CN103205454B - 金属硫蛋白转基因酵母的构建及利用其制备重金属生物吸附材料的方法 - Google Patents
金属硫蛋白转基因酵母的构建及利用其制备重金属生物吸附材料的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于环境工程重金属污染治理领域，涉及一种金属硫蛋白转基因酵母的构建及利用金属硫蛋白转基因酵母制备生物吸附材料的方法。利用rDNA在酵母细胞内存在100-200个重复单元的特点，以rDNA作为同源整合位点构建酵母金属硫蛋白多拷贝整合表达载体，并使其在S.cerevisiae4126中利用S.cerevisiae288c3-磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子进行表达，实现了酵母金属硫蛋白的多拷贝表达，获得对重金属有较高耐受性和吸附性的金属硫蛋白转基因酵母，进而提供一种经济、安全的利用金属硫蛋白转基因酵母制备重金属生物吸附材料的方法。
Description
技术领域
本发明属于环境工程重金属污染治理领域，涉及一种利用金属硫蛋白改造的转基因酵母及制备重金属生物吸附剂的方法。
背景技术
重金属污染是当今世界非常严重的环境问题之一，重金属污染主要由于现代工农业的发展及人类一些不良处理方法导致，对生态环境、公共卫生及人类健康都构成了严重的威胁。不同于其他污染，重金属污染不能够被生物降解，因此使得重金属污染的治理更加困难。当前，处理重金属污染主要是利用物理或者化学的方法，包括化学沉淀、离子交换、膜分离、反渗透等。但是这些方法都存在着能耗高，运行费用大，操作复杂，在处理低浓度重金属废水时效率低等问题，所以很难实现大规模应用，并且物理化学方法在应用过程中还容易引起水体和土壤的二次污染。因此，除了要在源头上通过应用清洁生产技术对重金属的使用和排放进行遏制之外，还需要更多地研究和开发成本低、效率高的新型吸附材料对重金属污染进行治理。
生物吸附法作为一种新兴的重金属污染处理方法越来越突显出其独特的优势。生物吸附法主要是将生物资源通过一定的预处理，制成稳定的，可以有效地分离有毒重金属的生物吸附材料，其具有成本低，来源广泛，无二次污染等优点，尤其在处理大体积低浓度废水时，生物吸附法具有高效、廉价、环境友好的特点，非常适用于工业废水的处理。生物吸附重金属的主要机制是通过鳌合、离子交换、氧化还原等机理。与物理化学方法相比，生物吸附法更符合可持续发展的环境经济发展战略，是一种极具潜力的重金属处理方法。
自然状态下生长良好并具有高生物量产率的微生物，往往具有较低的重金属吸附能力和耐受能力，不适合应用于重金属环境治理。因此，随着基因工程技术的发展，人们尝试对微生物进行遗传改造，把一些天然金属螯合蛋白或多肽在细胞内表达使转基因重组菌株对重金属具有高抗性和高富集能力，然后利用转基因工程菌对重金属污染进行高效修复。在众多金属螯合蛋白中，广泛存在于生物体内、对生物体具有重金属解毒、清除自由基功能的金属硫蛋白备受关注。金属硫蛋（metallothionein）是一类低分子量（7-10kDa）、富含半胱氨酸（20-30%）的金属结合蛋白。最早由哈佛大学的Margoshes和Valee于1957年从马的肾脏中首次分离得到，此后在动物、植物、微生物等均发现有金属硫蛋白并相继分离得到。金属硫蛋白属于在进化上比较保守的蛋白，其结构高度保守，不同来源的金属硫蛋白氨基酸序列很相似，均由61个氨基酸组成，并且其中大概20个为半胱氨酸，赖氨酸和丝氨酸也比较多，但完全不含芳香族氨基酸和组氨酸。肽链的羧基末端都是丙氨酸，氨基末端都是N-乙酰甲硫氨酸。多肽链中的氨基酸多数是排列为Cys-X-Cys的重复结构，由于Cys中的巯基对金属离子具有很强的螯合能力，金属硫蛋白对Cd、Zn、Cu有很高的亲和力。金属硫蛋白的空间结构研究显示金属硫蛋白内不含二硫键和游离的巯基，主要靠Cys的巯基来连接金属。每20个Cys可以结合12个Cu，或者7个Zn、Cd，对不同的金属亲和力不同，其稳定性次序为：Hg、Ag>Cu>Cd>Zn，可以同时吸附污水中的多种重金属。因此，金属硫蛋白作为一种金属结合蛋白，在重金属污染处理领域具有很大的应用潜力。
发明内容
本发明目的在于克服现有物理化学技术在处理重金属污染问题时存在的运行费用大，能耗高，二次污染严重等缺点，提供一种经济、安全的利用金属硫蛋白转基因酵母制备的重金属生物吸附材料的方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：
