CN103194510A

CN103194510A - 一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法

Info

Publication number: CN103194510A
Application number: CN2013101323091A
Authority: CN
Inventors: 梁运祥; 苏一龙
Original assignee: ZHAOQING LONGLINE BIOTECHNOLOGY Ltd Co
Current assignee: ZHAOQING LONGLINE BIOTECHNOLOGY Ltd Co
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明涉及一种可用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的方法，该方法是以壳聚糖为原料，利用纤维素酶和壳聚糖酶联合酶解制备壳寡糖，本发明方法易于掌握，工艺稳定，得到的产品可提高水稻种子发芽率，增强水稻植株的抗病能力和光合作用效率，水稻产量增产幅度大于10%。

Description

一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种联合酶解生产壳寡糖的方法，属于生物酶解技术领域。具体而言是以壳聚糖为原料，利用纤维素酶和壳聚糖酶制备壳寡糖的方法。

背景技术

甲壳素（Chitin）也叫甲壳质、几丁质等，存在于虾蟹等甲壳类动物以及昆虫、真菌细胞壁中等，是地球上仅次于纤维素的第二大有机物。一百多年来对甲壳素的研究，揭示了甲壳素的化学本质和一系列重要作用，并形成以甲壳素为原料生产一系列具有重大经济效益和产业影响的高技术产品。壳聚糖是迄今为止发现的自然界中唯一存在的阳离子型可食用纤维，在医药、食品、化妆品和农业等方面都有广泛且重要的应用价值。甲壳素应用领域已拓展到工业、农业、环境保护、国防、人民生活等各方面。

由于甲壳素不溶于水，工业生产上是先将甲壳素转化为壳聚糖，再进一步转化为具有不同分子量和生物活性及用途的壳寡糖产品。许多研究表明，单糖、二糖生物活性较低，聚合度为4～10的壳寡糖生物活性较高。聚合度为4～6的壳寡糖能够调控植物根瘤菌的生成，激活植物抵抗病原微生物的能力。　

现有壳寡糖的制备方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法，由于酶降解法可特异性地、选择性地切断壳聚糖β-1，4糖苷键，降解过程和降解产物的分子量相对易于控制，可得到所需分子量范围的壳寡糖，而且酶法降解是在较温和的条件下进行的，相对于其他两种方法，不需加入大量试剂，环境污染较少。目前已发现30多种专一性或非专一性酶可用于壳聚糖的降解，专一性酶包括甲壳素酶、壳聚糖酶，非专一性酶包括溶菌酶、蛋白酶、纤维素酶等。然而，现有酶解法制备壳寡糖的制造成本高，产品纯度低，严重制约了壳寡糖的开发应用。技术上的主要问题是专一性壳聚糖酶难以获得，其工业发酵单位低，制造成本高:酶解生产1克壳寡糖通常需要消耗50单位左右壳聚糖酶。目前，50单位/mL（或克）壳聚糖酶价格在500元人民币左右/千克，每生产1千克壳寡糖，就需要消耗1千毫升或1千克壳聚糖酶，用酶成本在500元人民币或以上；如果加上壳聚糖原料成本（壳聚糖原料价格150元人民币/千克，按照平均酶解转化率50%计算，生产1千克壳寡糖需要2千克壳聚糖原料）和其他加工费用，每千克壳寡糖的制造成本超过1000元人民币。如此高的成本和价格成为市场的主要制约因素；纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等非专一性酶解酶相对便宜，但可控性差。以纤维素酶为例，其充分酶解（即通过延长酶解时间，至酶解反应自行终止）壳聚糖可获得转化率较高的低聚合度（3-4个分子聚合度）壳寡糖产品，并有一定稳定性，但却不能稳定获得其他聚合度的壳寡糖产品，因此，其应用有限。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用非特异性和特异性壳聚糖酶的联合作用制备壳寡糖的方法，可用于水稻浸种和叶面喷施，与目前技术和产品比较，其生产可控性强，产品质量稳定，制造成本明显下降。

本发明的目的将通过下列详细说明和描述来进一步阐述。

本发明通过非特异性和特异性壳聚糖酶的联合作用，首先利用非特异性酶对大分子壳聚糖酶进行初级酶解，控制其酶解程度，当酶解产物平均分子量在目标产物分子量的10倍左右时，灭酶停止初级酶解，再利用特异性酶进行次级酶解，当底物最大量转化为目标产物时，灭酶停止二次酶解。

