CN104774865A - 一株金属硫蛋白细胞表面展示酵母及其在重金属吸附中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株金属硫蛋白细胞表面展示酵母及其在重金属吸附中的应用。该金属硫蛋白细胞表面展示酵母是通过整合载体，将金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和组成型启动子P_PGK1基因整合到宿主菌染色体上而获得的，在其细胞表面可持续地稳定表达金属硫蛋白。本发明的重组酿酒酵母对Cd²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺等多种重金属均具有较好的吸附能力和耐受性，如对50mg/L的Cr⁶⁺完全还原需要12h，比出发菌株快6h，还原速率是出发菌株的1.5倍；对50mg/L的Cu²⁺、总Cr、Cd²⁺的去除率与出发菌株比较可分别提高13.35％、10.13％、19.39％，在重金属处理领域具有巨大的应用潜力。

Description

一株金属硫蛋白细胞表面展示酵母及其在重金属吸附中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术和环境工程重金属污染治理领域，具体涉及能够使金属硫蛋白在细胞表面表达的整合载体和该载体的构建方法、以及转化该整合载体得到的能够在细胞表面表达金属硫蛋白的转基因酵母和该酵母在制备重金属生物吸附材料中的应用。

背景技术

来自工业废物的重金属对环境的污染，已经成为当今世界重要的环境问题之一。重金属污染物主要来源于电镀业、冶金业、采矿业等，重金属污染物不可以通过化学或者生物处理被降解成无毒物质，其不仅可以永久存在于环境中，而且重金属可以在食物链中积累。环境和废水中重金属的去除成为社会关注的重要问题之一。

目前除去水溶液中的重金属的方法主要有物理、化学和生物技术。重金属处理的具体方法主要有化学沉淀、过滤、离子交换、电化学催化、膜技术、活性炭吸附、蒸发等，但是这些方法通常比较昂贵并且效率比较低，尤其是在重金属浓度比较低(1–100mg/L)时，而生物吸附方法与其他方法相比操作简单、高效快速、可以将重金属从ppt水平减少到ppb水平。故重金属生物吸附法是目前有效解决重金属污染的方法之一，国内外对生物吸附法在重金属吸附领域的应用做了大量的研究工作，其中，由于金属硫蛋白可对重金属特异性结合而被应用于重金属吸附的研究。

金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸、低分子量(3500-14000Da)、可被金属诱导表达的蛋白质，金属硫蛋白的半胱氨酸残基上的巯基可以结合生理重金属(如Zn²⁺、Cu²⁺)和外源重金属(如Cd²⁺、Hg²⁺、Ag²⁺、As³⁺)，金属硫蛋白中的巯基含量占氨基酸残基的30％。有许多研究表明，金属硫蛋白在细胞内可以提高微生物对重金属Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺、As³⁺等的耐性和吸附能力。而金属硫蛋白在细胞表面表达时，其可以避免金属离子的跨膜问题，金属硫蛋白可在细胞外直接结合金属离子，这不仅可以提高吸附速率，而且可以降低金属离子对细胞的损伤。Kuroda等^[1]将酵母金属硫蛋白通过α-凝集素细胞表面展示系统表达 在酿酒酵母的细胞表面，随后Cd²⁺的吸附率提高至27.10nmol/mg细胞干重，但该展示系统不能整合在酵母染色体上，酿酒酵母只有在筛选培养基中金属硫蛋白才能表达在细胞表面，Kuroda文中所使用的酿酒酵母是营养缺陷型的不易实现工业化应用，并且Kuroda文中的重组菌株对Cd²⁺和Cu²⁺等金属离子的吸附力也较低。目前还没有在细胞表面展示金属硫蛋白的能够对多种重金属离子如Cd²⁺、Cu²⁺、Cr等均具有高效吸附重金属离子能力的工业酵母细胞。Kuroda等^[1]构建的重组菌株只对Cd²⁺吸附能力有提高，但是对Cu²⁺和Cr都没有明显的效果。

参考文献： 

[1]Kuroda K,et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2003,63(2):182-186. 

