CN103191470B - 具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法 - Google Patents
具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法，所述方法包括以下步骤：(1)有机/无机/药物复合材料的制备，(2)将所述步骤(1)中所获得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法，属于骨组织工程支架与药物缓释领域。
背景技术
研制合适的支架材料来治疗骨缺损疾病一直是骨组织工程学研究的一个热点课题。作为骨组织工程的关键要素之一，理想的三维支架要求有合适的孔径尺寸、高的孔隙率和高度贯通的孔隙结构，以利于氧分、营养物质与代谢产物的交换，为细胞的大量种植和增殖、细胞外基质的分泌、以及血管和神经的内生长提供空间和环境。
将骨组织工程支架材料植入缺损部位时，首要问题就是面临着炎症甚至是骨髓炎、骨坏死和败血症等并发症的风险。最理想的方法是能够在患病部位进行局部给药，这样既能够保证患病部位有足够的药物而且能持续给药，同时又尽量避免影响其他正常的组织。因此，集骨修复与药物缓释二者相结合的三维多孔支架引起了越来越多科研工作者的关注。
针对上述目的，目前人工合成支架材料的研究集中于生物陶瓷和聚合物两类。生物陶瓷类支架(如羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(β-TCP))用于局部药物缓释的缺陷在于：由于这类支架一般采取传统的浸渍的方式将药物负载于支架上，因此药物释放规律很难得到调控。而聚合物支架(如聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL))尽管能通过聚合物自身的降解来调控药物的释放，但是聚合物难以在体内与骨组织直接键合，且亲水性较差，不利于细胞粘附；降解较慢，且降解产物为酸性物质，这对细胞的成长不利；力学强度也较低。为克服以上缺点，主要采取将聚合物与生物陶瓷材料复合的方法。
在支架制备的工艺上，快速原型技术(又称自由成型制造，Rapid Prototyping,简称RP技术)与气体发泡、相分离、粒子析出和溶液浇注等这些支架制备的传统工艺方法相比，在骨组织工程支架的制备上RP技术表现出无法比拟的独特优势，它能够对支架的孔尺寸、孔隙几何形状、孔的互联性、孔的空间分布以及支架内部通道的结构进行比较精确地控制，因此将快速原型技术用来制备三维多孔骨组织工程支架得到了越来越多的研究。但是，结合快速原型技术的独特优势，将之用于载药型骨组织工程支架的制备，鲜有文献报道，并且现有文献中主要采用的技术手段是以聚乙烯醇(PVA，Polyving akohol)为粘结剂将成形原材料制成浆料(Paste/Slurry)来成形支架，但是PVA是一种水溶性高分子聚合物，在药物释放的过程中会由于水的作用造成支架三维结构的坍塌，并且暴释急剧，因此不能对骨修复部位进行较长时间地局部给药。
MAM(Motor Assisted Microsyringe，电机助推微注射器)自由成形技术是RP技术的数十种具体工艺中的一种，它是一种新型的骨组织工程支架制备工艺，其独特优势在于可选择的成形原材料广泛，可以是自行设计或选择的由聚合物、金属或陶瓷等构成的溶液(Solution,水溶液或溶剂溶液)、胶体(Colloid)、悬浮液(Suspension)、浆料(Slurry)或熔融体(Melt),因此有很强的通用性和适应性。
综上所述，本领域缺乏对具有高度有序多孔结构、高度贯通性孔道并且能对骨修复部位进行较长时间局部给药的有机/无机复合支架的研究。因此，本领域迫切需要开发借助于RP技术制备的具有药物缓释性能的有机/无机复合支架。
发明内容
本发明的第一目的在于获得一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法。
本发明的第二目的在于获得一种具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
本发明的第三目的在于获得一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的骨移植物。
本发明的第四目的在于获得一种具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备，所述制备步骤包括：
(1a)提供具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料，将所述有机聚合物材料溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液；
所述有机聚合物材料选自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、丙醇酸(PGA)或其组合；
所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜、1,4-二氧六环或其组合；
(1b)提供药物，将所述药物在上述(1a)中所得到的聚合物溶液中分散均匀，得到混合溶液；
所述的药物选自布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿仑膦酸钠(AL)；
(1c)提供具有骨诱导性的无机粉体，将具有骨诱导性的无机粉体在上述(1b)中所得到的混合溶液分散均匀，得到均匀分散液；
所述具有骨诱导性的无机粉体选自磷酸钙类生物材料、生物活性玻璃类生物材料或其组合；
(1d)采用梯度挥发溶剂的方式去除(1c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，获得的方式有机/无机/药物复合材料；
(2)将所述步骤(1)中所获得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
在一个具体实施方式中，本发明的制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备，所述制备步骤包括：