金属硫蛋白转基因酵母的构建方法如下：金属硫蛋白基因来源于S.cerevisiae288c，将从酿酒酵母S.cerevisiae288c中克隆的金属硫蛋白基因连接到pFA6a载体上，再将S.cerevisiae288c3‐磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子拼接到载体上，利用S.cerevisiae288c3‐磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子进行表达，最后将S.cerevisiae288c rDNA基因作为同源臂连接到上述载体上，利用rDNA在酵母细胞内存在100‐200个重复单元的特点，以rDNA作为同源整合位点实现目的基因的多拷贝整合表达，从而得到具有重金属吸附功能的多拷贝整合表达载体pFA6a‐PGK1‐cup1‐rDNA，将其线性化后转化酿酒酵母S.cerevisiae4126，利用G418为筛选标记，即可筛选到金属硫蛋白转基因酵母，将该转基因酵母命名为S.cerevisiae4126‐cup1。
利用构建的金属硫蛋白转基因酵母制备重金属生物吸附材料的方法如下：将上述得到的金属硫蛋白转基因酵母在葡萄糖浓度为20g/L的YPD培养基中培养过夜，然后按照1:100的比例接种到葡萄糖浓度为60g/L的YPD培养基中培养36h，抽滤收集菌体，用清水清洗3次，经过以上过程制备的菌体即为利用金属硫蛋白转基因酵母制备的重金属生物吸附材料。
本发明具有以下优点：
首先是吸附材料的选择，构建一株可以作为重金属生物吸附材料的重组菌株，应该选择一种具有一定重金属耐受性和吸附能力并且遗传背景清晰的菌株。选择酿酒酵母作为生物吸附材料具有以下优点：酵母易于大规模培养，其发酵条件简单，培养基成分廉价，生物量产率高，易于获得；酵母更加安全，使用酵母作为生物吸附剂易于被公众接受；酵母作为一种理想的模式生物，在分子水平上已经被深入研究，因此选择酵母作为生物吸附剂便于生物吸附重金属机制的研究，特别可以在分子水平上研究金属—微生物之间的相互作用；酵母基因操作简单，便于利用基因工程手段对其进行改造。
其次是靶蛋白的选择，理想的靶蛋白是构建高效转基因重组菌的一个必要条件。本发明选用的酵母金属硫蛋白是一种由61个氨基酸组成的小分子金属结合蛋白，从基因到蛋白质高级结构的研究已经相当深入。实验证明，该蛋白能和重金属（尤其是Cd、Cu、Zn）稳定地结合，在生物体内起到重金属解毒的作用。已有研究利用基因工程的方法将酵母金属硫蛋白基因克隆到微生物细胞内，从而使转基因重组菌获得对重金属的抗性，并且能够在一定程度上提高转基因重组菌的重金属吸附能力。但这种结合能力偏低，为进一步提高转基因重组菌对重金属的吸附能力，本发明通过构建多拷贝整合表达载体，实现金属硫蛋白的多拷贝表达，更大程度地提高转基因重组菌的重金属吸附能力。
再者是整合位点的选择，为了实现外源片段表达的稳定性，通常会利用同源重组将外源片段整合到宿主染色体上。本发明利用酵母基因组rDNA作为同源整合位点，由于酵母基因组中的rDNA有100-200个重复单元，因此可以实现金属硫蛋白基因在宿主细胞内的多拷贝表达。rDNA多拷贝整合技术不需要像体外多拷贝串联那样需要繁琐和复杂的质粒构建过程，由于rDNA自身的扩增能力比较强，因此可以选择表达水平很低的标记基因，省去了繁重的筛选过程，使得外源基因可以多拷贝、稳定的得以表达。
最后，本发明中的金属硫蛋白转基因酵母不仅对多种重金属有较好吸附能力，并且相比出发菌株重金属耐受能力也大大提高，更适合应用于重金属废水的处理过程，因此，本发明中的利用金属硫蛋白转基因酵母制备的生物吸附材料在重金属废水治理领域显示了广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例中酵母金属硫蛋白基因的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果。
图2是酵母电击转化验证的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是本发明实施例中金属硫蛋白转基因酵母对六价铬的还原能力。
图4是本发明实施例中金属硫蛋白转基因酵母对总铬吸附量。
图5是本发明实施例中金属硫蛋白转基因酵母对铜离子吸附量。
具体实施方案
实施例1金属硫蛋白多拷贝整合表达载体的构建
本发明所利用的核苷酸序列来源如下：酿酒酵母金属硫蛋白基因（cup1）序列来源于S.cerevisiae288c，PCR克隆产物电泳结果如图1；3-磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子来源于S.cerevisiae288c；同源臂rDNA基因序列来源S.cerevisiae288c；质粒pFA6a为清华大学陈国强老师赠送。
