CN105950676A - 一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于氨基酸生产领域，公开了一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备玉米秸秆水解液，步骤2）制备米糠提取物，步骤3）制备废弃菌体水解液，步骤4）浓缩母液，步骤5）制备发酵培养基，步骤6）发酵制备聚谷氨酸，步骤7）分离和纯化。本发明工艺成本低廉，操作简单，产酸效率和纯度高。

Description

一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺

技术领域

本发明属于氨基酸生产领域，具体涉及一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺。

背景技术

聚谷氨酸(简称PGA)是谷氨酸单体以γ-位上的酰胺键聚合而形成的同质多肽。它具有水溶性，可生物降解，不含毒性，可广泛应用于食品工业、化妆品、保健、水处理、废水处理、卫生用品、医疗等领域，例如可以用作为增稠剂、冷冻保护剂、缓释剂、药物载体、生物粘合剂、保湿剂、生物可降解纤维、高吸水性树脂、生物絮凝剂和重金属离子吸收剂等。

现有技术研究聚谷氨酸发酵工艺主要集中在菌株改进，对于发酵培养基的改进较为罕见。开发成本低廉，而且产酸量高的培养基，最大限度地降低企业成本是我们研究的方向。基于上述技术问题，发展先进的酶法和化学法的水解新技术，制备高产率的碳源与可利用性氮源极有可能取得突破性进展。

玉米是北方地区种植的主要粮食作物，玉米秸秆作为农业废弃物，一般简单粉碎处理或者燃烧处理，既不能充分利用，也容易造成环境污染。研究显示，玉米秸秆含有30%以上的碳水化合物、2%-4%的蛋白质和05%-1%的脂肪，既可青贮，也可直接饲喂。就食草动物而言，2kg的玉米秸秆增重净能相当于1kg的玉米籽粒，特别是经青贮、黄贮、氨化及糖化等处理后，可提高利用率，效益将争更可观。据研究分析，玉米秸秆中所含的消化能为2235.8kJ/kg，且营养丰富，总能量与牧草相当。我们需要对玉米秸秆进行精细加工处理，使其具有良好的生态效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术发酵培养基成本高，分离纯化工艺繁琐等缺陷，提供了一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备玉米秸秆水解液，步骤2）制备米糠提取物，步骤3）制备废弃菌体水解液，步骤4）浓缩母液，步骤5）制备发酵培养基，步骤6）发酵制备聚谷氨酸，步骤7）分离和纯化。

具体地，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）制备玉米秸秆水解液：将玉米秸秆投入到粉碎机中粉碎，过100目筛，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，200rpm搅拌水解6小时，最后添加氨水，调节溶液的pH为6.9-7.1，即得；

步骤2）制备米糠提取物：

将米糠铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射8min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1%重量份的α-淀粉酶，升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得；

步骤3）制备废弃菌体水解液：利用微生物发酵制得谷氨酸发酵液，过滤收集废弃菌体，滤液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液备用；将上述废弃菌体烘干，粉碎机粉碎成粉末状，然后置于反应罐中, 加入5mol/L的盐酸，在60℃温度下搅拌水解24小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.0，即得；

步骤4）浓缩母液：将步骤3）所得母液浓缩至谷氨酸含量为13g/L的浓缩液；

步骤5）制备发酵培养基：按照重量百分比取各原料备用，其中：玉米秸秆水解液20%，废弃菌体水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，贝壳粉0.01%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.01%，其余为步骤4）所得浓缩液；

将玉米秸秆水解液，废弃菌体水解液，葡萄糖，米糠提取物，贝壳粉，硫酸镁以及磷酸二氢钾依次添加到浓缩液中，搅拌均匀，然后在温度108-110℃、维持时间15分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；

步骤6）发酵制备聚谷氨酸：培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液，然后按照9％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵42小时，得到聚谷氨酸发酵液；

步骤7）分离和纯化：往聚谷氨酸发酵液中加入相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌5min，然后静置15min，离心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的纯净水溶解沉淀，然后加入纳米硅藻土，搅拌均匀后进行板框过滤，收集滤液，调整滤液pH为中性，再加入占滤液0.5％质量分数的氯化钠，搅拌均匀，再缓慢加入与滤液相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌15min，再加入占滤液两倍体积的异丙醇，500转/min搅拌3min，然后置于4℃条件5小时，产品逐渐析出，经干燥、粉碎得到聚谷氨酸。

所述贝壳粉的粒径为100目

本发明取得的有益效果主要包括：

本发明直接水解废弃的菌体作为发酵原料，提供了丰富的氯化铵以及氨基酸氮源，可作为微生物发酵养料。

对玉米秸秆废弃物进行了粉碎和水解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及纤维素多糖等得到有效利用；米糠属于农业废弃物，其含有大量的蛋白质，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过生化处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；

利用谷氨酸生产结晶母液（含少量谷氨酸和大量铵盐）建立不外加谷氨酸的聚谷氨酸生产新工艺，既降低生产成本，又能提高谷氨酸发酵与聚谷氨酸联产的总体生产效率；

通过水解废弃菌体蛋白和利用结晶母液，开辟了聚谷氨酸生产廉价氮源提高的新策略，并结合玉米秸秆水解液等农业废弃物的联合应用，开创了一条利用非粮和废弃生物量水解的碳氮源生产聚氨基酸的创新技术，大大降低了成本，提高了企业利润。

本发明技术工艺用异丙醇取代了传统的其他有机溶剂，不仅可以提高产率，而且大大降低生产成本；其生产的γ-聚谷氨酸产品收率高、质量稳定，生产工艺简单可行。

具体实施方式

以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。

实施例1

一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：

步骤1）制备玉米秸秆水解液：将玉米秸秆投入到粉碎机中粉碎，过100目筛，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，200rpm搅拌水解6小时，最后添加氨水，调节溶液的pH为6.9-7.1，即得；

