ℃, 60 ℃ 또는 70 ℃). 상기 오일/물 혼합물은 수용성상 및 유기상으로 분리하기 위해 약 2시간동안 방치되었으며 유기상은 제거되었다. 수용성상은 유기성 물질, 즉 지방산 농축액의 방출을 야기하기 위하여 물로 희석(물:AgNO3(s) = 약 7.5:1 중량비)되었다. 상기 농축액은 수집되었으며, 이의 조성은 표 1에 나타난 바와 같이 GC 분석(GC 면적%)을 통해 결정되었다. 상기 결과는 고온에서 n-6 지방산 및/또는 특정 n-3 지방산(예를 들어, EPA 및 DHA가 아닌 다른 긴-사슬(LC) 지방산)의 상대적인 농도가 감소된 것을 보여준다.
지방산 농축액의 조성; K50EE:AgNO3 = 다양한 온도에서 3:5로 혼합(GC 면적%)
지방산 에틸 에스테르 K50EE 8°C 21°C 50°C (I) 50°C (II) 60°C 70°C
18:2n-6 1.14 0.27 0.26 0.08 ** 0.03 0.05
18:3n-3 0.62 0.26 0.21 0.11 0.07 0.07 0.05
18:4n-3 1.78 2.08 1.92 1.76 1.80 1.71 1.48
20:4n-6 1.66 1.01 0.84 0.48 0.45 0.40 0.30
20:4n-3 1.19 1.08 0.90 0.62 0.59 0.54 0.43
EPA 32.80 44.53 44.31 45.87 46.57 46.08 44.61
21:5n-3 1.32 1.96 1.77 1.72 1.74 1.68 1.55
22:5n-6 0.62 0.65 0.54 0.40 0.37 0.33 0.25
22:5n-3 4.64 6.64 5.71 5.07 4.98 4.67 4.08
DHA 25.48 34.72 36.69 41.31 41.66 42.50 44.80
EPA + DHA 58.28 79.25 81.00 87.18 88.23 88.58 89.41
∑n-3 70.83 91.27 91.51 96.46 97.41 97.25 97.00
∑n-6 3.42 1.93 1.64 0.96 0.82 0.76 0.60
∑n-3/∑n-6 20.7 47.2 55.8 100 119 128 162
** 0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
상 분리 후 . K30EE는 70 중량% AgNO3 용액(K30EE:AgNO3 = 1.2:1)과 상온에서 교반되었으며, 수용성상 및 유기상으로 분리되었다. 유기상은 제거되었다. 그리고 나서, 수용성상은 본 실시예에 따른 동일한 공정을 사용하여 제조되었으나, 가열하지 않은 농축액("주위 농축액")과 비교하여, n-6 지방산 및 특정 n-3 지방산이 농축된 지방산 농축액("농축액-1")의 방출을 야기하기 위하여 70 ℃로 가열되었다. 수용성상은 제1 농축액과 비교하여 증가된 n-3/n-6 비 및 낮은 농도의 EPA 및 DHA가 아닌 다른 n-3 지방산을 가진 제2 농축액("농축액-2")를 얻기 위하여 물(물:AgNO3(s) = 약 7.5:1 중량비)로 희석되었다. 표2 참조.
지방산 농축액의 조성; 70 ℃로 가열된 수용성상
지방산 에틸 에스테르 K30EE 주위 농축액 농축액-1 농축액-2
16:4n-1 1.24 5.07 3.57 6.74
18:1n-9 11.94 0.73 3.20 -
18:3n-3 0.59 0.07 0.37 -
18:4n-3 2.15 3.31 5.75 2.81
20:4n-6 1.03 0.33 1.29 0.13
20:4n-3 0.50 0.37 1.66 0.20
EPA 18.51 45.36 42.68 45.67
21:5n-3 0.71 1.57 1.96 1.44
22:5n-6 0.3* 0.35 1.01 0.21
22:5n-3 2.29 3.69 6.58 2.94
DHA 12.21 34.81 15.75 38.51
EPA+DHA 30.72 80.17 58.43 84.18
∑n-3 36.96 89.18 74.75 91.57
∑n-6 1.3 0.68 2.30 0.34
∑n-3/∑n-6 28 131 32.5 269
*피크 크기로부터 측정됨
도 1 및 2는 농축액-1 및 농축액-2 각각에 대한 가스 크로마토그래피를 보여준다. 도 1 및 2의 비교는 본 발명에 개시된 공정이 출발 혼합물과 비교할 때 더 적은 양의 특정 지방산을 가진 농축액을 제조하기 위해 지방산 화합물을 선택적으로 제거(예를 들어, 도 2)하는 것을 나타낸다.
수용성상의 고염 농도는 녹는점을 감소시켜서 상기에 기재된 것과 유사한 분리 공정이 0 ℃ 미만의 온도에서 잘 수행될 수 있도록 한다. 또한, 수용성상 내의 다중불포화 지방산/지방산 유도체의 함량 역시 녹는점의 추가 감소를 야기할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 공정에 따라 수행될 때, 실험은 -20 ℃에서 수용성상의 어떠한 고체화 또는 부분 고체화를 발생시키지 않으면서 70% 수용성 질산은 염 용액으로 수행되었다. 아마도 상기 온도는 보다 더 감소될 수 있을 것이다. 통상의 기술자는 상기 온도의 감소는 상기에 언급된 바에 따른 온도 조절 공정의 기술적 가치를 증가시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
기술분야에서 저온이 EPA 및 DHA 에틸 에스테르의 회수를 촉진시킨다는 것이 알려져 있다(Seike et al. (2007) Journal of Chemical Engineering of Japan, Vol. 40, pp 1076-1084). 다만, 표 2에 기재된 바와 같이 온도 조절이 지방산 유도체를 분리하기 위해 사용될 수 있다는 것, 예를 들어, n3/n6 비율의 변경하는 것, EPA및 DHA가 아닌 다른 지방산(예를 들어, 22:5n-3)의 분리를 위한 출발 물질로서 적합한 중간체를 제조하는 것 및 적은 양의 다른 긴-사슬 오메가-3 지방산을 포함하는 EPA 및 DHA 농축액를 제조하는 것, 은 기술분야에 알려져 있지 않았다.
실시예 2A : 전이 액체로 추출
K30EE는 70 중량% AgNO3 용액(K30EE:AgNO3(s) = 1.2:1)과 주위 온도에서 교반되었다. 혼합물은 안정되었으며 유기상이 제거되었다. 수용성상은 1-헥센(헥센 : AgNO3(s) = 약 0.54 : 1 중량비)으로 추출되었으며 물(물:AgNO3(s) = 약 7.5:1 중량비)로 희석되었다. 희석에 의해 방출된 지방산 농축액은 수집되었으며 GC로 분석되었다. 표 3 참조.
지방산 농축액의 조성; 헥센 추출
지방산 에틸 에스테르 농도
(GC 면적 %)
16:4n-1 5.21
18:3n-3 **
18:4n-3 0.22
20:4n-6 **
20:4n-3 0.02
EPA 40.14
21:5n-3 1.04
22:5n-6 **
22:5n-3 1.37
DHA 50.16
EPA + DHA 90.30
∑n-3 92.95
∑n-6 **
∑n-3/∑n-6 ∞≠
∑"다른 C20-C22 n-3" 2.43
**0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
≠0.05% 초과의 면적을 가진 피크만 포함
표 4는 서로 다른 전이 액체의 비교를 나타낸다:유기 용매 헥산, 1-헥센 및 사이클로헥센. 하기의 공정은 3가지 용매 모두에서 수행되었다. 약 30.2 g의 AgNO3 는 70 중량%의 AgNO3 용액을 제조하기 위해 12.9 g 물 내에 용해되었다. 상기 용액은 약 24.1 g K30EE와 함께 70 ℃에서 교반되었다. 상 분리는 70 ℃에서 수행되었으며, 유기상(약 17.1 g 내지 17.7 g)은 제거되었다. 그리고 나서, 수용성상은 4가지 부피의 용매로 추출되었다(각각 4 × 15.8 ml 헥산, 4 × 16.1 ml 헥센, 4 × 19.5 ml 사이클로헥센). 표 4에 기재된 각 용매에 대하여 "추출물"로 기재되어 있다. 남아있는 수용성상은 225 ml 물로 희석되었으며, 암 조건의 상온에서 하룻밤 동안 방치되었다. 수용성상으로부터 회수된 지방산 농축액이 분리되었으며, 표 4에 기재된 각 용매에 대하여 "농축액"으로 기재되어 있다. 조성은 GC 면적%로 기록되었다.