(a)室温下，提供具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，将有机聚合物溶解于相应的有机溶剂，制成浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液；
有机溶剂可以是二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜和1,4-二氧六环。所述的聚合物是，此类聚合物具有相对较高的力学强度，且在降解过程中不会因水分子的作用导致支架三维结构的明显变形和坍塌，这类材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；
(b)将药物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，继续搅拌使药物分散均匀。所述的药物可以是布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿仑膦酸钠(AL)，其中优选IBU；
(c)将过筛后的无机粉体加入上述(b)中所得到的混合溶液中，继续搅拌使无机粉体分散均匀。所述的无机粉体具有骨诱导性，可以是磷酸钙类生物材料(如β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA))和生物活性玻璃类生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；
(d)完全去除(c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，采用梯度挥发溶剂的方式，具体步骤如下：
①将(c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
③将②中所得到的复合材料从培养皿中揭下，置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到有机/无机/药物复合材料。
(2)有机/无机/药物复合支架的制备：
将(1)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备(MAM-IIFreeform Fabrication System,见附图说明1)的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成三维多孔支架。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1a)中，所述有机聚合物材料在室温下溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1b)中，所提供的药物是布洛芬(IBU)。
本发明中，可以根据所需要的药物的相关性质来选择合适的有机聚合物，以避免在支架制备过程中药物活性的丧失。
本发明中，可以任意添加药物量来满足不同时期对药物量的需求。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1c)中，
所述磷酸钙类生物材料选自β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA)或其组合；和/或
所述生物活性玻璃类生物材料选自介孔生物活性玻璃(MBG)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1d)中，包括如下步骤：
①将(1c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，直至混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液置于室温下进一步挥发溶剂，得到复合材料；
③将②中所得到的复合材料置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到所述有机/无机/药物复合材料。
在一个具体实施方式中，包括如下步骤：
①将(1c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，直至混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
③将②中所得到的复合材料从培养皿中揭下，置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到有机/无机/药物复合材料。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(2)中，将(1d)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机/无机/药物复合材料中的比例为：20：0～5：2～5，依序分别为具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料、所述具有骨诱导性的无机粉体和药物的重量比例。
本发明的第二方面提供一种本发明所述的方法制备得到的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机/无机/药物复合材料中的比例为：20：（0～5）：（2～5），依序分别为具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料、所述具有骨诱导性的无机粉体和药物的重量比例。
更优选的，所述三维多孔支架具有高度有序的孔结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；所制备的支架具有高度贯通性，能有利于氧分、营养物质与代谢产物的交换。