步骤2）制备米糠提取物：

将米糠铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射8min，紫外线强度为1000uw/cm²，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1%重量份的α-淀粉酶（36U/mg，Sigma公司），升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得；

步骤3）制备废弃菌体水解液：利用微生物发酵制得谷氨酸发酵液，过滤收集废弃菌体，滤液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液备用；将上述废弃菌体烘干，粉碎机粉碎成粉末状，然后置于反应罐中, 加入5mol/L的盐酸，以没过原料为准，在60℃温度下搅拌水解24小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.0，即得；

步骤4）浓缩母液：将步骤3）所得母液浓缩至谷氨酸含量为13g/L的浓缩液；

步骤5）制备发酵培养基：按照重量百分比取各原料备用，其中：玉米秸秆水解液20%，废弃菌体水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，贝壳粉0.01%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.01%，其余为步骤4）所得浓缩液；

将玉米秸秆水解液，废弃菌体水解液，葡萄糖，米糠提取物，贝壳粉，硫酸镁以及磷酸二氢钾依次添加到浓缩液中，搅拌均匀，然后在温度108-110℃、维持时间15分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；

所述贝壳粉的粒径为100目；

步骤6）发酵制备聚谷氨酸：培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液，然后按照9％（体积比）的接种量接入发酵培养基中，连续发酵42小时，得到聚谷氨酸发酵液；发酵过程中的温度控制在30℃，pH控制在6.9-7.0，控制葡萄糖浓度不低于20g/L；

步骤7）分离和纯化：往聚谷氨酸发酵液中加入相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌5min，然后静置15min，离心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的纯净水溶解沉淀，然后加入粒径为100nm硅藻土0.5kg/m³，搅拌均匀后进行板框过滤，收集滤液，调整滤液pH为中性，再加入占滤液0.5％质量分数的氯化钠，搅拌均匀，缓慢加入与滤液相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌15min，再加入占滤液两倍体积的异丙醇，500转/min搅拌3min，然后置于4℃条件5小时，产品逐渐析出，经干燥、粉碎得到聚谷氨酸。

产品纯度检测：聚谷氨酸收率可达到65％以上，成品纯度为95％以上。

实施例2

实施例2采用发酵培养基为：葡萄糖35g/L、玉米浆20g/L、酵母膏15g/L、谷氨酸钠18g/L、硫酸铵8g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.1mg/L；其他工艺同实施例1。

实施例3

本发明实施例1-2发酵液中的聚谷氨酸产量，具体结果见表1：

表1

组别	聚谷氨酸产量（g/L）
		实施例1	33.7
实施例2	31.2

结论：本发明实施例1组和实施例2产酸量相差不大，本发明实施例1组略高；通过成本核验本发明实施例1的发酵培养基成本仅占实施例2培养基成本的50%左右，并且实现了变废为宝，节约了企业投入，提高了企业净收入。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种制备、分离以及纯化聚谷氨酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备玉米秸秆水解液，步骤2）制备米糠提取物，步骤3）制备废弃菌体水解液，步骤4）浓缩母液，步骤5）制备发酵培养基，步骤6）发酵制备聚谷氨酸，步骤7）分离和纯化。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

步骤1）制备玉米秸秆水解液：将玉米秸秆投入到粉碎机中粉碎，过100目筛，然后添加两倍重量的浓度为5M的盐酸，200rpm搅拌水解6小时，最后添加氨水，调节溶液的pH为6.9-7.1，即得；

步骤2）制备米糠提取物：

将米糠铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射8min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1%重量份的α-淀粉酶，升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得；

步骤3）制备废弃菌体水解液：利用微生物发酵制得谷氨酸发酵液，过滤收集菌废弃菌体，滤液用于提取谷氨酸，提取谷氨酸后的母液备用；将上述废弃菌体烘干，粉碎机粉碎成粉末状，然后置于反应罐中, 加入5mol/L的盐酸，在60℃温度下搅拌水解24小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.0，即得；

步骤4）浓缩母液：将步骤3）所得母液浓缩至谷氨酸含量为13g/L的浓缩液；

步骤5）制备发酵培养基：按照重量百分比取各原料备用，其中：玉米秸秆水解液20%，废弃菌体水解液15%，葡萄糖4%，米糠提取物0.5%，贝壳粉0.01%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.01%，其余为步骤4）所得浓缩液；

将玉米秸秆水解液，废弃菌体水解液，葡萄糖，米糠提取物，贝壳粉，硫酸镁以及磷酸二氢钾依次添加到浓缩液中，搅拌均匀，然后在温度108-110℃、维持时间15分钟进行灭菌处理，再降温至30℃，制得发酵培养基；

步骤6）发酵制备聚谷氨酸：培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108获得种子液，然后按照9％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵42小时，得到聚谷氨酸发酵液；

步骤7）分离和纯化：往聚谷氨酸发酵液中加入相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌5min，然后静置15min，离心收集沉淀，加入占沉淀五倍重量的纯净水溶解沉淀，然后加入纳米硅藻土，搅拌均匀后进行板框过滤，收集滤液，调整滤液pH为中性，再加入占滤液0.5％质量分数的氯化钠，搅拌均匀，再缓慢加入与滤液相同体积的异丙醇，2000转/min搅拌15min，再加入占滤液两倍体积的异丙醇，500转/min搅拌3min，然后置于4℃条件5小时，产品逐渐析出，经干燥、粉碎得到聚谷氨酸。

3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述贝壳粉的粒径为100目。