헥산에 의해 생성된 추출물의 GC 크로마토그램은 도 3에 나타나 있다. 표 4에 기재된 바에 따른 GC 면적으로부터 볼 수 있듯이, 헥산에 의해 생성된 추출물에 대하여 DPAn-3/DHA의 비는 약 3.3:1이며, DPAn-3/DPAn-6의 비는 약 3.0:1이다. 여기서, 소위 "요오드락토닌화 반응" (Breivik 2007 참조)이 다중불포화 지방산을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 적당한 양의 시약을 첨가함으로써, 더 안정한 DHA 및 DPAn-6의 5-고리 요오드-γ-락톤이 생성됨과 동시에 DPAn-3는 실질적으로 영향을 받지 않고 남아있을 수 있다. DHA 및 DPAn-6의 요오드락토레이트는 반응하지 않은 지방산으로부터 제거될 수 있다. 도 3과 유사한 지방산 조성물에 있어서, 요오드락토닌화 반응은 오직 22개의 탄소 원자의 사슬 길이를 가진 지방산으로서 DPAn-3 (22:5n-3)만을 실질적으로 포함하는 지방산 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 상기 생성물이 순수한 DPAn-3을 제조하기에 상당히 적합하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
지방산 농축액의 조성; 전이 액체 헥산, 1-헥센, 사이클로헥센. K30EE는 표 2에 따른 동일한 배치(batch)로부터 비롯되었다.
K30EE 헥산 1-헥센 사이클로헥센
지방산 에틸 에스테르 추출물 농축액 추출물 농축액 추출물 농축액
16:4n-1 1.398 4.393 4.636 4.679 4.886 5.167
18:3n-3 1.019 ** 0.297 ** 0.167 **
18:4n-3 7.608 1.905 9.824 1.792 6.584 0.936
20:4n-6 3.242 ** 1.782 ** 0.735 **
20:4n-3 2.801 ** 1.813 ** 0.854 **
20:5n-3 (EPA) 13.43 47.316 42.263 46.44 53.469 40.536
21:5n-3 0.857 1.547 2.12 1.522 2.327 1.117
22:5n-6 1.734 0.136 1.435 0.174 0.841
22:5n-3 5.288 2.961 8.818 2.979 7.069 1.583
22:6n-3 (DHA) 1.603 40.755 6.82 41.51 14.595 50.441
EPA+DHA 15.033 88.071 49.083 87.95 68.064 90.977
∑ n-3 32.606 94.484 71.955 94.243 85.065 94.613
∑ n-6 4.976 0.136 3.217 0.174 1.576 0
∑ n-3/n-6 6.6 694 22 541 53 ∞≠
다른 n-3 17.573 6.413 22.872 6.293 17.001 3.636
다른 LC n-3 8.946 4.508 12.751 4.501 10.25 2.7
(EPA+DHA)/다른 LC n-3 1.7 20 3.8 20 6.6 34
**0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
≠0.05% 초과의 면적을 가진 피크만 포함
표 4에 나타난 바와 같이, 3개의 모든 농축액은 94% 이상의 n-3 지방산을 포함하였으나, 서로 다른 n-3 및 n-6 지방산의 상대 농도는 상당히 다양했다. 헥산은 최종 생성물 내의 EPA 또는 DHA의 실질적인 손실(약 15%의 손실)없이 n-6 지방산 및 DHA가 아닌 다른 n-3 지방산의 상대적인 제거에 매우 효과적인 용매였다. DPA(n-3) : DHA = 3.3 : 1의 높은 비율은 헥산 추출물이 DPA(n-3)의 정제에 적합할 수 있다는 것을 시사한다. 유사하게, (EPA+DHA) : (다른 LC n-3)의 비율에 대하여 1.7의 낮은 수치는 헥산 추출물이 상대적으로 높은 함량의 다른 LC 오메가-3 지방산을 가진 농축액의 제조에 적합할 수 있다는 것을 나타낸다. 헥센 추출물은 DPA(n-3) : DHA의 비가 약 1 : 1로 헥산 추출물보다 더 높은 n-3 지방산의 총 농도를 포함하였다. 또한, 상기 헥센 추출물은 상기 농축액 및 개별적인 순수 지방산 에스테르를 제조하기에 적합한 조물질일 수 있다. 사이클로헥센은 다른 용매보다 낮은 농도의 n-6 지방산(n-6 지방산이 실질적으로 존재하지 않았음)을 제공하였으며, EPA 및 DHA가 아닌 다른 n-3 지방산이 적었으나, 최종 생성물 내의 EPA 및 DHA의 낮은 수득률(약 68%의 손실)을 제공하였다. 농축액 내의 EPA+DHA의 합은 약 91.0% 인데 반하여, C20-C22 n-3 지방산("다른 LC n-3")의 합은 단지 2.7% 였다.
표 3 및 4의 결과는 온도의 다양화 및 출발 지방산 혼합물 및 용매의 서로 다른 상대적인 양의 사용이 얻어지는 농축액의 조성에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 표 3에 기재된 결과는 표 4에 따른 것과 동일한 부피의 K30EE 및 1-헥센을 사용하였으나, 70 중량% AgNO3 용액 부피의 2/3 만을 사용하여 얻어졌다. 사용된 온도는 또한 달랐다(상온 vs 70 ℃)
또한, 실험은 1,7-옥타디엔으로 수행되었다; 다만, 상기 용매는 심한 발열 반응을 유발한다. 상기 발열 반응은 은 이온에 대한 사이클로옥타디엔 및 다른 디엔/폴리엔의 강한 친화성을 나타내어, 충분한 안전 조치가 적용되어 제공된 상기 화합물들이 전이 액체로서 유용할 수 있도록 한다. 표 5에서 실시예 2B 참조.
실시예 2B : 전이 액체 사용에 대한 추가 실시예
표 5에 기재된 유기 용매로 많은 실험이 수행되었다. 각 실험에 대하여 하기의 시약 및 에틸 에스테르 출발 물질의 대략적인 양이 사용되었다: 70% 농도로 물(25.7 g 물)에 용해된 60 g 질산은 염 및 48 g K30EE 에틸 에스테르(배치 2101071). 정확한 양과 회수된 추출물의 양은 표 6에 기재되어 있다.
상온에서 1.5 시간 동안 자석교반기로 교반한 후, 수용성 질산은 염 용액 및 K30EE의 각 혼합물은 분별깔때기로 옮겨졌고, 상 분리가 일어날 때까지 암 조건에서 방치되었다. 상부 유기상("용해되지 않은 에스테르")이 제거되었다. 분석하기 위한 샘플이 일련의 첫번째 실험을 위해 수집되었다.
일련의 첫번째 실험을 제외하면, 수용성상은 용매의 세 부분으로 추출되었다. 각 부분은 약 0.36 몰의 용매를 포함하였다. 용해되지 않은 에스테르의 제거 후에 수용성상에 남아있는 에틸 에스테르는 약 20 g으로 측정되었다. 상기 0.06 mol에 해당하는 상기 20 g의 에틸 에스테르의 측정된 평균 분자량은 330 g/mol이다. 이는 각 추출물이 본래 수용성상에 용해된 에틸 에스테르와 비교하여 6배의 몰랄 과잉으로 측정된 용매로 수행되었음을 의미한다. 표 5 참조.
추출이 완료된 후, 600 ml의 물은 수용성상으로 첨가되었으며, 격렬한 교반 후에 상기 혼합물은 새로운 상 분리를 완료시키기 위해 암 조건에서 하룻밤 동안 방치되었다.
용매를 포함하는 모든 추출물은 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 증발되었다. 추출물의 검량 후에, 샘플이 분석되었다.
선택된 지방산 에틸 에스테르로부터의 분석 결과는 표 6에 기재되어 있다.
용매의 양
추출 용매 밀도 (g/ml) 분자량 (g/mol) 3가지 추출물 각각에 대한 용매의 대략적인 중량 (g) 3가지 추출물 각각에 대한 용매의 대략적인 부피 (ml) 각 추출물 및 총 추출물에 대한 몰수
1. 없음 - - - - -
2. 헥산 0.66 86.2 31.3 47.3 0.36 (1.09)
3. 1-헥센 0.673 84.2 30.6 45.5
4. 사이클로헥센 0.811 82.1 29.8 36.7
5. 디클로로메탄 1.335 84.9 30.8 23.1
6. 1,5-사이클로옥타디엔 0.882 108.2 39.3 1
7. 아세톤 0.788 58.1 21.1 2
1수용성 질산은 염을 포함하는 상으로 1,5-사이클로옥타디엔의 첨가는 발열 반응을 유발하며, 안정상의 이유로 실험이 중단되었다. 다만, 상기 발열반응은 은 이온에 대한 사이클로옥타디엔 및 다른 디엔/폴리엔의 강한 친화성을 나타내어, 충분한 안전 조치가 적용되어 제공된 상기 화합물들이 전이 액체로서 유용할 수 있도록 한다.