本发明的第三方面提供一种移植物，所述移植物含有如本发明所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架和接种于所述复合三维多孔支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3复合三维多孔支架。
本发明的第四方面提供一种本发明所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的用途，用于制备骨移植物的支架。
附图说明
图1MAM自由成形机及其工作原理图：活塞杆由直线步进电机驱动，当外部计算机发出指令后，直线步进电机驱动活塞杆，在成形头中，由于电热棒的作用，材料呈熔融状态，并在活塞杆的推挤下，通过喷嘴涂覆在工作台上。与此同时，外部计算机将工件三维模型沿高度方向切片的截面层轮廓数据传至控制系统，此系统驱动工作台与成形头沿X-Y方向做合成运动，从而使涂覆并凝固在工作台上的材料形成工件相应的截面轮廓。完成一层的涂覆后，成形头上升一个截面层的厚度，然后重复进行下一个截面轮廓的涂覆，直至完成整个工件的成形。
图2实施例1～5中所制备的支架的光学照片。所有支架的几何形状均遵循计算机对模型参数的设置，具有极小的不规则性。
图3实施例1～5中所制备的支架的表面及断面扫描电镜图。所有支架均具有高度贯通性，孔尺寸在260um左右，线条宽度在320um左右，很接近相关的参数设计值，体现了快速原型技术对支架工艺参数的精确可控性。
图4实施例1～5中所制备的支架的亲水性比较。药物相的含量和无机相的含量均能改变支架的亲水性，并且无机相的掺入更能显著改善支架的亲水性，这对支架表面细胞的贴附有利。
图5实施例1～5中所制备的支架的力学性能比较。药物含量的增加会导致支架抗压模量的下降，一定量的无机相的掺入能显著提高支架的抗压模量，但是过多无机相的掺入反而会降低支架的力学性能。
图6实施例1～5中所制备的支架在降解过程中PH值变化情况的比较。实施例5中支架在降解过程中的PH值在前4周降解中由7.4持续降低至4.6，并继续保持在较低水平，而实施例1、2、3和4(含有无机相β-磷酸三钙)第1周明显降低之后逐步上升，并保持较高的PH值。这表明支架组分间的比例对降解过程中溶液PH值变化影响很大，无机相的掺入对聚合物在降解过程中产生酸性物质导致的PH值降低有一定的补偿作用。
图7实施例1～5中所制备的支架在降解过程中质量损失百分比变化情况的比较。实例1～3对比可以得出结论：由于药物的溶解，药物含量越大，质量损失越大；实例3～5对比可以得出结论：无机相的掺入加快了支架的降解。因此，可以通过改变组分间的相对比例可以在很大程度上来调控支架的降解行为。
图8实施例1～5中所制备的支架体外药物释放曲线比较。所有支架的药物释放分为突释和缓释两个阶段，并且随着药物含量和无机相的改变，释放规律也随之变化。因此，可以通过改变药物含量以及掺入无机相等方法来调控支架中药物的释放行为。
图9实施例1～5中所制备的支架体外药物释放液的抗菌活性比较(a为对照组，b～f分别对应于实施例1～5)。实施例1～5中所制备支架的3d药物释放液呈现出不同的杀菌效果，此结果与图7的药物释放曲线的结果一致。这表明：本发明中支架的制备方法并没有造成药物的抗菌活性的丧失。
图10实施例6中所制备的支架的体外药物释放曲线。
具体实施方式
本发明涉及一种具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法。借助于MAM(Motor Assisted Microsyringe，电机助推微注射器)自由成形技术，在计算机的控制下，将挤料腔内具有一定流动性的无机/有机/药物复合材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成三维多孔支架。本发明制备工艺简单易行，成本低，效率高，无需对支架进行后处理，计算机控制，所制得的含有药物的三维多孔复合支架适宜于药物的负载和缓释，在骨组织工程领域具有广阔的应用前景。
本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。
以下对本发明的各个方面进行详述：
制备方法
在本发明的第一方面，提供了一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备，所述制备步骤包括：
(1a)提供具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料，将所述有机聚合物材料溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液；
所述有机聚合物材料选自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、丙醇酸(PGA)或其组合；
所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜、1,4-二氧六环或其组合；
(1b)提供药物，将所述药物在上述(1a)中所得到的聚合物溶液中分散均匀，得到混合溶液；
所述的药物选自布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿仑膦酸钠(AL)；
(1c)提供具有骨诱导性的无机粉体，将具有骨诱导性的无机粉体在上述(1b)中所得到的混合溶液分散均匀，得到均匀分散液；
所述具有骨诱导性的无机粉体选自磷酸钙类生物材料、生物活性玻璃类生物材料或其组合；
(1d)采用梯度挥发溶剂的方式去除(1c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，获得的方式有机/无机/药物复合材料；
(2)将所述步骤(1)中所获得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
发明人经过广泛和深入的试验，选择了特定的可以在相应有机溶剂中溶解的有机聚合物材料，且所述有机聚合物材料具有相对较高的力学强度，且在降解过程中不会因水分子的作用导致支架三维结构的明显变形和坍塌。
在一个具体实施方式中，本发明的制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备，所述制备步骤包括：