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够在细胞表面展示金属硫蛋白的以有效的提高酵母细胞对重金属吸附能力的重组酵母，该重组酵母是通过能够使金属硫蛋白在细胞表面表达的整合载体，将金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和组成型启动子P_PGK1基因整合到宿主菌染色体上而获得的。

本发明是采用如下技术方案来实现的：

本发明的第一方面，提供一种能够使金属硫蛋白在细胞表面表达的整合载体，该整合载体是通过SEQ ID NO.2所示的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和SEQ ID NO.3所示的组成型启动子P_PGK1基因插入到载体pHO-2上而获得的。

其中所述金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因包括a–凝集素(AGA2)基因和金属硫蛋白基因(cup1)。

本发明的第二方面，提供所述的整合载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S.cerevisiae 288c的基因组DNA中克隆出cup1基因，如SEQ ID NO.1所示；其中PCR扩增反应的引物序列为：

cup1-F：CCGGAATTCATGTTCAGCGAATTAATTA

cup1-R：CCGCTCGAGGTCGATTAAACTTCCTTC

(2)将cup1插入到游离载体pYD1的EcoRⅠ和Xho I两限制性内切酶位点之间，获得重组载体pYD1/cup1；

(3)采用PCR扩增反应从重组载体pYD1/cup1中克隆出金属硫蛋白细胞 表面展示盒子基因AGA2/cup1，如SEQ ID NO.2所示；其中PCR扩增反应的引物序列为：

AGA2-cup1-F：GCGGTCGACGCTGTAATACGACTCACT

AGA2-cup1-R：AGACCCGGGACTTGCCCAATTCTCTTA

(4)将步骤(3)的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因插入到载体pHO-2的Sal I和Sma I两限制性内切酶位点之间，得到重组载体HAC；

(5)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S.cerevisiae 288c的基因组DNA中克隆出组成型启动子P_PGK1基因，如SEQ ID NO.3所示，并将其插入到重组载体HAC的BsiW I和Sal I两限制性内切酶位点之间，得到整合载体HACg；其中PCR扩增反应的引物序列为：

P_PGK1-F：GCACGTACGACTGTAATTGCTTTTAGTTG

P_PGK1-R：TACGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG。

本发明的第三方面，提供一种在细胞表面展示金属硫蛋白的具有高效吸附重金属离子功能的重组菌株，该重组菌株是通过本发明所述的整合载体，将SEQ ID NO.2所示的基因和SEQ ID NO.3所示的基因整合到宿主菌染色体上而获得的。

进一步地，所述的宿主菌为发酵性能良好的工业酿酒酵母S.cerevisiae 4126。

上述所述的重组菌株，以工业酿酒酵母S.cerevisiae 4126为宿主菌时的构建方法为：将HACg线性化后转化酿酒酵母S.cerevisiae 4126，利用G418抗生素为筛选标记，即可筛选到金属硫蛋白细胞表面展示酵母，将该金属硫蛋白细胞表面展示酵母命名为S.cerevisiae HACg，金属硫蛋白在酵母细胞表面表达的原理如图2所示。a-凝集素包括两部分Aga1蛋白和Aga2蛋白，Aga1蛋白在胞内表达后被分泌到细胞外，通过与细胞壁上的β-葡聚糖共价结合以固定在细胞壁上；而Aga2蛋白N端通过二硫键与Aga1蛋白，C端可以与金属硫蛋白融合表达，从而实现金属硫蛋白在细胞表面表达。

本发明的第四方面，提供本发明所述的重组菌株在制备重金属生物吸附材料中的应用。具体应用方法为：将本发明的重组菌株在葡萄糖浓度为30g/L的YPD种子培养基中培养16-18h，然后按照1％的接种量转接到葡萄糖浓度为60g/L的YPD发酵培养基中，发酵结束后，使用真空抽滤泵收集菌体，用去离子水清洗3次，所得菌体即可作为重金属生物吸附材料。

本发明的有益效果:

1.金属硫蛋白表达方式的选择，许多金属硫蛋白对重金属吸附影响的研究选择使用游离载体在宿主菌中表达，这存在的问题是，在没有选择压力的情况下，游离载体容易丢失不易于实现工业化应用，而整合载体的表达可以很好的避免这一问题。

2.金属硫蛋白表达位置的选择，当金属硫蛋白在细胞表面表达时，其可以避免金属离子的跨膜而直接结合金属离子，以提高吸附速率，并且降低金属离子对细胞的损伤，可以实现生物吸附剂再利用，以节约成本。