2아세톤의 첨가는 상 분리를 유발하지 않는다. 예를 들어, 아세톤과 다른 용매를 혼합하거나 아세톤이 아닌 다른 케톤을 사용하는 추가 실험이 수행될 수 있다.
시약, 출발 물질 및 추출물의 중량(g)1
용매 AgNO 3 H 2 O K30EE 용해되지 않은 에스테르 추출물 농도 회수된 물질의 합 총 수득률 (%)
A B C
없음 60.6 26.0 48.7 28.2 18.5 46.7 96
헥산 60.1 25.4 48.1 29.2 1.17 0.96 0.72 13.8 45.9 95
1-헥센 60.5 25.3 48.1 32.0 1.41 0.87 0.68 11.0 45.9 96
사이클로헥센 60.2 25.1 49.1 29.0 4.55 3.50 1.59 9.48 48.1 98
CH2Cl2 60.1 25.3 48.1 26.3 8.40 3.00 1.92 6.16 45.8 95
1작은 부피로 분리된 추출물의 중량을 얻는 것은 어렵다. 몇몇 물질은 불가피하게 유리 기구의 표면 상에서 손실되며, 수용성상으로부터의 오염을 방지하기 어렵다. 통상의 기술자는 다양한 추출물의 중량과 총 수득률에 대하여 약간의 불확정성이 존재함을 이해할 수 있을 것이다.
선택된 지방산 에틸 에스테르에 대한 GC 결과(보정된 면적 퍼센트). CF = "농도 인자", 즉, K30EE의 상대적인 GC 면적으로 나눠진 농축액의 상대적인 GC 면적
용매
(fraction) 		부분 16:
4n-1 		18:
3n-3 		18:
4n-3 		19:5 20:
4n-6 		20:
4n-3 		EPA 21:
5n-3 		22:
5n-6 		22:
5n-3 		DHA
- K30EE 2.0 0.6 2.4 nd 1.0 0.8 18.7 0.7 0.4* 2.2 12.6
없음 용해되지 않은 에스테르 0.2 0.7 1.0 0.3 1.0 0.6 1.7 0.1 0.3 0.5 0.6
농도 3.6 0.2 4.2 0.2 0.7 0.7 39.4 1.5 0.6 4.3 27.2
CF 1.8 0.3 1.8 - 0.7 0.9 2.1 2.1 1.5 2.0 2.2
헥산 A 7.5 0.4 13.8 0.2 4.8 4.9 30.3 1.8 2.8 10.0 3.7
B 4.5 0.4 14.5 0.1 2.1 2.8 39.0 2.4 2.2 11.4 4.7
C 4.9 0.3 13.4 0.0 1.4 1.9 42.8 2.5 1.7 11.3 5.2
농도 4.6 0.0 2.3 0.2 0.1 0.1 42.7 1.4 0.2 2.9 34.1
CF 2.3 0 1.0 - 0.1 .1 2.3 2.0 0.5 1.3 2.7
1-헥센 A 4.5 0.3 12.0 0.1 2.6 2.9 39.1 2.1 1.8 8.6 6.5
B 2.5 0.3 12.1 0.2 1.6 2.1 46.4 2.4 1.6 9.2 7.9
C 5.3 0.2 11.0 0.2 0.7 1.3 49.6 2.5 1.2 8.9 8.5
농도 5.2 0.0 2.2 0.2 0.0 0.0 46.5 1.5 0.2 3.0 40.4
CF 2.6 0 0.9 - 0 0 2.5 2.1 0.5 1.4 3.2
사이클로헥센 A 2.3 0.3 6.5 0.2 1.8 1.8 27.6 1.4 1.2 5.7 6.5
B 3.3 0.3 6.8 0.1 1.0 1.2 37.3 1.8 0.9 6.2 9.7
C 4.9 0.1 7.3 0.2 0.5 0.8 52.1 2.3 0.8 7.1 14.5
농도 5.5 0.0 1.9 0.2 0.0 0.1 43.9 1.4 0.1 2.3 43.9
CF 3.3 0 0.8 - 0 0.1 2.3 2.0 0.3 1.0 3.5
디클로로메탄 A 2.5 0.2 6.0 0.2 1.5 1.4 22.2 1.2 1.0 4.7 3.7
B 6.7 0.2 7.8 0.2 0.5 0.9 55.9 2.7 0.9 8.4 10.2
C 7.8 0.0 4.3 0.2 0.1 0.2 63.4 2.7 0.4 6.0 13.0
농도 3.5 0.0 0.4 0.2 0.0 0.0 39.1 0.9 0.0 0.9 54.8
CF 1.8 0 0.2 - 0 0 2.1 1.3 0 0.4 4.3
*피크 사이즈에 근거한 측정
nd : 측정되지 않음
전이 액체인 디클로로메탄을 사용한 실험. 선택된 지방산 에틸 에스테르에 대한 GC 결과(보정된 면적 퍼센트). CF = "농도 인자", 즉, K30EE의 상대적인 GC 면적으로 나눠진 농축액의 상대적인 GC 면적
부분
(중량, g) 		CH 2 Cl 2
부피 (ml) 		16:
4n-1 		18:
3n-3 		18:
4n-3 		19:5 20:
4n-6 		20:
4n-3 		EPA 21:
5n-3 		22:
5n-6 		22:
5n-3 		DHA
K30EE - 2.0 0.6 2.4 nd 1.0 0.8 18.7 0.7 0.4* 2.2 12.6
A (6.75) 8.0 1.0 0.8 3.5 nd 1.6 1.2 8.0 0.3 0.6 2.2 1.2
B (1.88) 8.0 4.3 0.5 10.9 nd 2.0 2.2 37.0 1.9 1.5 7.5 6.2
C (1.72) 8.0 6.1 0.2 11.5 0.2 1.1 1.6 50.8 2.6 1.4 9.4 8.6
D (2.73) 23.1 7.6 0.1 7.6 0.2 0.2 0.5 59.0 2.8 0.7 8.3 10.4
E (1.77) 23.1 8.4 0.0 4.0 0.2 0.1 0.2 63.4 2.6 0.3 5.8 12.7
농도
(6.34)		 3.7 0.0 0.4 0.2 0.1 0.0 39.0 0.9 0.1 0.9 53.8
CF 1.9 0 1.7 - 0.1 0 2.1 1.3 0.3 0.4 4.3
*피크 사이즈에 근거한 측정
nd : 측정되지 않음
표 7에서 볼 수 있듯이, 서로 다른 방법 내에서 다양한 용매가 전이 액체로서 사용되었다. 하기의 고찰은 수많은 가능성 중에서 오직 일부만이 다양한 지방산 에틸 에스테르(또는 에틸 에스테르의 조합)의 농축액을 위한 조물질의 제조에 사용되는 용매임에 주목하고 있다. 통상의 기술자는 다양한 지방산 에틸 에스테르 또는 지방산 에틸 에스테르의 조합을 위한 조물질을 제조하기 위해 보여진 가능성의 결과를 이해할 수 있을 것이다.
헥산은 DHA와 비교하여 DPA (22:5n-3)가 풍부한 부분의 생성이 가능한 유용한 성질을 가지고 있어, (20:4n-3이 풍부한 농축액의 제조를 위한 표의 수치로부터)DHA의 농축액의 제조에 유용함이 발견된 것에 반하여, 예를 들어, 디클로로메탄(CH2Cl2)은 적은 양의 다른 n-3 지방산과 낮은 수치의 n-6 지방산을 포함하는 EPA 및 DHA의 농축액의 제조에 수월하게 적용될 수 있을 것이다. 또한, 다른 전이 액체와 비교할 때, CH2Cl2 는 고도로 불포화된 지방산 16:4n-1의 상대적인 양을 감소시키는 효과를 가지고 있었다. 따라서, CH2Cl2 또는 유사한 효과를 가지는 전이 액체는 사슬 길이에 따라 작용하는 추가적인 분리 기술로 16:4n-1을 감소시킬 필요성을 제거할 수 있기 때문에, EPA 및 DHA의 고농축액의 제조에 적합할 수 있다. 분자 증류/단형 증류는 일반적으로 사슬 길이에 따른 분리 기술로 사용된다. 다만, 상기 기술의 분리능은 보통으로, 분자 증류/단형 증류에 의한 16:4n-1 지방산의 제거는 원하는 지방산의 손실 역시 야기할 수 있다. 따라서, 다른 전이 액체와 비교할 때, 16:4n-1의 함량을 감소시키기 위한 CH2Cl2 와 같은 전이 액체를 사용하는 것이 유용하다.