1.酿酒酵母总DNA提取
1)菌体的培养与收获：从30℃培养2天的酵母菌平板上挑取一个单菌落，接入10mL YPD液体培养基，于30℃培养16h后，12000r/min，离心5min收集菌体。
2)菌体的裂解：用无菌水洗涤菌体两次，向菌体中加入500μL裂解液，将菌体悬浮，再加入2/3体积的0.5mm的干净玻璃珠和25mL5mM的NaCI溶液，高速振荡10min破碎细胞。12000r/min，离心5min，将上清转移至干净的离心管中。
3)基因组DNA的抽提：加入500μL酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合溶液，同上振荡后，12000r/min，离心1min。取上清，加入1ml冰预冷的95%乙醇后置于‐20℃放置1h。
4)12000r/min高速离心5min后，用70%乙醇洗涤沉淀，于室温晾干，并将沉淀溶于适量TE buffer（PH8.0）中，加入1μL RNase消化RNA，即得酵母基因组DNA样品，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的DNA样品于‐20℃保存。
2.PCR体外扩增酿酒酵母金属硫蛋白基因
引物的设计与合成：采用Premier5.0引物设计软件，按照S.cerevisiae288c的金属硫蛋白基因全序列为依据设计引物cup1F和cup1R，分别在5’端引入酶切位点Sca II和3’端引入酶切位点Hap I。
3.PCR体外扩增PGK1启动子
引物的设计与合成：采用Premier5.0引物设计软件，按照S.cerevisiae288c的PGK1基因全序列为依据设计引物PGK1F和PGK1R，分别在5’端引入酶切位点Spe I和3’端引入酶切位点Sca II。
4.PCR体外扩增rDNA基因
引物的设计与合成：采用Premier5.0引物设计软件，按照S.cerevisiae288c的rDNA基因全序列为依据设计引物rDNAF和rDNAR，分别在5’端引入酶切位点BamH I和3’端引入酶切位点BssH II。
5.CaCl2法制备E.coli DH5α感受态细胞
1)取E.coli DH5α单菌落，接种于100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡12h。
2)取1mL上述培养物按照1：100的比例接入100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡5h。
3)将菌液倒入冰预冷的无菌50mL离心管中置于冰上冷却10min后，4000r/min离心5min，弃上清。
4)用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃，10000r/min，离心5min。
5)沉淀加入34mL预冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀，置于冰上10min后，4℃，4000r/min，离心5min，弃上清。
6)用4mL0.1M CaCl2重悬沉淀，加15%甘油后分装成100mL的小份，置于‐70℃冰箱保存备用。
6.将cup1基因片段、PGK1基因片段和rDNA基因片段分别与pMD19-T载体连接
将上述得到PCR扩增产物分别与pMD19-T载体连接，连接体系如下：PCR扩增产物5μL，PMD19-T vector1μL，10*Buffer1μL，DNA连接酶1μL，双蒸水2μL。16℃，过夜连接。
7.将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
将cup1基因、PGK1基因和rDNA基因与pMD19-T载体的连接产物分别转化E.coli DH5α感受态细胞，过程如下：
1)从‐70℃冰箱中取出感受态细胞，在冰上缓慢解冻。
2)将连接产物全部加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰浴30min。
3)42℃水浴90s后，迅速冰浴5min。
4)加入900mL温预的LB培养基，37℃振荡培养45min。
5)3000r/min离心3min，将上清弃至100mL，再与沉淀混匀后，涂布于含氨苄青霉素（100mg/L）的LB选择平板上，37℃倒置培养12‐15h后出现单菌落。
8.连接产物阳性克隆验证
1)从选择平板上挑取单菌落，接入5mL LB液体培养基中（含100mg/L氨苄青霉素），37℃振荡培养12‐14h。