(a)室温下，提供具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，将有机聚合物溶解于相应的有机溶剂，制成浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液；
有机溶剂可以是二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜和1,4-二氧六环。所述的聚合物是，此类聚合物具有相对较高的力学强度，且在降解过程中不会因水分子的作用导致支架三维结构的明显变形和坍塌，这类材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；
(b)将药物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，继续搅拌使药物分散均匀。所述的药物可以是布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿仑膦酸钠(AL)，其中优选IBU；
(c)将过筛后的无机粉体加入上述(b)中所得到的混合溶液中，继续搅拌使无机粉体分散均匀。所述的无机粉体具有骨诱导性，可以是磷酸钙类生物材料(如β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA))和生物活性玻璃类生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；
(d)完全去除(c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，采用梯度挥发溶剂的方式，具体步骤如下：
①将(c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
③将②中所得到的复合材料从培养皿中揭下，置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到有机/无机/药物复合材料。
(2)有机/无机/药物复合支架的制备：
将(1)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备(MAM-IIFreeform Fabrication System,见附图说明1)的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成三维多孔支架。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1a)中，所述有机聚合物材料在室温下溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液。
本发明中，所述的聚合物是具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，此类聚合物具有相对较高的力学强度，且在降解过程中不会因水分子的作用导致支架三维结构的明显变形和坍塌。与水溶性高分子聚合物相比，脂溶性高分子聚合物所制备的支架具有较高的力学强度，并且在支架降解过程中能一直较好地保持支架的三维结构。
关于高分子聚合物溶液的浓度：本发明优选5%～10%(w/v)，其中w为聚合物的重量，v为溶剂的体积。若浓度过高，则溶液的粘度大，会影响原材料间混合均匀性，进而影响支架的成形；浓度过低，尽管混合均匀比较容易，但是对后面溶剂的挥发去除造成困难。
关于支架原材料组分间的复合方式：本发明采用在有机溶剂介质中混合支架各组分，与一般采取的热熔机械搅拌混合这一方式相比，优势在于：①本发明给予了较大的混合空间，并且混合溶液的粘度比熔化时的高分子聚合物溶液小很多，这就给混合的均匀性提供了条件，并且原材料间混合的均匀性对后续支架能否顺利成形具有重要影响——只有原材料复合均匀，从MAM自由成形机的喷嘴里挤出的丝料材具有较好的粘接性，这是支架完成整个三维构件的加工以及工艺可重复必须满足的要求；
关于复合温度，所述材料的复合在室温下进行，这就有效的避免了加热熔化高分子聚合物时所施加的高温导致的药物分解。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1b)中，所提供的药物是布洛芬(IBU)。
本发明中，可以根据所需要的药物的相关性质来选择合适的有机聚合物，以避免在支架制备过程中药物活性的丧失。
本发明中，可以任意添加药物量来满足不同时期对药物量的需求。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1c)中，
所述磷酸钙类生物材料选自β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA)或其组合；和/或
所述生物活性玻璃类生物材料选自介孔生物活性玻璃(MBG)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(1d)中，包括如下步骤：
①将(1c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，直至混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液置于室温下进一步挥发溶剂，得到复合材料；
③将②中所得到的复合材料置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到所述有机/无机/药物复合材料。
在一个具体实施方式中，包括如下步骤：
①将(1c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，直至混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
③将②中所得到的复合材料从培养皿中揭下，置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到有机/无机/药物复合材料。
