广东紫珠低极性成分提取物、含有其的药物组合物、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于中药或天然药物制药领域,具体涉及一种广东紫珠低极性成分提取物、其制备方法、含有该广东紫珠挥发油提取物的药物组合物及其用于抑制宫颈炎致病菌的用途。
背景技术
世界卫生组织对中国妇女的调查表明:我国育龄女性人口数字约为1.5-2亿,其中约41%的女性患有不同程度的妇科炎性疾病,已婚女性发病率更高达70%。据统计,宫颈炎约占妇产科门诊总数的40-50%,居妇科疾病之首,其中慢性宫颈炎占门诊病人的10%-25%。正常情况下,子宫颈腺体可以分泌粘稠的分泌物,形成粘液可抵抗阴道内病原体侵入子宫腔。但当机体抵抗力下降时,或者子宫颈受某种因素影响,使分泌物增加,宫颈外部长期浸在分泌物内,就极易受病原体的袭击,这种情况导致子宫颈“失守”而感染,从而形成宫颈炎。宫颈炎致病菌主要有金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等。
马鞭草科紫珠属植物广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.),2010年新收录于中国药典。又名止血柴,紫珠草、金刀菜等,广泛分布于我国江西、湖南、湖北、广东等省,具有收敛止血,清热解毒之功效,是“抗宫炎片”和“抗宫炎胶囊”等中成药的主要原料药材,在妇科炎症制剂中被广泛应用,常用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等妇科疾病,在江西、湖南等省列入地方药材标准。国内外对紫珠属植物的研究主要集中在黄酮类化合物、萜类化合物上,现代研究也证实多种紫珠属植物挥发性成分具有多种生物活性,但对广东紫珠中的低极性成分深入研究未见报道。
与本发明相关的现有技术主要有以下3个文献:
1.Kim Y S,Shin D H.Volatile Constituents from the Leaves ofCallicarpajaponica Thunb.and Their Antibacterial Activities.J Agric FoodChem,2004,52(4):781-787.该文做了广东紫珠同属植物C.japonica中的挥发性成分对于六种食物传播的微生物的抗菌活性,但没有关于广东紫珠低极性成分的制备及其体外抗菌活性的描述。
2.李德英,袁惠德.华紫珠和杜虹花的成分、毒性与抑菌作用比较.现代应用药学.1992,9(1):13-15.该文做了广东紫珠同属植物华紫珠、杜虹花化学成分的抗菌活性测定,但没有关于广东紫珠低极性成分的制备及其体外抗菌活性的描述。
3、洪燕龙.妇炎康泡腾片的制剂工艺,质量标准和广东紫珠化学成分的研究.北京:北京中医药大学,2004.该文利用体内试验验证了广东紫珠总黄酮具有抗炎活性,但没有针对广东紫珠低极性成分的制备及其体外抗菌活性的描述。
发明内容
鉴于现有技术的不足,本发明提供一种广东紫珠低极性成分提取物,其可通过超临界CO2萃取法得到,并对其进行GC-MS分析分离,采用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等宫颈炎常见致病菌分别评价广东紫珠低极性成分提取物的体外抗菌活性,为广东紫珠进一步的研究应用提供依据。
本发明的第一个目的是提供一种广东紫珠低极性成分提取物,其特征在于其含有19.12%-25.86%的脂肪酸类化合物、36.16%-41.93%的烃类化合物和3.40%-7.39%的萜类化合物。
根据本发明,所述“低极性成分”是指极性较小的脂肪酸类、萜类及烃类化合物。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述的广东紫珠低极性成分提取物含有19.12%的脂肪酸类化合物、36.16%的烃类化合物和3.40%的萜类化合物。
根据本发明的另一个优选的实施方式,所述的广东紫珠低极性成分提取物含有25.86%的脂肪酸类化合物、41.93%的烃类化合物和7.39%的萜类化合物。
根据本发明的一个优选的实施方式,重要的脂肪酸类化合物包括棕榈酸、十四烷酸、十七烷酸、n-十六酸和亚油酸、硬脂酸和二十二烷酸。
根据本发明的一个优选的实施方式,重要的烃类化合物包括十八烷、二十二烷、二十八烷、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(Z)-9,17-十八碳二烯醛、十氢番茄红素、二十烷、二十七烷、顺式-2,6,10,14,18-五甲基-2,6,10,14,18-二十戊烯和15-烯-十八碳酮等。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述萜类化合物选自叶绿醇、金合欢醇异构体、石竹烯、吉玛烯D、氧化石竹烯、丁香烯、植物醇等。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述的广东紫珠低极性成分提取物还含有其他类化合物,选自下组:4-异丙基-7-甲基-3-亚甲基-8H-环戊烷[1,3]环丙烷[1,2]苯、8H-异非洲防己苦素酸甲酯、5,7-二羟基-3,3′,4′-三甲氧基黄酮、2-硫乙基-3,6-二丁基吡啶、5-(10,12-十三碳二烯基)-5H-苯并咔唑、豆甾烷-3,5-二烯、2-甲硫基-4,6-二三氯甲基-1,3,5-三嗪和4,6,22-三烯-3-β-麦角甾醇。所述其他类化合物的含量占6.37%-22.44%。