2)用质粒小量提取试剂盒提取质粒。
3)取2mL质粒提取液进行琼脂糖凝胶电泳，检测提取的质粒浓度。
4)提取的质粒进行双酶切，验证PCR产物与T载的连接效果。
5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序，测序委托大连宝生物工程有限公司完成。
9.整合表达载体的连接
将载体pMD19-T/PGK1和pFA6a经Spe I和Sac II双酶切后进行连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并挑取单菌落进行验证，重组正确的载体命名为pFA6a-PGK1；将载体pMD19-T/cup1和pFA6a-PGK1经Sac II和Hpa I双酶切后进行连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并挑取单菌落进行验证，重组正确的载体命名为pFA6a-PGK1-cup1；将载体pMD19-T/rDNA和pFA6a-PGK1-cup1经BamH I和BssH II双酶切后进行连接，将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，并挑取单菌落进行酶切验证，重组正确的载体命名为pFA6a-PGK1-cup1-rDNA。
实施例2金属硫蛋白转基因酵母S.cerevisiae4126的获得
本发明使用电击转化的方法将目的载体转入S.cerevisiae4126细胞内，具体操作方法如下：
1.制备酵母感受态细胞
1)将实验室低温保藏的S.cerevisiae4126接种于YPD培养基中，在30℃，150r/min的摇床中活化16h。
2)取出酵母培养液，冰浴15min，以便停止细胞生长，之后将菌液平均转移到两个无菌的50mL的离心管中，在4℃下离心5min，小心弃去上清。
3)将装有菌体的离心管置于冰上，各加入35mL的预冷无菌的1M山梨醇，使细胞悬浮于其中。在4℃下离心5min，小心弃去上清。重复一遍此操作。
4)将细胞再次悬浮于1.5mL的预冷无菌的1M山梨醇中，将悬浮液转移到冰浴的1.5mL离心管中，在4℃下离心5min，小心弃去上清。
5)最后将细胞悬浮在0.5mL预冷无菌的1M山梨醇中，将细胞保存在冰中，尽快进行电转。
2.电击转化导入目的基因
1)将DNA样品放在冰上。
2)再吸取40μL之前准备的细胞悬浮液，加入到装有DNA样品的离心管中，在冰上冰浴5min。
3)把DNA‐细胞混合物加入到电转杯（冰浴冷）中，轻轻敲击电转杯使混合物均匀进入电转杯的底部。
4)把电转杯放到脉冲发生器的滑槽中，推到电极间，按下pusle键，听到蜂鸣后，迅速向电转杯中加入1mL冰预冷的山梨醇，重悬细胞后，转移至新离心管中，于30℃孵育5h。
5)将培养液离心，上清弃至100μL，混匀后均匀的涂布在平板筛选培养基（含G418300mg/L）上，在30℃恒温培养箱中培养48‐72h至长出单菌落。
3.重组菌株的鉴定
提取转基因酵母的DNA作为模板，通过PCR扩增检测整合表达载体在转基因酵母中的存在，PCR扩增的引物为PKG1的5’端引物，和cup1基因的3’端引物，扩增电泳图如图2所示：1道为DL2000maker（购自于大连宝生物工程有限公司）；2道为质粒pFA6a-PGK1-cup1-rDNA阳性对照；2-3道为以S.cerevisiae4126-cup1DNA为模板的PCR扩增产物；4道为阴性对照（以S.cerevisiae4126DNA为模板的PCR产物）。该实验结果说明在基因工程菌细胞内有目的基因即酿酒酵母金属硫蛋白的存在。
实施例3本发明中利用金属硫蛋白转基因酵母制备的重金属生物吸附材料对重金属的耐受性实验和吸附能力实验
1.重金属耐受性实验
本发明将构建的金属硫蛋白转基因酵母S.cerevisiae4126-cup1和出发菌S.cerevisiae4126在相同的YPD培养基中培养过夜，然后按照1：100的比例接种到100mL新鲜培养基中培养到OD600为1.5。分别配置含有Cu(II)（硫酸铜）、Cr(VI)（重铬酸钾）、Cd(II)（氯化镉）的YPD平板，每种重金属设置2个浓度梯度。然后分别将菌液以10倍梯度逐级稀释，用移液枪分别吸取不同浓度的菌液2.5μL依次点样于含重金属的平板，设置不添加重金属的相同平板为对照，观察和分析酵母的生长状况。结果如表1所示：在未添加重金属的平板上，金属硫蛋白转基因重组菌和出发菌生长状况大致相同，都完全没有受到任何抑制；在添加重金属的平板上，金属硫蛋白转基因重组菌和出发菌都受到抑制，并且高浓度组抑制作用更强，此时，金属硫蛋白转基因重组菌生长明显好于对照组。在含低浓度铜（1.5mmol/L）铬（200μmol/L）、镉（120μmol/L）的平板上，出发菌基本无法生长，金属硫蛋白转基因重组菌生长无明显抑制，在含高浓度铜（2.0mmol/L）铬（250μmol/L）、镉（150μmol/L）的平板上对照组细胞生长完全受到抑制，而金属硫蛋白转基因重组菌能够生长形成菌落。这表明，过表达金属硫蛋白基因能够增强宿主对铜、铬、镉离子的耐受性，使菌体对重金属的耐受性明显提高。