本发明的一种联合酶解生产可用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的方法，是以市售壳聚糖为原料，利用纤维素酶和壳聚糖酶联合酶解制备而成，包括下述步骤：

a、准备原料，选择市售的合格壳聚糖为原料；

b、制备壳聚糖胶体溶液，以水为溶剂，并添加乙酸促溶；

c、纤维素酶酶解，在壳聚糖胶体溶液中添加纤维素酶，控制温度、pH进行酶解，酶解结束后加温灭酶；

d、壳聚糖酶接替酶解，在纤维素酶酶解基础上添加壳聚糖酶，控制温度、pH进行酶解，酶解结束后加温灭酶；

e、成品处理。

所述纤维素酶为利用黑曲霉、里氏木霉或绿色木霉发酵生产的纤维素酶。

所述壳聚糖酶为利用Mitsuaria sp，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌或烟曲霉发酵生产的壳聚糖酶。

所述壳聚糖胶体溶液的浓度为1-10%，优选为1-4%。

更进一步地，本发明的用于水稻浸种和叶面喷施壳寡糖制备方法，其工艺步骤如下：

1）、备料：以市售壳聚糖为原料，需符合如下质量要求：

产品纯正，由虾或蟹外壳加工生产而成，壳聚糖含量> 95%（干基）。外观为白色粉末。脱乙酰度>85%，pH 7.0-8.0，干燥失重<8.0%，灼烧残渣<1.0%，不溶物<1.0%，重金属（以Pb计）≤10ppm，砷≤0.5ppm，菌落总数≤1000 cfu/g，粒度40目-80目。

2）、壳聚糖胶体溶液制备：

制备浓度为1%-4%的壳聚糖水溶液。称取壳聚糖原料，加入到其质量10-20倍的水中（自来水或纯净水，常温即可），静置溶胀30分钟后，按照1g壳聚糖加入浓度为10 mol/L的乙酸溶液1 mL的量加入适量乙酸，持续搅拌至壳聚糖完全溶解，再加水调整到所需壳聚糖浓度并使用乙酸钠调节pH为3-7。

3）、初级酶解：

将壳聚糖溶液升温至37℃-55℃，按照每克壳聚糖底物添加10-50单位纤维素酶，酶解温度37℃-55℃，酶解pH3-7，酶解时间为3-8小时。酶解结束后，升温至100℃并维持1分钟，然后迅速冷却至次级酶解所需温度。

4）、次级酶解

经过初级酶解的壳聚糖酶解溶液，按照每克壳聚糖原料加入5-10单位的壳聚糖酶，维持温度37℃-55℃，酶解pH3-7，保温酶解5-10小时，酶解结束后，升温至65℃并维持5分钟，然后迅速冷却至室温。最终酶解产物中2500-3000分子量的产物质量占总质量的70%或以上。

5）成品处理

检验合格的壳寡糖最终酶解液加入防腐剂或适当稀释后加入防腐剂后进行灌装或浓缩后喷雾干燥制成干粉再进入检验、包装工序。

本发明的方法和直接获得的产品技术效果显著，实现了本发明的目的，目标产物含量高，底物转化较彻底，用酶成本低，可控性强，操作容易，大大提高了壳寡糖的质量，积极效果主要表现在：