표 6은 디클로로메탄을 전이 액체로 사용할 때, 제1 부분(부분 A) 내에 상대적으로 많은 양의 에틸 에스테르가 얻어졌음을 나타낸다. 표 8은 전이 액체로 디클로로메탄을 사용한 추가적인 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 공정은 23.1 ml의 CH2Cl2와 제1 추출물이 각각 8 ml의 CH2Cl2과 세 부분으로 치환된 것을 제외하고 표 5 및 6에 주어진 것과 동일하다.
농축액의 최종양(6.34 g)은 CH2Cl2를 사용한 제1 실시예에서 얻어진 것과 유사하였다. 또한, EPA 및 DHA의 농도와 다른 지방산의 농도는 제1 실시예에서 얻어진 것과 매우 유사하였다(표 7 참조). 추출물 A의 조성은 적은 양의 EPA 및 DHA 및 상대적으로 많은 양의 다른 긴-사슬 오메가-3 지방산 및 긴-사슬 오메가-6 지방산을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 적은 부피의 디클로메탄은 EPA 및 DHA의 함량을 늘리고, 다른 긴-사슬 n-3 지방산 및 긴-사슬 n-6 지방산의 함량을 감소시키기 위해 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. CH2Cl2의 양을 변화시킴에 따라, 추출물 또는 농축액으로서 서로 다른 조성물을 얻을 수 있을 것이다. 상기 실시예의 정보로부터, 출발 물질의 양 및 농도에 대하여 CH2Cl2 를 특정 비율로 사용함으로써, 특정 지방산 함량을 가지는 조성물을 얻을 수 있을 것이다. 표 8 및 표 7에서 볼 수 있듯이, 많은 양의 CH2Cl2 를 사용한 추가적인 추출은 다른 긴-사슬 n-3 지방산 및 긴-사슬 n-6 지방산을 제거하였으며, 물로 희석한 후 90% 이상의 EPA+DHA의 에틸 에스테르(GC 면적%)가 포함된 농축액을 생성하였다. 따라서, 중간 추출물은 상기 긴-사슬 n-3 및 n-6 지방산이 풍부한 부분을 생성하기에 유용한 출발 물질임을 나타낸다. 또한, 중간 생성물은 예를 들어, Epadel 제품과 같이 고농도의 EPA를 포함하는 제품을 제조하기 위한 중간체로서 유용하게 해주는 EPA가 농축되어 있었다.
도 5는 동일하게 선택된 지방산 에스테르의 에틸 에스테르의 상대적인 농도를 나타내는 컬럼을 가지는 표 8과 동일한 데이터를 나타낸다. 도 및 표로부터, 전이 액체로서 CH2Cl2 를 사용한 지방산 에틸 에스테르의 제거의 용이성에 대한 "우열 순서"는 특정 성분의 최대 추출물이 얻어졌을 때 K30EE 및 추출물 A의 상대적인 농도 비와 추출물 E 및 최종 농축액의 상대적인 농도 사이의 비를 비교하여 예측될 수 있다.
상기 "우열 순서"는 하기와 같다:
18:3n-3 > 20:4 n-6 >22:5n-6 > 20:4n-3 > 18:4n-3 > 22:5n-3 > 21:5n-3 > 16:4n-1 > EPA > DHA
19:5 지방산은 너무 적은 양이 존재하여 상기 "우열 순서" 내의 위치를 발견할 수 없었다.
고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의한 분석은 전이 액체로 CH2Cl2를 사용할 때, 에틸화 오일 내의 전형적인 부성분인 부분 글리세리드(partial glyceride)가 농축액 내에 풍부함을 보여준다. 사용된 다른 용매에 대하여, 농축액 내의 부분 글리세리드의 농도는 출발 K30EE와 비교할 때 유의미한 정도로 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 이는 상기의 분석 결과와 함께 표 9에 기재되어 있다.
부분 글리세리드. Ph.Eur 논문 1250 및 오메가-3 산 에틸 에스테르에 대한 USP 논문의 공정에 따라 분석됨
용매 부분 디글리세리드 모노글리세리드 에틸 에스테르
K30EE 2.9 4.0 93.1
없음 농축액 2.5 3.0 94.5
헥산 농축액 2.2 2.7 95.1
1-헥센 농축액 2.4 3.4 94.2
사이클로헥센 농축액 2.6 3.7 93.7
CH2Cl2 1 농축액 3.5 6.0 90.5
CH2Cl2 2 A 4.0 1.8 94.2
B 2.1 0.9 97.0
C 1.9 0.8 97.3
D 1.9 0.8 97.3
E 1.3 0.9 97.8
농축액 3.4 7.2 89.4
1표 7로부터의 농축액
2표 8로부터의 추출물 및 농축액
표 7 및 8 내의 GC 면적 결과는 유럽 약전 논문 2.4.29 및 USP 논문 오메가-3 산 에틸 에스테르에 기재된 바에 따라 에틸 에스테르 샘플의 직접 주사를 통해 얻어졌다. 만약 샘플 내의 부분 글리세리드가 출발 K30EE의 조성과 유사할 경우, 통상의 기술자는 분석에 있어서 부분 글리세리드의 함유가 EPA 및 DHA의 측정된 함량의 감소를 유도할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 이유는 부분 글리세리드는 GC 크로마토그램으로 관찰되지 않으며, 모든 성분이 크로마토그램으로 관찰되는 경우보다 에틸 에스테르 피크의 상대 면적 퍼센트를 더 높일 수 있기 때문이다. 통상의 기술자는 분석에 있어서 부분 글리세리드를 포함하는 방법은 샘플이 메틸화될 수 있으며, 이에 따라 에틸 에스테르 및 부분 글리세리드가 메틸 에스테르로 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 전이 액체로 CH2Cl2 를 사용하여 얻어진 농축액에 대한 상기의 과정을 수행할 때, EPA 및 DHA의 함량은 표 7 및 8에 주어진 결과와 비교하여 감소되어 나타날 수 있을 것이다.
다만, 전이 액체로 CH2Cl2 를 사용하여 얻어진 농축액이 메틸화되었을 때, 생성된 메틸 에스테르는 EPA 및 DHA의 감소된 함량을 가지지 않았다. 대조적으로, EPA의 농도는 거의 영향을 받지 않은 반면, DHA의 농도는 증가한 것으로 나타났다(표 10). 동시에, 16:4n-1의 상대적인 농도는 증가하지 않았으며, 오히려 다소 감소되었다. 따라서, 예를 들어, 전이 액체로 CH2Cl2 를 사용할 때, 부분 글리세리드의 농도는 최종 농축액 내에서 증가되었으며, 상기 부분 글리세리드는 출발 K30EE와 비교하여 예를 들어, 상당히 증가된 농도의 EPA 및 DHA를 가졌다. 따라서, 분자 증류 및 요소 분획화와 같은 종래의 농축 공정에서 부분 글리세리드 부분이 제거된 유용한 지방산은 본 발명에 개시된 공정에 따라 유지되고 농축될 수 있다.
전이 액체로 CH2Cl2 를 사용하여 얻어진 농축액. 트리글리세리드의 유도체화를 위한 공정은 유럽 약전 논문 2.4.29, 부분 글리세리드를 분석할 때의 유도체화를 위한 공정은 USP 논문 오메가-3 산 에틸 에스테르, 에 따라 메틸화가 수행되었다.
16:4n-1 EPA DHA
표 7로부터 에틸 에스테르로서 분석 3.5 39.1 54.8
메틸화 후 분석 3.4 38.9 55.2
표 8로부터 에틸 에스테르로서 분석 3.7 39.0 53.8
메틸화 후 분석 3.4 39.2 54.9
상기 실시예로부터, 예를 들어, CH2Cl2 는 탄소 및 수소만을 포함하는 탄화수소와 비교하여 전이 액체로서 향상된 효과를 가졌다. 통상의 기술자는 이와 유사한 향상된 효과는 다른 할로겐화 용매와 산소 또는 질소와 같은 다른 극성 작용기를 포함하는 용매를 통해 얻어질 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
실시예 2C : 출발물질로서 트리글리세리드를 이용한 EPA 및 DHA의 농축
60.3 g의 코드리버 오일이 70 ℃에서 23 g H2O 및 59 g AgNO3 혼합물로 첨가되었다. 상기 혼합물은 1시간동안 교반되었으며, 상 분리가 일어날 때까지 방치되었다. 하부 수용성상은 상부 오일상으로부터 분리되었으며, Ag+ 복합체를 분리하고 EPA 및 DHA 내에서 농축된 트리글리세리드를 방출하기 위해 400 g의 물이 첨가되었다. 출발 물질 및 생성된 오일의 지방산 조성은 표 11에 기재되어 있다. EPA 및 DHA는 2배 이상 증가된 것으로 나타났다. 상기 실시예는 복합체화가 트리글리세리드와도 일어날 수 있음을 보여준다. EPA 및 DHA를 농축하기 위해, 지방산의 분포는 트리글리세리드 사이에서 완전하게 무작위일 수 없다. 몇몇의 트리글리세리드는 대부분 주사슬에 결합된 포화 또는 불포화 지방산을 가져야만 한다. 트리글리세리드 내의 지방산의 분포는 종에 따라 달라질 수 있다.