本发明的第二个目的是提供所述广东紫珠低极性成分提取物的制备方法,所述方法包括用超临界CO2萃取广东紫珠并用有机溶剂提取超临界CO2萃取物的步骤。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述超临界CO2萃取的条件如下:萃取温度为35-45℃,压力20-30Mpa;分离釜温度30-50℃,压力5-8Mpa;CO2流速40-60L/h,总流量90-110L;提取时间1.5-2.5h。
根据本发明的一个特别优选的实施方式,所述超临界CO2萃取的条件如下::萃取温度为40℃,压力25Mpa;分离釜温度40℃,压力6Mpa;CO2流速50L/h,总流量100L;提取时间2h。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述有机溶剂选自乙醚、正己烷或环己烷,优选乙醚。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述广东紫珠为马鞭草科植物广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun.)的干燥茎枝及叶。
本发明的第三个目的是提供一种药物组合物,其含有有效量的所述的广东紫珠低极性成分提取物和药学可接受的赋形剂。
本发明的第四个目的是提供所述广东紫珠低极性成分提取物在制备抑制宫颈炎致病菌的药物中的用途。
根据本发明的一个优选的实施方式,所述宫颈炎致病菌选自金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或白色念珠菌。
经实验证实,本发明的广东紫珠低极性成分提取物具有较强的抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等宫颈炎致病菌活性,可用于治疗宫颈炎。
附图说明
图1为实施例1所得的广东紫珠低极性成分提取物的GC-MS总离子流图,其中横坐标为保留时间(min),纵坐标为峰面积;
图2为实施例2所得的广东紫珠低极性成分提取物的GC-MS总离子流图,其中横坐标为保留时间(min),纵坐标为峰面积;
图3为实施例1-2所得的广东紫珠低极性成分提取物抑制各细菌的照片。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明,但这些实施例不构成对本发明的限制。
仪器和材料
HA221-40-1超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司),DSQ气相色谱质谱联用仪(Thermo Fisher公司)。
LRH-150型生化培养箱(上海索普仪器有限公司);YXQ-LA-50S II立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
无水乙醚、无水硫酸钠及甲醇等试剂均为分析纯(国药集团上海试剂公司)。
菌种:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和白色念珠菌(Candida albicans)购自上海医药工业研究院生物部。
牛肉膏(中国医药集团上海化学试剂有限公司);培养基I(牛肉膏蛋白胨培养基)/g·L-1:蛋白胨10,牛肉浸膏3,NaCl 5,琼脂2;pH 7.0~7.2,121℃灭菌30min。培养基II(YPD培养基)/g·L-1:葡萄糖20,蛋白胨10,酵母膏5,琼脂20;pH自然,121℃灭菌30min。
广东紫珠为江西萍乡栽培,为马鞭草科植物广东紫珠(Callicarpakwangtungensis Chun.)的干燥地上部分。
实施例1:广东紫珠低极性部位的超临界CO2制备
广东紫珠药材粉碎,过24目筛,称取200g,置超临界1L萃取釜(萃取釜II)内,按以下条件萃取:萃取温度为45℃,压力25Mpa;分离釜温度50℃,压力8Mpa;CO2流速50L/h,总流量100L;提取时间2h。收取分离釜提取物,提取物为棕黄色油状物,将分离釜的样品用无水乙醚萃取,适量无水硫酸钠脱水得样品,得率为1.042%。
实施例2:广东紫珠低极性部位的超临界CO2制备
广东紫珠药材粉碎,过24目筛,称取200g,置超临界1L萃取釜(萃取釜II)内,按以下条件萃取:萃取温度为35℃,压力25Mpa;分离釜温度30℃,压力5.7Mpa;CO2流速50L/h,总流量100L;提取时间1.5h。收取分离釜提取物,提取物为淡黄色液体样物,将分离釜的样品用正己烷萃取,适量无水硫酸钠脱水得样品,得率为0.658%。