3.金属硫蛋白的组成型表达，金属硫蛋白表达的启动子是P_PGK1组成型启动子，可以保证金属硫蛋白在细胞表面的稳定表达，以实现金属硫蛋白细胞表面展示酵母对重金属吸附的工业化应用。

4.本发明所选用的出发菌株酿酒酵母S.cerevisiae 4126具有良好的发酵性能，并且已应用于工业发酵，废弃菌体易获得。

5.本发明中的金属硫蛋白细胞表面展示酵母不仅对多种重金属均有较好的吸附能力，并且与出发菌株相比重金属耐受性也得到提高，因此更适合应用于重金属废水的处理过程。

6.本发明中金属硫蛋白在酵母细胞表面表达，其可在胞壁上结合金属离子，从而提高重金属吸附的效率。

7.本发明中重组菌株对Cd²⁺、Cu²⁺、Cr⁶⁺三种重金属的吸附能力和耐受性都有较大提高。

附图说明

图1为原始载体pHO-2的质粒图谱；

图2为利用a–凝集素细胞表面展示金属硫蛋白的原理图；

图3为cup1基因、AGA2–cup1基因及P_PGK1基因的电泳图；

图4中，4a为质粒pYD1/cup1的EcoR I和Xho I双酶切验证电泳图；4b为质粒HAC的Sal I和Sma I双酶切验证电泳图；4c为质粒HACg的Bsi W I和Sal I双酶切验证电泳图；

图5为质粒HACg Not I酶切电泳图；

图6为重组菌S.cerevisiae HACg的PCR验证电泳图；

图7为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126在25mg/L Cr⁶⁺的液体培养基中生长的最大OD₆₂₀；

图8为8S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126在25mg/L Cu²⁺的液体培养基中生长的最大OD₆₂₀；

图9为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126在70μmol/L Cd²⁺的液体培养基中生长的最大OD₆₂₀；

图10为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126对Cr⁶⁺的吸附曲线；

图11为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126对总Cr的去除率(12h)；

图12为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126对Cu²⁺的去除率(20h)；

图13为S.cerevisiae HACg和S.cerevisiae 4126对Cd²⁺的去除率(14h)。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

本发明所使用的核苷酸序列来源如下：酿酒酵母金属硫蛋白基因(cup1)来源于S.cerevisiae 288c(ATCC No 204508)，PCR克隆产物电泳结果如图3a；金属硫蛋白细胞表面展示盒子(AGA2/cup1)来源于pYD1/cup1，PCR克隆产物电泳结果如图3b，pYD1购于Invitrogen公司；3’磷酸甘油酸激酶基因启动子(P_PGK1)来源于S.cerevisiae 288c，PCR克隆产物电泳结果如图3c；质粒pHO-2为美国犹他大学的Stillman教授赠送(其构建方法参见Voth W P,Richards J D,Shaw J M,et al.Yeast vectors for integration at the HO locus[J].Nucleic acids research,2001,29(12):e59-e59.)，质粒图谱如图1。

本发明所用引物名称以及其序列如表1，划线部分为酶切位点；基因名称以及其序列如表2。

表1.引物名称以及其序列

表2.基因以及其核苷酸序列

实施例1金属硫蛋白细胞表面展示整合载体的构建

1.酿酒酵母S.cerevisiae 288c DNA提取以及cup1基因的PCR扩增

酿酒酵母S.cerevisiae 288c接种于YPD培养基中，过夜培养，离心收集细胞，利用玻璃珠法提取得到S.cerevisiae 288c酵母菌基因组DNA。

根据金属硫蛋白(NCBI Reference Sequence:NM_001179183.1)序列，设计上游引物cup1-F和下游引物cup1-R，在两条引物的5’端分别加上EcoRⅠ和Xho I酶切位点(横线部分为所述酶切位点)，以S.cerevisiae 288c基因组DNA为模板，利用大连宝生物公司的PCR酶，扩增cup1基因。PCR程序：94℃预变性5min；94℃ 1min，56.5℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸10min。

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图3a，电泳结果显示扩增基因片段在262bp附近呈现亮带，回收目的基因片段，得cup1基因，序列如SEQ ID No.1。