출발 물질로서 코드리버 오일을 사용한 EPA 및 DHA의 농축 실시예
지방산 코드리버 오일 (TG) 농축액 변화
C14:0 3.0 1.4 -53%
C16:0 9.7 5.0 -49%
C16:1 8.2 3.8 -54%
C18:0 2.1 1.5 -29%
C18:1n-9 17.8 9.6 -46%
C18:1n-7 4.9 3.1 -37%
C18:2 1.8 1.0 -45%
C18:3n-3 0.8 0.6 -18%
C8:4n-3 2.5 3.7 51%
C20:1 13.3 6.5 -51%
C20:4 n-3 0.8 0.9 11%
C20:5 n-3 9.4 19.8 110%
C22:1 7.2 2.9 -60%
C22:5 n-3 1.3 2.0 51%
C22:6 n-3 13.0 33.7 160%
실시예 2D : 초임계 CO 2 로 추출
50 ℃에서 45%/19%/36% (중량 기준)의 비율의 AgNO3/H2O/EE를 사용하여 유기상 내에 68%의 에틸 에스테르가 남았다. 수용성상은 추출을 위하여 초임계 유체 추출(SFE) 컬럼으로 옮겨졌다. Suzuki (Suzuki et al. (1993), Bioseparation 3, 페이지 197-204)에 의해 발견된 바와는 달리, 복합체로부터 모든 에틸에스테르가 추출되지 못했다. 약 70%의 에틸 에스테르가 추출된 후, 남아있는 혼합물은 젤-형 고체로 전환되었다. 추출 온도 및 압력은 EPA/DHA 비에 따라 다르게 사용될 수 있다. 280 bar에서 추출 온도를 60으로부터 70 ℃로 승온시키면 추출된 에틸 에스테르 내의 EPA/DHA는 53/15 내지 55/23로 변하였다. 모든 에틸 에스테르를 추출하기 위해서, 추출 동안 물을 첨가하는 것이 필요하였다. CO2 플로우로 0.5% H2O를 첨가하는 것은 에틸 에스테르의 완벽한 추출이 가능하도록 하기 위해 충분하다. 하기 실시예 6의 결과는 에탄올의 첨가 역시 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 3 : 물 내에서 희석
물과 수용성상의 부분 희석이 n-6 지방산 및/또는 특정 오메가-3 지방산(예를 들어, EPA및 DHA가 아닌 다른 긴-사슬 n-3 지방산) 내에 농축된 유기 부분을 방출한다는 것이 발견되었다.
K85EE는 60 중량%의 AgNO3 용액(K85EE:AgNO3 = 약 7:10 중량비)와 교반되었다. 수용성상은 유기상으로부터 분리되었으며 점진적으로 가수희석되었다. "농축액-1"은 1회의 가수희석 후에 얻어졌다(물:AgNO3(s) = 약 1.2:1 중량비). 제2 지방산 농축액은 수용성상의 추가적인 희석을 통해 얻어졌다(물:AgNO3(s) = 약 2.8 : 1 중량비) (분석되지 않음). "농축액-4" 는 추가적인 희석을 통해 얻어졌다(물:AgNO3(s) = 약 20:1 중량비). 표 12는 K85EE 출발 혼합물, 분리된 유기상("용해되지 않은 에스테르"), 농축액-1 및 농축액-4의 조성(GC 면적%)를 비교한다. K85EE 출발 혼합물의 중량과 비교한 수득률은 괄호로 기재되었다. 농축액-4의 가스 크로마토그램은 도 4에 나타나있다.
지방산 농축액의 조성; 점진적인 가수희석
지방산 에틸 에스테르 농도(GC 면적%)
K85EE 용해되지 않은 에스테르 (45%) 농축액-1 (22%) 농축액-4 (4%)
피탄산
(Phytanic acid)		 0.11 0.29 0.02 **
16:3n-4 0.11 0.22 0.07 **
16:4n-1 0.19 0.14 0.15 0.45
18:2n-6 0.04 0.10 ** **
18:3n-4 0.11 0.26 0.03 **
18:3n-3 0.06 0.13 0.03 **
18:4n-3 1.68 2.62 1.65 0.18
18:4n-1 0.11 0.17 0.15 **
퓨란산(Furan acid) 5 0.15 0.37 ** **
19:5 0.07 0.07 0.07 0.13
20:3n-6 0.06 0.14 ** **
20:4n-6 1.71 3.86 0.61 **
퓨란산(Furan acid) 7 0.15 0.29 0.04 0.06
20:4n-3 0.45 0.95 0.24 **
퓨란산(Furan acid) 8 0.45 1.11 0.05 **
20:5n-3 (EPA) 48.65 52.76 54.39 27.39
퓨란산(Furan acid) 9 0.07 0.16 ** **
21:5n-3 1.74 2.38 2.14 0.25
22:4 0.08 0.17 ** **
퓨란산(Furan acid) 10 0.28 0.68 ** **
22:5n-6 0.90 1.87 0.53 **
퓨란산(Furan acid) 11 0.04 0.12 ** **
22:5n-3 2.87 5.08 3.08 0.19
22:6n-3 (DHA) 39.55 25.15 36.16 70.14
24:1 0.02 ** ** **
EPA+DHA 88.20 77.91 90.53 97.54
∑ n-3 95.00 89.02 97.69 98.15
∑ n-6 2.65 5.83 1.14 **
∑n-3/∑n-6 35.8 15.3 85.7 ∞≠
∑"다른 C20-C22 n-3" 5.06 8.41 5.46 0.44
**0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
≠0.05% 초과의 면적을 가진 피크만 포함
표 12의 결과는 유기상이 K85EE 출발 혼합물과 비교할 때 n-6 지방 에스테르로 농축되었음을 보여준다. 유사한 결과는 DHA가 아닌 다른 n-3 지방산에서 관찰되었다. 농축액-4는 70% DHA (GC 면적%) 및 극히 소량의 DPA를 포함하여, 상기 및 이와 유사한 부분은 순수한 DHA를 제조하기 위한 중간체로서 적합하도록 만들어준다.
실시예 4 : AgNO 3 농도
K85EE는 60중량% 또는 70중량% AgNO3 용액과 K85EE:AgNO3 = 2:1 (20.0 g 대 10.1 g) 로 교반되었다. 오일/물 혼합물은 분리되도록 하였으며, 유기상은 제거되었다. 수용성상은 100 ml 물로 희석되었으며, 희석에 의해 방출된 지방산 농축액("농축액-1")이 수집되었다. 추가적인 50 ml의 물은 제2 농축액을 얻기 위해 수용성상으로 첨가되었다("농축액-2"). K85EE 출발 혼합물, 분리된 유기상("용해되지 않은 에스테르"), 농축액-1 및 2는 표 13 및 14에 기재된 바와 같이 GC 분석(GC 면적%)에 의해 측정되었다. K85EE 출발 혼합물의 중량과 비교한 수득률은 괄호로 기재되었다.