实施例3:实施例1所得广东紫珠低极性成分提取物的化学成分的GC-MS分析
1)GC-MS色谱条件
色谱柱HP-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);高纯氮气为载气,进样口温度300℃,进样方式分流进样,分流比30∶1,进样量1μl,载气流速1.0ml/min;程序升温:起始温度200℃,保持3min后以4℃/min升至250℃,保持5min后以20℃/min升至300℃保持3min。质谱接口温度为310℃,EI源温度200℃,电子轰击能量60eV,扫描范围m/z 25-550amu,全离子扫描,采集延时5.0min,归一化法计算相对含量。
实施例1所得广东紫珠低极性成分提取物的GC-MS总离子流图见附图1。用气相色谱数据处理系统,以峰面积归一法测得其中各组分的相对百分含量,对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图,经过NIST05质谱库计算机数据系统对照,以及检索上海研发公共服务平台化学综合数据库,并查阅相关文献与标准图谱对照分析,确认各化合物。结果从实施例1所得广东紫珠低极性成分提取物中鉴定了27个化合物(占挥发油总质量的81.12%),鉴定率为47.27%,其中7个(十四烷酸、n-十六酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸、十七烷酸、二十二烷酸)为脂肪酸类化合物,含量占19.12%;8个((E,E)-2,4-癸二烯醛、(Z)-9,17-十八碳二烯醛、十氢番茄红素、二十烷、二十八烷、二十七烷、顺式-2,6,10,14,18-五甲基-2,6,10,14,18-二十戊烯、二十二烷)为烃类化合物,含量占36.16%;4个(丁香烯、金合欢醇异构体、红没药醇、植物醇)为萜类化合物,含量占3.40%;8个(4-异丙基-7-甲基-3-亚甲基-8H-环戊烷[1,3]环丙烷[1,2]苯、8H-异非洲防己苦素酸甲酯、5,7-二羟基-3,3′,4′-三甲氧基黄酮、2-硫乙基-3,6-二丁基吡啶、5-(10,12-十三碳二烯基)-5H-苯并咔唑、豆甾烷-3,5-二烯、2-甲硫基-4,6-二三氯甲基-1,3,5-三嗪、4,6,22-三烯-3-β-麦角甾醇)为其他类化合物,含量占22.44%,含量最高的化合物为十氢番茄红素(21.00%)。结果见表1。
表1、实施例1所得广东紫珠低极性成分提取物的分析结果
实施例4:实施例2所得广东紫珠低极性成分提取物的化学成分的GC-MS分析
GC-MS色谱条件及分析方法同实施例3,结果从实施例2所得广东紫珠低极性成分提取物中鉴定了21个化合物(占挥发油总质量的81.55%),鉴定率为52.5%,其中6个(棕榈酸、十四烷酸、十七烷酸、n-十六酸、亚油酸、硬脂酸)为脂肪酸类化合物,含量占25.86%;7个(植酮、顺式-2,6,10,14,18-五甲基-2,6,10,14,18-二十碳戊烯、二十二烷、15-烯-十八碳酮、(Z)-9,17-十八碳二烯醛、十八烷、二十八烷)为烃类化合物,含量占41.93%;5个(叶绿醇、金合欢醇异构体、石竹烯、吉玛烯D、氧化石竹烯)为萜类化合物,含量占7.39%;3个(豆甾烷-3,5-二烯、6α,16β-二甲基黄体酮、2-硫乙基-3,6-二丁基-吡啶)为其他类化合物,含量占6.37%,含量最高的化合物为顺式-2,6,10,14,18-五甲基-2,6,10,14,18-二十碳戊烯(30.09%)。实施例2所得广东紫珠低极性成分提取物的GC-MS总离子流图见图2,结果见表2。
表2 实施例2所得广东紫珠低极性成分提取物的分析结果
实施例5:广东紫珠低极性部位抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等宫颈炎致病菌活性测试
供试液的配制:吸取广东紫珠超临界提取物150μl,甲醇400μl稀释,混匀,备用。吸取广东紫珠超临界分离釜I、II提取物各75μl,混匀,甲醇400μl稀释,备用。
分别吸取各供试液20μl置纸敏片(直径6mm)上,吹干后贴于不同鉴定菌种的检测平板上,盖上陶瓦盖,置于培养箱内,金黄色葡萄球菌与大肠杆菌37℃培养16h,白色念珠菌于28℃培养20h,精确测量各抑菌圈直径。结果显示:实施例1所得广东紫珠低极性成分提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌均有较强的抑菌活性,抑菌圈直径分别为9.8mm、7.2mm、11.2mm;实施例2所得广东紫珠低极性成分提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌也有较强的抑菌活性,抑菌圈直径分别为9.6mm、7.0mm、11.3mm。见附图3。
结论:本发明所公开的广东紫珠低极性成分提取物具有较强的抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌等宫颈炎致病菌活性。