1、目标产物含量高，通过纤维素酶和壳聚糖酶的联合酶解，目标产物含量达到70%或以上。

2、显著降低壳寡糖的制造成本，酶成本减少到现有技术的20%左右，壳聚糖的转化率比现有技术提高30%左右，总成本下降到现有技术的25%左右。

3、对水稻增产效果明显，发芽率平均提高10%，产量平均提高12%。

酶法降解壳聚糖生产壳寡糖产品，不能直接获得单一酶解产物，无论哪一种酶，其酶解产物都是不同分子量或聚合度不同的多种分子，只是酶种类的不同和酶解条件的差异，产物分子量分布或集中或分散。如以一种溶菌酶酶解分子量为100万壳聚糖后，其分子量分布如下：分子量1万以上产物质量占总质量的55%，5000-10000分子量占20%，5000以下分子量占25%，分子量分布比较分散；而以一种纤维素酶充分酶解壳聚糖后，10000分子量占11%，5000-10000分子量占4%， 5个聚合度-5000分子量占15%，4个聚合度以下产物占70%，分子量分布则比较集中。如果目标产物是5000-10000分子量的产物，对溶菌酶酶解产物就需要通过分离手段将大于10000分子量和小于5000分子量产物分离出去，目标产物转化率为20%，即需要消耗4份壳聚糖原料才能生产1份壳寡糖产品，而对于纤维素酶解产物，其目标产物含量低，就没有生产应用价值。不过，对有些用途的产品可以不需要分离，只是其“纯度”不高。如具有明显的农业增产效应壳寡糖分子量分布为2500-3500或平均分子量为3000，其他分子量产物对农作物没有副作用，因此，也不需要将它们分离出去，以节省成本。鉴于这种情况，实际在壳寡糖生产与应用中，通常是以分子量分布或者是平均分子量来约定产品品质和说明其质量特性，由于分子量分布检测上的困难，更多是以平均分子量来表示。

在本发明中使用的所有原材料和添加剂等均是常规使用的，可以从市场购得。在本发明中，如非特指，所有的量、百分比、份均为重量单位。

下面结合实施例对本发明进行具体的描述。由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，下列实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或等同本发明的范围内的改变均被本发明包含。

具体实施方式

实施例1：配制1%的壳聚糖胶体溶液：称取5 kg壳聚糖粉末，与100 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入浓度为10 mol/L的醋酸5 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH3，加水至500 L。即得浓度为1%，pH为3的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量2500道尔顿，分子量小于3000产物占总质量55%。

实施例2：配制2%的壳聚糖胶体溶液：称取10 kg壳聚糖粉末，与200 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸10 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH4.5，加水至500 L。即得浓度为2%，pH=4.5的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量2600道尔顿，分子量小于3000产物占总质量52%。

实施例3：配制3%的壳聚糖胶体溶液：称取15 kg壳聚糖粉末，与300 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸15 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH3，加水至500 L。即得浓度为3%，pH=3的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量2800道尔顿，分子量小于3000产物占总质量45%。

实施例4：配制4%的壳聚糖胶体溶液：称取20 kg壳聚糖粉末，与250 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸20 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH3，加水至500L。即得浓度为4%，pH=3的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量30000道尔顿，分子量小于3000产物占总质量46%。

实施例5、配制1%的壳聚糖胶体溶液：称取5 kg壳聚糖粉末，与100 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸5 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH5.5，加水至500 L。即得浓度为1%，pH=5.5的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为30单位/克，酶解温度50摄氏度，酶解时间3小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照10单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为6小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量2700道尔顿，分子量小于3000产物占总质量55%。

实施例6、配制4%的壳聚糖胶体溶液：称取20 kg壳聚糖粉末，与200 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸20 L（1 L/kg壳聚糖粉末），持续搅拌约2 h，至完全溶解。溶液用10 mol/L的NaAc调至pH5.0，加水至500 L。即得浓度为4%，pH=5.0的壳聚糖胶体溶液。初级酶解：纤维素酶添加量为50单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照10单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为10小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶。酶解最终结果壳寡糖平均分子量2800道尔顿，分子量小于3000产物占总质量65%。

Claims

1.一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，其特征在于，它的工艺步骤包括：a、以壳聚糖为原料；b、制备壳聚糖胶体溶液，以水为溶剂，并添加乙酸促溶；c、纤维素酶酶解，在壳聚糖胶体溶液中添加纤维素酶，控制温度、pH进行酶解，酶解结束后加温灭酶；d、壳聚糖酶接替酶解，在纤维素酶酶解基础上添加壳聚糖酶，控制温度、pH进行酶解，酶解结束后加温灭酶；e、成品处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖胶体溶液制备过程是按照所需壳聚糖浓度要求和壳聚糖溶液体积量取生产用水，将原料壳聚糖加水溶胀，之后添加乙酸促进壳聚糖溶解，至壳聚糖完全溶解后，再用乙酸钠调节至所需pH值。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶为利用黑曲霉、里氏木霉或绿色木霉发酵生产的纤维素酶；所述的壳聚糖酶为利用Mitsuaria sp，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌或烟曲霉发酵生产的壳聚糖酶。

4.按权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖胶体溶液浓度为1%-10%，所述的壳聚糖溶液的pH为3-7。

5.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶添加量为10-50单位/g壳聚糖，酶解温度为37℃-55℃，酶解时间为3-8小时，灭酶温度为100℃，维持1分钟；所述的壳聚糖酶添加量为5-10单位/g壳聚糖，酶解温度为37℃-55℃，酶解时间为5-10小时，灭酶温度为65℃，维持5分钟。