本发明采取加溶剂→完全去除溶剂→支架成形这一方式，已有文献中是用有机溶剂将原材料配制成浆料的状态成形支架，然后对支架进行去除溶剂的后处理，可能出现的问题包括：①溶剂去除过程中导致支架三维结构的变形和翘曲以及支架内部产生气泡，破坏了支架构形的完整性，同时也降低了支架的力学强度；②有机溶剂很难完全从支架里直接去除，导致有机溶剂在支架内部的残留，可能会造成细胞毒性问题。所以，本发明对这些问题做出了改进。
本发明提出一种梯度挥发溶剂的方法来完全去除原材料复合过程中所使用的有机溶剂，混合溶液的粘度逐步由小到大，最后至完全去除得到干燥的复合材料。在溶剂挥发过程中，可能会出现的无机粉体沉降和团聚以及产生气泡，从而破坏了材料混合后的均匀性，这对后续的支架成形不利，原理如前所述。也即，本发明的一种梯度挥发溶剂的方法来完全去除材料复合过程中所使用的有机溶剂，能有效地避免在溶剂挥发过程中可能会出现的无机粉体沉降、团聚等问题，为后续支架的成形奠定基础。
关于水浴温度的选择：水浴搅拌使有机溶剂尽快大量挥发至较高粘度的状态，这是避免无机粉体沉降和团聚的关键一步，所选择的温度建议略高于所使用的有机溶剂的沸点为佳。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(2)中，将(1d)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
本发明中，可以通过计算机改变网格宽度和填充方式等参数来对支架的形状以及支架的孔隙率、孔大小、孔形状进行比较精确地控制。
本发明中，MAM自由成形机中支架成形时的工艺参数的优选选择方式：支架成形时的工艺参数如挤料腔温度、喷嘴温度、XY平台运动速度、挤压头的挤料速度等需要不断的尝试与摸索，特别是所选择的温度必须结合所使用的高分子聚合物的玻璃化转变温度、熔点以及所选择的药物的熔点及分解温度，工艺温度不能超过药物的分解温度，否则会导致药物的分解及药物失效。
具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架
本发明的第二方面提供一种本发明所述的方法制备得到的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机/无机/药物复合材料中的比例为：20：0～5：2～5。
发明人发现，药物相的含量和无机相的含量均能改变支架的亲水性，并且无机相的掺入更能显著改善支架的亲水性，这对支架表面细胞的贴附有利。药物含量的增加会导致支架抗压模量的下降，一定量的无机相的掺入能显著提高支架的抗压模量，但是过多无机相的掺入反而会降低支架的力学性能。同时发现，支架组分间的比例对降解过程中溶液PH值变化影响很大，无机相的掺入对聚合物在降解过程中产生酸性物质导致的PH值降低有一定的补偿作用。
为此，为了解决上述矛盾，发明人认为所述有机/无机/药物复合材料中的优选比例为：20：（0～5）：（2～5）。这样，本发明中支架的制备方法并没有造成药物的抗菌活性的丧失；且同时能获得较好的抗压模量、亲水性(影响支架表面细胞的贴附)与降解性能。
在此范围内，可以通过改变组分间的相对比例可以在很大程度上来调控支架的降解行为。还可以通过改变药物含量以及掺入无机相等方法来调控支架中药物的释放行为。
综上所述，本发明中，可以通过改变支架组分间的比例，来实现对支架力学性能、降解性、药物释放行为以及抗菌性能的可控。
此外，在保证支架对孔尺寸、孔隙率和孔道贯通性要求的同时，通过改变支架组分间的相对比例，可以对支架的力学性能、降解性、药物释放以及抗菌性进行调控。
具体的，所得到三维多孔支架具有高度有序的孔结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；所制备的支架具有高度贯通性，能有利于氧分、营养物质与代谢产物的交换。
移植物与干细胞
本发明的第三方面提供一种移植物，所述移植物含有如本发明所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架和接种于所述复合三维多孔支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3复合三维多孔支架。
本发明的第四方面提供一种本发明所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的用途，用于制备骨移植物的支架。
本发明的干细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的干细胞，通常，本发明的干细胞是自体的、或同种异体的干细胞。获取干细胞的部位也没有特别限制，可以是脂肪干细胞、骨髓基质干细胞或其他干细胞。此外，成骨细胞也可替代干细胞用作骨组织工程化构建的种子细胞。
优选的，所述干细胞选自骨髓基质干细胞。
可用于本发明的干细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动物，更佳地是灵长类动物，尤其是人。
尽管自体的干细胞是优选的，但异体的干细胞的来源更为常用。研究已表明，不同生长、发育阶段的同种异体干细胞，可以在有组织相容性差异并且具有完全免疫功能的同种异体动物体内形成干细胞组织。
分离和获得干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是密度梯度离心法和酶消化法。
干细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将干细胞在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+5～20%胎牛血清；2)DMEM培养基+5～20%小牛血清；3)DMEM培养基+5～20%自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进干细胞生长的细胞因子等)、各种抗生素、各种诱导因子。
适用于本发明的干细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的干细胞是体外培养的骨髓基质干细胞。