2.PCR扩增AGA2/cup1基因

(1)将步骤1得到的cup1基因和pYD1载体同时用EcoRⅠ和Xho I双酶切后，将得到的酶切cup1基因片段连接到线性化pYD1载体上；将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，获得连接有cup1基因的质粒pYD1/cup1。用EcoRⅠ和Xho I双酶切质粒pYD1/cup1，并用1％琼脂糖凝胶电泳验证，如图4a，图4a显示约4744bp和254bp两条亮带，说明连接成功；

(2)根据pYD1/cup1中的AGA2/cup1序列，设计上游引物AGA2-cup1-F和下游引物AGA2-cup1-R，在两条引物的5’端分别加上Sal I和Sma I酶切位点，以步骤(1)得到的pYD1/cup1质粒为模板扩增AGA2/cup1基因。PCR程序：94℃预变性5min；94℃ 1min，58.9℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图3b，电泳结果显示扩增基因片段在1176bp附近呈现亮带，回收目的基因片段，得AGA2/cup1基因，序列如SEQ ID No.2。

3.PCR扩增P_PGK1基因

根据P_PGK1启动子序列(GenBank Accession No.BK006937.1)，设计上游引物P_PGK1-F和下游引物P_PGK1-R，在两条引物的5’端分别加上BsiW I和Sal I酶切位点，以步骤1得到的S.cerevisiae 288c基因组为模板扩增P_PGK1启动子基因。PCR程序：94℃预变性5min；94℃ 1min，58℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图3c，电泳结果显示扩增基因片段在884bp附近呈现亮带，回收目的基因片段，得P_PGK1基因，序列如SEQ ID No.3。

4.金属硫蛋白细胞表面展示整合表达载体pHO–P_PGK1–AGA2–cup1–HO的制备

(1)将AGA2/cup1基因和pHO-2整合载体同时用Sal I和Sma I双酶切后，将得到的酶切AGA2/cup1基因片段连接到线性化pHO-2整合载体上；将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得连接有AGA2/cup1基因的质粒HAC。

用Sal I和Sma I双酶切质粒HAC，并用1％琼脂糖凝胶电泳验证，如图4b，图4b显示在约6049bp和1168bp两亮带，说明连接成功；

(2)将P_PGK1基因和HAC载体同时用BsiW I和Sal I双酶切后，将得到的酶切P_PGK1基因片段连接到线性化HAC载体上；将连接产物转化到感受态细胞E.coli DH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，获得连接有P_PGK1/AGA2/cup1基因的质粒pHO–P_PGK1–AGA2–cup1–HO(简称为HACg)。

用BsiW I和Sal I双酶切质粒HACg，并用1％琼脂糖凝胶电泳验证，如图4c，图4c显示在约7206bp和877bp两条亮带，说明连接成功；

在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用大连宝生物公司的T4DNA连接酶进行连接，具体连接体系为：

在上述步骤中，所述的连接产物的大肠杆菌的转化，按如下方法进行：

(1)取一管感受态细胞E.coli DH5α于冰上缓慢溶解，加入要转化的质粒或连接产物(10μL)，轻混后冰浴30min；

(2)42℃热激90s后，迅速冰浴5min；

(3)加入900μL，37℃温浴的LB培养基，37℃振荡培养45min～1h；

(4)3000rpm离心5min，浓缩菌体至150μL左右，涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB选择平板上，37℃倒置培养14h；

(5)挑取单克隆，进行后续质粒提取以及验证实验。

在上述步骤中，所述的连接产物阳性克隆验证，按如下方法进行：

(1)从氨苄青霉素平板上挑取单菌落，接入10mL LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃振荡培养13h；