지방산 농축액의 조성; 60% AgNO3 용액
지방산 에틸 에스테르 농도 (GC 면적%)
K85EE 용해되지 않은 에스테르 (22%) 농축액-1
(64%) 		농축액-2
(8%)
18:2n-6 0.04 0.05 ** **
18:3n-4 0.11 0.21 ** **
18:3n-3 0.06 0.08 ** **
18:4n-3 1.68 3.01 1.10 0.58
20:4n-6 1.71 6.75 0.46 0.10
20:4n-3 0.45 1.67 0.18 0.03
퓨란산 8 0.45 1.62 0.03 **
20:5n-3 EPA 48.65 47.84 46.03 39.95
21:5n-3 1.74 2.57 1.77 0.81
22:5n-6 0.90 3.22 0.46 0.07
22:5n-3 2.87 6.56 2.81 0.54
22:6n-3 DHA 39.55 19.54 46.02 57.12
24:1 0.02 0.04 ** **
∑ n-3 95.00 81.27 97.91 93.03
∑ n-6 2.65 10.02 0.92 0.17
∑n-3/∑n-6 35.8 8.11 106 547
∑"다른 C20-C22 n-3" 5.06 10.80 4.76 1.38
**0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
지방산 농축액의 조성; 70% AgNO3 용액
지방산 에틸 에스테르 농도 (GC 면적%)
K85EE 용해되지 않음
(15%) 		농축액-1
(71%) 		농축액-2
(9%)
18:2n-6 0.04 0.13 0.03 **
18:3n-4 0.11 0.24 ** **
18:3n-3 0.06 0.15 ** **
18:4n-3 1.68 2.70 1.31 0.62
20:4n-6 1.71 9.65 0.80 0.10
20:4n-3 0.45 1.96 0.29 0.03
퓨란산 8 0.45 1.16 ** **
20:5n-3 (EPA) 48.65 46.43 48.21 40.84
21:5n-3 1.74 2.38 1.94 0.85
22:5n-6 0.90 3.90 0.71 0.07
22:5n-3 2.87 6.43 3.10 0.53
22:6n-3 (DHA) 39.55 17.72 42.66 56.37
24:1 0.02 0.09 ** **
∑ n-3 95.00 77.77 97.51 99.24
∑ n-6 2.65 13.68 1.54 0.17
∑n-3/∑n-6 35.8 5.69 63.3 584
∑"다른 C20-C22 n-3" 5.06 10.77 5.33 1.41
**0.02% 또는 그 미만의 GC 면적
또한 상대적으로 낮은 농도의 은 이온을 포함하는 수용성 용액과 지방산 농축액을 얻는 것이 가능할 수 있다. 다만, 두 종류의 혼합물을 얻기 위하여 가수희석이 바람직할 수 있다: 다량의 EPA 및 DHA(소량의 오메가-6 지방산 및/또는 EPA 및 DHA가 아닌 다른 긴-사슬 오메가-3 지방산과 같은 특정 오메가-3 지방산)를 포함하는 지방산 농축액 및 다량의 오메가-6 지방산 및/또는 EPA 및 DHA가 아닌 다른 긴-사슬 오메가-3 지방산과 같은 특정 오메가-3 지방산(즉, 소량의 EPA 및 DHA)을 포함하는 다른 농축액. 하기와 같이 이는 표 15 내에 기재되어 있다. K30EE는 AgNO3 용액(60 중량%, 70 중량% 또는 80 중량%)과 K30EE : AgNO3 = 0.8로 혼합되었으며, 두 개의 상으로 분리되었다. 수용성상은 물로 희석되었다. 표 15 내의 각 AgNO3 농도에 대하여, (1)로 표시된 행은 분리된 유기상의 조성을 나타내며, 행 (2)는 약 70 ℃에서 수용성상을 가수희석하여 회수된 지방산 농축액의 조성을 나타낸다. 표 15에 기재된 바와 같이, 60% AgNO3 용액은 높은 n-3/n-6 비율 및 높은 DHA 농도를 나타내었다.
지방산 농축액의 조성; 60%, 70%, 80% AgNO3 용액
80% AgNO 3 70% AgNO 3 60% AgNO 3
지방산 에틸
에스테르 		K30EE 1 (69.1%) 2 (27.2%) 1 (73.2%) 2 (25.0%) 1 (80.3%) 2 (17.3%)
16:4n-1 2.04 0.42 5.42 0.63 5.54 1.00 6.23
18:2n-6 1.20 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 **
18:3n-3 0.60 0.71 0.09 0.69 0.07 0.64 0.04
18:4n-3 2.15 1.22 3.60 1.64 2.94 2.04 2.08
20:4n-6 1.05 1.09 0.53 1.16 0.27 1.13 0.10
20:4n-3 0.80 0.55 0.56 0.66 0.32 0.68 0.13
퓨란산 8 - 0.13 0.02 0.14 ** 0.13 **
20:5n-3 (EPA) 18.53 3.11 43.15 5.83 42.79 10.33 41.29
21:5n-3 0.73 0.20 1.59 0.31 1.46 0.52 1.18
22:5n-6 0.5 0.31 0.59 0.44 0.36 0.48 0.14
22:5n-3 2.33 0.91 4.37 1.55 3.45 2.16 2.05
22:6n-3 (DHA) 12.87 0.65 31.53 1.32 34.14 3.21 39.88
EPA+DHA 30.87 3.76 74.60 7.15 76.93 13.54 81.17
∑n-3 37.43 7.35 84.81 12.35 85.17 19.58 86.65
∑n-6 1,55 1.42 1.14 1.62 0.65 1.63 0.24
∑n-3/∑n-6 24 5.18 74.4 7.62 131 12.0 361
∑"다른 C20-C22 n-3" 3.86 4.77 6.52 2.52 5.23 3.36 3.36
**0.02% 또는 그 미만의 면적 퍼센트
실시예 5 : 지방산 혼합물 : AgNO 3 비율
AgNO3(s)에 대한 출발 지방산 혼합물의 양이 변화하는 효과는 K30EE : AgNO3의 비율을 0.4 내지 1.6으로 변화시킴에 따라 실험되었다. 70 중량%의 AgNO3 의 수용성 용액이 모든 실험에 사용되었다. 70 ℃에서 1.5 시간동안 혼합된 K30EE-AgNO3 를 교반한 후, 동일한 온도에서 상 분리가 일어나도록 하였다. 각 실험에 있어서, 육안으로 뚜렷한 2개의 상은 약 1 시간 후에 얻어졌다. 유기상을 제거한 후 수용성 상은 물로 희석되었다(물 : AgNO3(s) = 약 7.5:1 중량비). 얻어진 농축액은 표 16에 기재되어 있다. 조성은 GC 분석(GC 면적%)에 의해 측정되었다. 표 16의 결과는 AgNO3에 대한 K30EE의 양의 증가는 높은 n-3/n-6 비와 (EPA+DHA)/∑(다른 LC n-3)의 높은 비를 나타냄을 보여준다.
지방산 농축액의 조성; K30EE : AgNO3 비 0.4 ~ 1.6
지방산 에틸 에스테르
K30EE
K30EE : AgNO 3 (s)
0.4 0.8 1.2 1.6
16:4n-1 2.04 5.93 6.34 6.69 6.77
18:3n-3 0.6 0.05 ni ni 0.05
18:4n-3 2.15 3.28 2.33 1.99 1.88
20:4n-6 1.05 0.27 0.19 0.15 0.17
20:4n-3 0.8 0.33 0.21 0.18 0.18
20:5n-3 (EPA) 18.53 46.23 42.5 39.75 37.62
21:5n-3 0.73 1.58 1.28 1.11 1.03
22:5n-6 0.5 0.36 0.22 0.18 0.17
22:5n-3 2.33 3.54 2.42 1.98 1.83
22:6n-3 (DHA) 12.29 34.66 40.8 44.79 45.21
EPA + DHA 30.82 80.89 83.3 84.54 82.83
∑ n-3 37.43 89.67 89.54 89.8 87.8
∑ n-6 1.55 0.63 0.41 0.33 0.34
∑n-3/∑n-6 24 142 218 272 258
다른 n-3 6.61 8.78 6.24 5.26 4.97
∑(다른 LC n-3) 3.86 5.45 3.91 3.27 3.04
(EPA+DHA)/
∑(다른 LC n-3)		 7 14 21 25 27
ni : 통합되지 않음; 0.05 면적% 미만인 것으로 추정된 피크
실시예 6 : 알코올의 첨가
K30EE는 표 17에 기재된 바에 따라 에탄올의 상대적인 양이 증가하는 70 중량%의 AgNO3 용액과 교반되었다. 상기에 기재된 바에 따라 최초 유기상이 제거된 후, 남아있는 수용성상은 물로 희석되었다(물 : AgNO3(s) = 약 7.5:1 중량비). 조성은 표 17에 기재된 바에 따라 GC 분석(GC 면적%)를 통해 측정되었다.
지방산 농축액의 조성; 수용성상으로 에탄올의 첨가. K30EE는 표 16에 따른 동일한 배치로부터 비롯되었다.