表1重组菌和出发菌在添加不同重金属平板上的生长状态
| S.cerevisiae4126-cup1 | S.cerevisiae4126 | |
| Not add heavy metal | ++ | ++ |
| Cu(II)(1.5mmol/L) | ++ | - |
| Cu(II)(2.0mmol/L) | + | - |
| Cr(VI)(200μmol/L) | ++ | - |
| Cr(VI)(250μmol/L) | ++ | - |
| Cd(II)(120μmol/L) | ++ | - |
| Cd(II)(150μmol/L) | + | - |
注：++表示生长旺盛，+表示生长较差，-表示不生长
2.重金属吸附能力实验
本发明将构建的金属硫蛋白转基因重组菌S.cerevisiae4126-cup1和出发菌S.cerevisiae4126在相同的YPD培养基中培养过夜，然后按照1：100的比例接种到扩大培养基中培养36h后，抽滤收集菌体，用清水清洗菌体3次，将通过以上过程制备的菌体用于后续实验。吸附实验在磁力搅拌反应器中进行，Cr(VI)离子吸附实验的条件为：菌体干重10g/L，Cr(VI)初始浓度50mg/L，搅拌转速150r/min，30℃，初始pH2；Cu(II)离子吸附实验条件为菌体干重5g/L，Cu(II)初始浓度50mg/L，搅拌转速150r/min，30℃，初始pH5。实验中采用二苯碳酰二肼分光光度法测定溶液中Cr(VI)浓度，采用高锰酸钾氧化法测定溶液中总铬浓度，采用原子吸收分光光度计测定溶液中Cu(II)浓度。实验结果如图3所示：相同条件下，金属硫蛋白转基因重组菌对六价铬的还原速率（14h）远远大于出发菌（21h），在总铬的去除率上金属硫蛋白转基因重组菌也要优于出发菌株。铜离子吸附实验中，金属硫蛋白转基因重组菌对铜离子的吸附量是出发菌株的3倍多，显著提高了S.cerevisiae4126对铜离子的吸附能力。本实验证明通过导入具有重金属吸附功能的金属硫蛋白多拷贝整合载体能显著增强S.cerevisiae4126对重金属的吸附能力，利用金属硫蛋白转基因重组菌制备的微生物吸附材料在重金属废水治理领域具有极大的应用潜力。
Claims (2)
1.一种金属硫蛋白转基因酵母的构建方法，将从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 288c中克隆的金属硫蛋白基因连接到pFA6a载体上，然后再将S. cerevisiae 288c 3-磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子拼接到载体上，最后将S. cerevisiae 288c rDNA基因作为同源臂连接到上述载体上，从而得到具有重金属吸附功能的多拷贝整合表达载体pFA6a-PGK1-cup1-rDNA，将其线性化后转化酿酒酵母S. cerevisiae 4126细胞内，利用G418作为筛选标记，即可筛选到具有重金属吸附功能的金属硫蛋白转基因酵母；其特征在于：
金属硫蛋白基因来源于S. cerevisiae 288c，利用S. cerevisiae 288c 3-磷酸甘油酸激酶基因（PGK1）启动子进行表达，利用rDNA在酵母细胞内存在100-200个重复单元，以rDNA作为同源整合位点实现目的基因的多拷贝整合表达。
2.利用权利要求1中所述的金属硫蛋白转基因酵母制备重金属生物吸附材料的方法，其特征在于，将转基因酵母菌在葡萄糖浓度为20 g/L的YPD培养基中培养过夜，然后按照1：100的比例接种到葡糖糖浓度为60 g/L的YPD培养基中培养36 h后，抽滤收集菌体，用清水清洗3次，经过以上过程制备的菌体即为重金属生物吸附材料。
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Granted publication date: 20150429 Termination date: 20210307 |
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