(2)取5mL菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒；

(3)取2μL质粒提取液进行琼脂糖凝胶电泳，检测提取的质粒浓度；

(4)将提取的质粒进行双酶切，验证基因片段与载体的连接效果；

(5)将酶切验证正确的重组质粒进行测序或者进行其他实验(如图4)，测序委托大连宝生物公司完成。

实施例2金属硫蛋白细胞表面展示酵母(S.cerevisiae HACg)的获得

1.电击法转化S.cerevisiae 4126细胞感受态制备

(1)从斜面取一环S.cerevisiae 4126酵母菌接种于YPD培养基中，30℃，150rpm震荡培养18h；

(2)将培养18h的酵母菌2％(v/v)接入100mL YPD培养基，30℃ 150rpm培养12h，至OD约为1.0；

(3)将酵母培养液，冰上放置15min，使酵母细胞停止生长，然后将菌液平均转移到两个无菌的50mL的离心管中，4℃ 3000rpm离心5min收集菌体；

(4)用冰预冷超纯水洗菌体2次，离心条件同上；

(5)将装有菌体的离心管置于冰上，各加入40mL的冰预冷无菌的1mol/L山梨醇，使细胞悬浮于其中，4℃ 3000rpm离心5min收集菌体，此操作重复一次；

(6)将细胞悬浮于0.5mL的预冷无菌的1mol/L山梨醇中，轻混后置冰上。

2.电击法转化与转化子验证

(1)80μL感受态细胞转移到冰上预冷的1.5mL离心管中，加入10μL的Not I线性化的HACg(如图5)胶回收4955bp的基因片段，混匀后置冰上放置5min；

(2)将混合物加入冰预冷的0.4电转杯，冰浴，可以轻敲两下，使液体沉到杯底，擦干水滴，放在电转仪上；

(3)设置酵母参数“fungi”，“Sc04”，点击Pulse；

(4)取出电转杯，立即加入1mL冰预冷1mol/L山梨醇，用枪轻轻吹打，在温和转移至1.5mL离心管中，30℃静置培养5h；

(5)浓缩菌体体积至200μL左右，涂布筛选培养基平板(本实验使用G418抗生素)，30℃培养48h后挑取单菌落进行阳性验证，阳性菌落菌株命名为S.cerevisiae HACg；

(6)提取转化子(S.cerevisiae HACg)的基因组DNA，进行PCR验证，比较电泳条带位置是否与阳性对照相同，PCR采用的引物为pc-F和pc-R，PCR扩增产物电泳图如图6所示，其中泳道M1为DL2000maker(购自于大连宝生物工程有限公司)，泳道1为出发菌株S.cerevisiae 4126基因组DNA的PCR扩增产物(无扩增产物)，泳道2为阳性对照质粒HACg的PCR扩增产物(长度约1600bp)，泳道3为S.cerevisiae HACg基因组DNA的PCR扩增产物(长度约1600bp)。图6的结果说明金属硫蛋白基因成功插入到酿酒酵母染色体。对阳性菌进行甘油保菌。

实施例3重金属耐受性实验

将构建的S.cerevisiae HACg和出发菌株S.cerevisiae 4126从斜面接种到液体种子YPD种子培养基中，30℃ 150rpm摇瓶培养16～18h，然后以1％的接种量，接种到YPD种子培养基，进行二次活化，当OD₆₂₀达到4左右，以5％的接种量，分别接种到含一定浓度的Cu²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺的YPD液体培养基中，摇瓶培养一定时间，取样稀释10倍在620nm处测OD值。

实验结果表明，S.cerevisiae HACg相对于出发菌株S.cerevisiae 4126对重金属Cr⁶⁺、Cu²⁺、Cd²⁺的耐性都有明显提高。如图7，S.cerevisiae 4126在含有25mg/L Cr⁶⁺的培养基中生长的最大OD₆₂₀为5.13，而S.cerevisiae HACg可达到5.47，与S.cerevisiae 4126相比较提高了6.63％；如图8，S.cerevisiae 4126在含有25mg/L Cu²⁺的培养基中生长的最大OD₆₂₀为4.99，而S.cerevisiae HACg可达到6.63，与S.cerevisiae 4126相比较提高了32.87％；如图9，S.cerevisiae 4126在含有70μmol/L Cd²⁺的培养基中生长的最大OD₆₂₀为3.97，而S.cerevisiae HACg可达到4.56，与S.cerevisiae 4126相比较提高了14.86％。