지방산 에틸 에스테르 에탄올 % (AgNO 3 (s)에 대한)
0 15 30 45 60
16:3n-4 1.066 1.937 2.68 2.89 2.908
16:4n-1 3.399 3.366 3.235 3.084 2.926
18:1n-9 1.852 0.738 0.741 1.238 2.175
18:2n-6 0.078 0.058 0.12 0.027 0.029
18:3n-6 0.092 0.157 0.311 0.4 0.447
18:3n-4 0.045 0.092 0.178 0.23 0.243
18:3n-3 0.117 0.146 0.125 0.122 0.111
18:4n-3 4.237 4.893 4.973 4.878 4.61
18:4n-1 0.528 0.61 0.613 0.598 0.57
퓨란산 5 0.032 - 0.017 0.05 0.08
19:5 0.149 0.159 0.156 0.156 0.144
20:3n-6 0.038 0.052 0.123 0.195 0.242
20:4n-6 0.708 1.398 2.068 2.268 2.26
퓨란산 7 0.042 0.043 0.051 0.057 0.061
20:4n-3 0.738 1.249 1.534 1.57 1.521
퓨란산 8 0.024 0.024 0.023 0.022 0.018
트랜스-EPA 0.012 0.016 - 0.015 0.013
20:5n-3 (EPA) 42.63 43.79 42.21 40.46 38.07
퓨란산 9 0.022 0.086 0.031 0.035 0.034
21:5n-3 1.78 1.894 1.838 1.766 1.663
22:4n-6 0.027 0.075 0.157 0.191 0.204
퓨란산 10 0.032 - 0.035 - 0.033
22:5n-6 0.732 1.103 1.129 1.13 1.069
퓨란산 11 0.029 0.055 0.089 0.108 0.108
22:5n-3 5.247 6.019 6.077 5.822 5.492
트랜스-DHA 0.037 0.025 0.068 0.026 0.031
22:6n-3 (DHA) 26.61 26.72 25.45 24.42 23.02
EPA+DHA 69.233 70.509 67.658 64.88 61.089
EPA/DHA 1.60 1.65 1.66 1.66 1.65
∑ n-3 81.352 84.71 82.205 79.038 74.486
∑ n-6 1.675 2.843 3.908 4.211 4.251
∑ n-3/n-6 48 29 21 18 17
다른 n-3 12.119 14.201 14.547 14.158 13.397
다른 LC n-3 7.765 9.162 9.449 9.158 8.676
(EPA+DHA)/다른 LC n-3 8 7 7 7 7
총 수득률 (%) 27 27 30 31 33
표 17의 결과는 에탄올을 첨가하는 것이 다양한 다중불포화 지방산에 상이한 효과를 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 에탄올의 상대적인 양을 증가시키는 것은 상당한 양의 단일불포화 지방산(예를 들어, 18:1n-9)을 수용성상으로 들어가도록 야기할 수 있다. 또한, 에탄올을 첨가하는 것은 n-3 지방산과 비교하여 증가된 농도의 n-6 지방산을 야기하는 것으로 나타낸다. 또한, "다른 LC n-3 산"의 함량은 EPA+DHA의 합과 비교하여 증가하는 것으로 나타낸다. 상기 효과들은 높은 함량의 "다른 LC n-3 산" 및/또는 높은 함량의 n-6 지방산을 수반하는 농축액을 제조하는데 유용할 수 있다.
실시예 7 : 오염물의 제거
몇몇의 잔류성 유기 오염물(POP)이 K30EE로 첨가되었으며, 본 발명에 개시된 공정에 따라 생성된 에틸 에스테르가 농축되었다. 생성된 오일(즉, 지방산 농축액)은 POP 및 콜레스테롤에 대하여 측정되었다. 콜레스테롤은 유럽 약전 논문 2.4.32, 오메가-3 산 내에 풍부한 오일 내 총 콜레스테롤, 에 따라 분석되었다. POP의 농도는 낮았으며, 지방산 내의 총 콜레스테롤(유리 에스테르화 콜레스테롤) 농도는 0.06 mg/g 이었다. K30EE 출발 물질 및 생성된 농축액 내의 POP의 수치 표 18에 기재되어 있다. 은 이온이 π-결합 계와 상호작용한다는 것이 알려진 바와 같이(표 6 참조), 방향족성 고리계를 포함하는 잔류성 유기 오염물의 수치가 공정 동안 증가할 것으로 예상할 수 있다. 벤조(a)피렌은 74% 감소된 것으로 나타났다. 이는 은 이온과의 약한 복합체화 경향과 벤조(a)피렌이 수상(water phase)으로 완전히 전이되지 않고, 유기상에 대부분 남아있는 것을 나타낸다. 할로겐화 용매는 은 이온/다중불포화 지방산 복합체와의 상호작용에 높은 활성을 나타낸 것을 유념할 때(표 6 참조), 놀랍게도 소량의 할로겐화 방향족성 화합물이 수상으로 전이되며, 농축액 내에서 발견되었다. 출발 물질에 첨가된 96% 이상의 할로겐화 방향족성 화합물이 공정 내에서 제거되었다.
출발 물질(POP가 첨가된 K30EE) 및 농축액 내의 잔류성 유기 오염물의 수치
POP 기 명칭 출발 물질 농도
디옥신 2,3,7,8-TCDD 18 pg/g 0.36 pg/g

비-오쏘 PCB		 3,3',4,4'-TeCB (PCB-77) 249 pg/g 7.0 pg/g
3,4,4',5-TeCB (PCB-81 12 pg/g 0.30 pg/g
3,3',4,4',5-PeCB (PCB-126) 6.3 pg/g 0.18 pg/g
DDT p,p'-DDT 112 ng/g 1.52 ng/g
PAH 벤조(a)피렌 20 ng/g 5.2 ng/g
PBDE DecaBDE 4.7 ng/g 0.19 ng/g








PCB		 2,2',4,4'-TetCB 1.2 ng/g 0.05 ng/g
2,2',5,5'-TetCB 3.9 ng/g 0.10 ng/g
2,3',4,4'-TetCB 2.2 ng/g 0.04 ng/g
2,4,4',5-TetCB 1.3 ng/g 0.02 ng/g
2,2',4,4',5-PenCB 1.0 ng/g 0.02 ng/g
2,2',4,5,5'-PenCB 3.7 ng/g 0.08 ng/g
2,3,3',4,4'-PenCB 1.0 ng/g 0.02 ng/g
2,3,4,4',5-PenCB 0.08 ng/g <0.01 ng/g
2,3',4,4',5-PenCB 2.1 ng/g 0.04 ng/g
2,2',3,3',4,4'-HexCB 0.7 ng/g <0.01 ng/g
2,2',3,4,4',5'-HexCB 29 ng/g 0.65 ng/g
2,2',3,4,5,5'-HexCB 1.3 ng/g 0.02 ng/g
2,2',3,4',5',6-HexCB 4.0 ng/g 0.08 ng/g
2,2',4,4',5,5'-HexCB 4.8 ng/g 0.09 ng/g
2,3',4,4',5,5'-HexCB 0.12 ng/g <0.01 ng/g
2,2',3,3',4,4',5-HepCB 1.7 ng/g 0.03 ng/g
2,2',3,4,4',5,5'-HepCB 6.0 ng/g 0.11 ng/g
2,2',3,4,4',5',6-HepCB 1.1 ng/g 0.01 ng/g
2,2',3,4',5,5',6-HepCB 2.9 ng/g 0.06 ng/g
2,3,3',4,4',5,5'-HepCB 0.04 ng/g <0.01 ng/g
2,2',3,3',4,4',5,5'-OctCB 1.3 ng/g 0.02 ng/g
2,2',3,3',4,4',5,5',6-NonCB 0.46 ng/g <0.01 ng/g
DecaCB 0.04 ng/g <0.01 ng/g
다른 실시예 또는 이 외에 표시된 곳에서, 상세한 설명 및 청구항 내에서 사용된 성분의 양, 반응 조건, 분석 측정 등에서 명시한 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 실시예에 있어서 수정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표현되지 않은 경우, 상세한 설명 및 첨부된 청구항 내에서 숫자 매개 변수의 명시는 본 발명의 개시에 의해 얻고자 하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구 범위의 균등론의 적용을 제한하는 시도로, 각 숫자 매개 변수는 유효 숫자 및 일반적인 반올림 방법에 비추어 해석되어야 한다.
본 발명의 개시의 넓은 범위로 명시된 수치 범위 및 변수가 근사치임에도 불구하고, 달리 표현되지 않는 경우 특정 실시예 내에서 수치의 표현은 가능한 정확하게 기재되었다. 다만, 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준편차로부터 발생할 수 밖에 없는 약간의 오류를 포함한다.