6.一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，其工艺步骤如下：

1）、备料：以市售壳聚糖为原料，需符合如下质量要求：

由虾或蟹外壳加工生产而成，壳聚糖含量> 95%（干基），外观为白色粉末，脱乙酰度>85%，pH 7.0-8.0，干燥失重<8.0%，灼烧残渣<1.0%，不溶物<1.0%，重金属（以Pb计）≤10ppm，砷≤0.5ppm，菌落总数≤1000 cfu/g，粒度40目-80目；

2）、壳聚糖胶体溶液制备：

制备浓度为1%-4%的壳聚糖水溶液：称取壳聚糖原料，加入到其质量10-20倍的水中，静置溶胀30分钟后，所述的乙酸促溶时的乙酸添加量为每1g壳聚糖中加入浓度为10 mol/L的乙酸溶液1 mL，持续搅拌至壳聚糖完全溶解，再加水调整到所需壳聚糖浓度并使用乙酸钠调节pH为3-7；

3）、初级酶解：

将壳聚糖溶液升温至37℃-55℃，按照每克壳聚糖底物添加10-50单位纤维素酶，酶解温度37℃-55℃，酶解pH3-7，酶解时间为3-8小时；酶解结束后，升温至100℃并维持1分钟，然后迅速冷却至次级酶解所需温度；

4）、次级酶解

经过初级酶解的壳聚糖酶解溶液，按照每克壳聚糖原料加入5-10单位的壳聚糖酶，维持温度37℃-55℃，酶解pH3-7，保温酶解5-10小时，酶解结束后，升温至65℃并维持5分钟，然后迅速冷却至室温；最终酶解产物中2500-3000分子量的产物质量占总质量的70%或以上；

5）、成品处理

7.根据权利要求6所述的一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，首先配制浓度为1%的壳聚糖胶体溶液：称取5 kg壳聚糖粉末，与100 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入浓度为10 mol/L的醋酸5 L，持续搅拌约2 h，至完全溶解，溶液用10 mol/L的NaAc调至pH3，加水至500 L，即得浓度为1%，pH为3的壳聚糖胶体溶液；初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶；酶解最终结果壳寡糖平均分子量2500道尔顿，分子量小于3000产物占总质量55%。

8.根据权利要求6所述的一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，首先配制浓度为4%的壳聚糖胶体溶液：称取20 kg壳聚糖粉末，与200 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸20 L，持续搅拌约2 h，至完全溶解，溶液用10 mol/L的NaAc调至pH5.0，加水至500 L，即得浓度为4%，pH=5.0的壳聚糖胶体溶液；初级酶解：纤维素酶添加量为50单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照10单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为10小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶；酶解最终结果壳寡糖平均分子量2800道尔顿，分子量小于3000产物占总质量65%。

9.根据权利要求6所述的一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，首先配制2%的壳聚糖胶体溶液：称取10 kg壳聚糖粉末，与200 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸10 L，持续搅拌约2 h，至完全溶解，溶液用10 mol/L的NaAc调至pH4.5，加水至500 L，即得浓度为2%，pH=4.5的壳聚糖胶体溶液；初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶，酶解最终结果壳寡糖平均分子量2600道尔顿，分子量小于3000产物占总质量52%。

10.根据权利要求6所述的一种用于水稻浸种和叶面喷施的壳寡糖的制备方法，首先配制3%的壳聚糖胶体溶液：称取15 kg壳聚糖粉末，与300 L蒸馏水混合，溶胀30 min后，向其中加入10 mol/L醋酸15 L，持续搅拌约2 h，至完全溶解，溶液用10 mol/L的NaAc调至pH3，加水至500 L，即得浓度为3%，pH=3的壳聚糖胶体溶液；初级酶解：纤维素酶添加量为10单位/克，酶解温度45摄氏度，酶解时间5小时；将温度升温至100摄氏度1分钟进行灭酶，然后降温至50摄氏度；次级酶解：按照5单位/克底物加入壳聚糖酶，溶液pH不变，酶解温度50摄氏度，酶解时间为8小时；酶解结束后，升温至65摄氏度5分钟进行灭酶，酶解最终结果壳寡糖平均分子量2800道尔顿，分子量小于3000产物占总质量45%。