实施例4重金属吸附能力实验

将构建的S.cerevisiae HACg和出发菌株S.cerevisiae 4126从斜面接种到液体种子YPD种子培养基中，150rpm摇瓶培养16～18h，然后以1％的接种量，接种到YPD发酵培养基中发酵36h，使用抽滤泵抽滤收集菌体，菌体用去离子水清洗3次作为重金属吸附材料。Cr⁶⁺吸附实验：菌体干重10g/L，Cr⁶⁺初始浓度50mg/L，搅拌转速150rpm，30℃，初始pH 2，在磁力搅拌反应器中进行，每隔2h取样测溶液中总Cr浓度；Cu²⁺吸附实验：菌体干重10g/L，Cu²⁺初始浓度50mg/L，搅拌转速150rpm，30℃，初始pH 5，在磁力搅拌反应器中进行，每隔2h取样测溶液中Cu²⁺浓度；Cd²⁺吸附实验：菌体干重10g/L，Cd²⁺初始浓度50mg/L，搅拌转速150rpm，30℃，初始pH 5，在磁力搅拌反应器中进行，每隔2h取样测溶液中Cd²⁺浓度。

实验结果表明，S.cerevisiae HACg相对于发菌株S.cerevisiae 4126对重金属Cr⁶⁺、总Cr、Cu²⁺、Cd²⁺的吸附性能都有明显提高。如图10，S.cerevisiae HACg对Cr⁶⁺完全吸附和还原需要12h，比S.cerevisiae 4126快6h，还原速率是出发菌株的1.5倍，可以节约大量时间；如图11，S.cerevisiae 4126对50mg/L总Cr的最大去除率为78.08％，而S.cerevisiae HACg可达到88.21％，与S.cerevisiae  4126相比较去除率提高了10.13％；如图12，S.cerevisiae 4126对50mg/L Cu²⁺的最大去除率为43.88％，而S.cerevisiae HACg可达到57.33％，与S.cerevisiae 4126相比较提高了13.35％；如图13，在14h时S.cerevisiae 4126对50mg/L Cd²⁺的最大去除率为62.68％，而S.cerevisiae HACg可达到82.07％，与S.cerevisiae 4126相比较提高了19.39％。

Claims (5)

1.一种能够使金属硫蛋白在细胞表面表达的整合载体，其特征在于，该整合载体是通过SEQ ID NO.2所示的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因和SEQ ID NO.3所示的组成型启动子P_PGK1基因插入到载体pHO-2上而获得的。

2.权利要求1所述的整合载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S.cerevisiae 288c的基因组DNA中克隆出cup1基因，如SEQ ID NO.1所示；其中PCR扩增反应的引物序列为：

cup1-F：CCGGAATTCATGTTCAGCGAATTAATTA 

cup1-R：CCGCTCGAGGTCGATTAAACTTCCTTC 

(2)将cup1插入到游离载体pYD1的EcoR Ⅰ和Xho I两限制性内切酶位点之间，获得重组载体pYD1/cup1；

(3)采用PCR扩增反应从重组载体pYD1/cup1中克隆出金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因AGA2/cup1，如SEQ ID NO.2所示；其中PCR扩增反应的引物序列为：

AGA2-cup1-F：GCGGTCGACGCTGTAATACGACTCACT

AGA2-cup1-R：AGACCCGGGACTTGCCCAATTCTCTTA

(4)将步骤(3)的金属硫蛋白细胞表面展示盒子基因插入到载体pHO-2的Sal I和Sma I两限制性内切酶位点之间，得到重组载体HAC；

(5)采用PCR扩增反应从酿酒酵母S.cerevisiae 288c的基因组DNA中克隆出组成型启动子P_PGK1基因，如SEQ ID NO.3所示，并将其插入到重组载体HAC的BsiW I和Sal I两限制性内切酶位点之间，得到整合载体HACg；其中PCR扩增反应的引物序列为：

P_PGK1-F：GCACGTACGACTGTAATTGCTTTTAGTTG

P_PGK1-R：TACGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG 。

3.在细胞表面展示金属硫蛋白的具有高效吸附重金属离子功能的重组菌株，其特征在于，该重组菌是通过权利要求1所述的整合载体，将SEQ ID NO.2所示的基因和SEQ ID NO.3所示的基因整合到宿主菌染色体上而获得的。

4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述的宿主菌为工业酿酒酵母S.cerevisiae 4126。

5.权利要求3或4所述的重组菌株在制备重金属生物吸附材料中的应用。