Claims (64)

  1. (a) 수용성상 및 유기상(organic phase)을 형성하기 위한 지방산 오일 혼합물 및 수용성 은 염 용액을 혼합하는 단계, 여기서 상기 수용성상(aqueous phase) 내에서 수용성 은 염(aqueous silver salt) 용액이 적어도 하나의 오메가-3 지방산과 복합체를 형성하고;
    (b) 유기상으로부터 수용성상을 분리하는 단계;
    (c) 전이 액체(displacement liquid)로 수용성상을 추출하거나, 수용성상을 적어도 30 ℃로 승온하거나, 또는 전이 액체로 수용성상을 추출하고 승온하여 적어도 하나의 추출물을 얻는 단계;
    (d) 상기 복합체를 분해하기 위해 수용성상을 물과 혼합하거나, 수용성상을 초임계 CO2로 추출하거나, 또는 수용성상을 물과 혼합하고 수용성상을 초임계 CO2로 추출하는 단계, 여기서 은 염(silver salt), 및 지방산 농축액을 포함하는 적어도 하나의 용액을 포함하는 수용성상이 형성되고; 및
    (e) 상기 은 염을 포함하는 수용성상으로부터 상기 지방산 농축액을 포함하는 적어도 하나의 용액을 분리하는 단계;
    를 포함하는 지방산 오일 혼합물로부터 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 농축하는 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 은 염의 농도는 물에서 약 10 중량% 내지 약 90 중량%인 공정.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 은 염의 농도는 물에서 약 60 중량% 내지 약 80 중량%인 공정.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 은 염의 농도는 물에서 약 60 중량%인 공정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 은 염은 AgNO3 및 AgBF4로부터 선택되는 공정.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 오메가-3 지방산은 (all-Z)-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA), (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA) 및 이의 혼합물로부터 선택되는 공정.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 공정은 EPA, DHA 또는 EPA 및 DHA를 농축하는 공정.
  8. 제7항에 있어서,
    지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및 적어도 하나의 용액 중 적어도 하나의 EPA/DHA의 중량비는 약 0.1 내지 약 10인 공정.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 적어도 90 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 공정.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 적어도 80 중량%의 EPA 및 DHA를 포함하는 공정.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 상기 지방산 오일 혼합물에 비해 감소된 농도의 적어도 하나의 오메가-6 지방산을 포함하는 공정.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 공정은 상기 지방산 오일 혼합물에 비해 상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3의 비가 증가하는 공정.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비는 약 40보다 큰 공정.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비는 약 80보다 큰 공정.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비는 약 100보다 큰 공정.
  16. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비는 약 150보다 큰 공정.
  17. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산에 대한 오메가-3 지방산의 비는 약 200보다 큰 공정.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산의 총 농도는 약 3 중량% 보다 작은 공정.
  19. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산의 총 농도는 약 2 중량% 보다 작은 공정.
  20. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 오메가-6 지방산의 총 농도는 약 1 중량% 보다 작은 공정.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 은 염 용액에 대한 지방산 오일 혼합물의 중량비는 약 0.4 내지 약 1.6인공정.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 수용성상으로 알코올을 첨가하는 단계를 더 포함하는 공정.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올을 포함하는 공정.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 전이 액체는 유기 용매를 포함하는 공정.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 유기 용매는 할로겐화 용매, 알칸, 알켄, 사이클로알칸 및 사이클로알켄으로부터 선택되는 공정.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 유기 용매는 디클로로메탄, 헥산, 헥센, 사이클로헥산, 사이클로헥센 및 디엔으로부터 선택되는 공정.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 전이 액체로 수용성상을 추출하는 단계는 적어도 2회의 연속 추출을 포함하는 공정.
  28. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 30 ℃의 온도는 약 30 ℃ 내지 약 90 ℃인 공정.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 복합체를 분해하기 위해 수용성상을 물과 혼합하거나, 수용성상을 초임계 CO2로 추출하거나, 또는 수용성상을 물과 혼합하고 수용성상을 초임계 CO2로 추출하는 단계는 적어도 1회 반복되는 공정.
  30. 제1항에 있어서,
    지방산 농축액을 포함하는 유기상의 분리 후에, 재사용하기 위해 상기 은 염을 포함하는 수용성상으로부터 은 염이 회수되는 공정.
  31. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 오일 혼합물은 동물성 오일(animal oil), 식물성 오일(vegetable oil), 미생물성 오일(microbial oil), 조류성 오일(algae oil) 또는 이의 임의의 혼합물로부터 유래되는 공정.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 동물성 오일은 해양유(marine oil)인 공정.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 해양유는 어유(fish oil)인 공정.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 오일은 글리세리드, 에틸 에스테르 및 유리 지방산 형태로부터 선택되는 형태인 공정.
  35. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 지방산 오일 혼합물에 비해 감소된 농도의 적어도 하나의 환경오염물을 포함하는 공정.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 상기 지방산 오일 혼합물에 비해 감소된 농도의 콜레스테롤을 포함하는 공정.
  37. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 오메가-3 지방산은 에틸 에스테르, 유리산 및 글리세리드로부터 선택되는 형태인 공정.
  38. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액은 상기 지방산 오일 혼합물에 비해 (all-Z)-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA) 및 (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA)이 아닌 적어도 하나의 C20 ~ C22 오메가-3 지방산을 감소된 농도로 포함하는 공정.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 EPA 및 DHA를 제외한 C20 ~ C22 오메가-3 지방산의 총 농도는 3 중량%보다 작은 공정.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 EPA 및 DHA를 제외한 C20 ~ C22 오메가-3 지방산의 총 농도는 2.5 중량%보다 작은 공정.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 지방산 농축액 내의 EPA 및 DHA를 제외한 C20 ~ C22 오메가-3 지방산의 총 농도는 0.5 중량%보다 작은 공정.
  42. 제1항에 있어서,
    (f) 적어도 하나의 정제 공정을 통해 지방산 농축액을 정제하는 단계를 더 포함하는 공정.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 정제 공정은 단형 증류(short-path distillation), 분자 증류(molecular distillation), 요오드락토닌화(iodolactonization)에 의한 분리, 초임계 유체 추출, 효소적 분획화 및 정제 크로마토그래피로부터 선택되는 공정.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 정제 공정은 단형 증류 및 분자 증류를 포함하는 공정.
  45. 제1항에 있어서,
    상기 공정은 적어도 1회 반복되며,
    여기서 지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및 적어도 하나의 용액 중 적어도 하나는 차후의 공정에서 지방산 오일 혼합물을 포함하는 공정.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 공정은 (all-Z)-5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산(EPA), (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA) 및 (all-Z)-7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(DPA)로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 80% 포함하는 지방산 농축액을 생성하는 공정.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 공정은 EPA, DHA 및 DPA로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 90% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  48. 제45항에 있어서,
    상기 공정은 EPA, DHA 및 DPA로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 95% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  49. 제45항에 있어서,
    상기 공정은 EPA, DHA 및 DPA로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 98% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  50. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 농축액, 적어도 하나의 추출물 및 적어도 하나의 용액 중 적어도 하나는 적어도 하나의 분획화 공정에 의해 처리되는 공정.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분획화 공정은 증류, 추출, 요오드락토닌화 및 크로마토그래피로부터 선택되는 공정.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분획화 공정은 C20 ~ C22 오메가-3 지방산으로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 80% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  53. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분획화 공정은 C20 ~ C22 오메가-3 지방산으로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 90% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  54. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분획화 공정은 C20 ~ C22 오메가-3 지방산으로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 95% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  55. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 분획화 공정은 C20 ~ C22 오메가-3 지방산으로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 지방산을 적어도 98% 포함하는 지방산 농축액을 생산하는 공정.
  56. 제50항 또는 제51항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 오메가-3 지방산은 (all-Z)-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산(DHA) 및 (all-Z)-7,10,13,16,19-도코사펜타엔산(DPA)으로부터 선택되는 공정.
  57. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 오일 혼합물은 디옥신(dioxine), 폴리염화비페닐(PCB), 디클로로-디페닐-트리클로로에탄(DDT) 및 폴리브로민화비페닐에테르(PDBE)로부터 선택되는 적어도 하나의 잔류성 유기 오염물을 포함하는 공정.
  58. 제57항에 있어서,
    상기 공정은 지방산 농축액 내에 지방산 오일 혼합물의 적어도 하나의 잔류성 유기 오염물을 적어도 95% 감소시키는 공정.
  59. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 오일 혼합물은 콜레스테롤을 포함하는 공정.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 공정은 지방산 오일 혼합물의 콜레스테롤을 지방산 농축액 내로 0.1 mg/g 보다 낮게 감소시키는 공정.
  61. 제1항에 있어서,
    상기 초임계 CO2는 적어도 하나의 극성 변형제(polar modifier)를 포함하는 공정.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 극성 변형제는 물 또는 알코올로부터 선택되는 공정.
  63. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 오일 혼합물 및 수용성 은 염 용액은 약 -25 ℃ 내지 약 20 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃ 또는 약 25 ℃ 내지 약 90 ℃의 온도에서 혼합되는 공정.
  64. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 오일 혼합물 및 수용성 은 염 용액을 혼합한 후, 수용성상이 약 -25 ℃ 내지 약 20 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 25 ℃ 또는 약 25 ℃ 내지 약 90 ℃의 온도에서 유기상으로부터 분리되는 공정.
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