由于本发明的支架与骨髓基质干细胞和脂肪干细胞特别是骨髓基质干细胞的相容性非常好，因此特别适合作为骨修复的支架材料。
将体外培养扩增的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞接种到生物相容性优异的支架形成干细胞—生物活性玻璃复合物，将这一“干细胞—复合三维支架”复合物植入到缺损部位，随着无机材料的逐渐降解吸收，新骨形成，达到修复骨缺损的目的。
本发明的组织工程骨移植物的制备方法简便，将一定数量的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞接种于生物活性玻璃即可。
本发明的组织工程化骨移植物的形状没有特别限制，可以按照组织缺损的形状任意塑形。通常，移植物为长条形。
本发明组织工程化骨中的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞浓度通常约为0.5×106/cm3(支架体积)至5×108/cm3或更高，较佳地为1×106/cm3至1×108/cm3，更佳地为5×106/cm3至5×107/cm3无稽材料。通常，以培养液调整骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。
此外，在本发明的组织工程化骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种抗生素，从而保持骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞表型、促进骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞生长，以及促进组织工程化骨在体内生长。
除了将组织工程化骨移植物植入体内之外，还将其置于体外生物反应器内培养，从而进行组织工程化骨的构建，在体外形成具有一定组织学结构、生化组成与生物力学强度的组织工程化骨。
用本发明方法形成的组织工程化骨移植物，可直接植入体内的骨缺损处。
本发明的优选实施方式
本发明的目的是提出一种基于MAM自由成形技术的新型的具有药物缓释作用的、以脂溶性聚合物为有机相的有机/无机复合三维多孔支架及其制备方法。提出一种梯度挥发溶剂的方法来完全去除材料复合过程中所使用的有机溶剂，能有效地避免在溶剂挥发过程中可能会出现的无机粉体沉降、团聚等问题，为后续支架的成形奠定基础。此外，在保证支架对孔尺寸、孔隙率和孔道贯通性要求的同时，通过改变支架组分间的相对比例，可以对支架的力学性能、降解性、药物释放以及抗菌性进行调控。
制备本发明的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备：
(a)室温下，将有机聚合物溶解于相应的有机溶剂，制成浓度为5%～10%(w/v)的聚合物溶液。所述的有机溶剂可以是二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜和1,4-二氧六环。所述的聚合物是具有生物可降解性的脂溶性聚合物材料，，此类聚合物具有相对较高的力学强度，且在降解过程中不会因水分子的作用导致支架三维结构的明显变形和坍塌，这类材料可以是聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)和聚丙醇酸(PGA)；
(b)将药物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，继续搅拌使药物分散均匀。所述的药物可以是布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)和阿仑膦酸钠(AL)，其中优选IBU；
(c)将过筛后的无机粉体加入上述(b)中所得到的混合溶液中，继续搅拌使无机粉体分散均匀。所述的无机粉体具有骨诱导性，可以是磷酸钙类生物材料(如β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA))和生物活性玻璃类生物材料(如介孔生物活性玻璃(MBG))；
(d)完全去除(c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，采用梯度挥发溶剂的方法，具体步骤如下：
①将(c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
③将②中所得到的复合材料从培养皿中揭下，置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到有机/无机/药物复合材料。
(2)有机/无机/药物复合支架的制备：
将(1)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备(MAM-IIFreeform Fabrication System)的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成三维多孔支架。
本发明的有益效果：本发明的骨组织工程支架具有持久、高效的杀菌、抗感染能力，为骨缺损的修复提供了一种新型的支架材料。本发明中骨组织工程支架的制备方法简单，可选材料灵活，制备的多孔支架不仅具有适合于成骨细胞生长的空间结构，而且能在患病的局部区域进行持续给药达到药物缓释的效果。
下面对本发明方法做进一步的说明：
⑴本发明是针对脂溶性高分子聚合物为有机相的有机/无机复合支架的制备方法：与水溶性高分子聚合物相比，脂溶性高分子聚合物所制备的支架具有较高的力学强度，并且在支架降解过程中能一直较好地保持支架的三维结构。
⑵支架原材料组分间的复合方式：本发明采用在有机溶剂介质中混合支架各组分，与一般采取的热熔机械搅拌混合这一方式相比，优势在于：①本发明给予了较大的混合空间，并且混合溶液的粘度比熔化时的高分子聚合物溶液小很多，这就给混合的均匀性提供了条件，并且原材料间混合的均匀性对后续支架能否顺利成形具有重要影响——只有原材料复合均匀，从MAM自由成形机的喷嘴里挤出的丝料材具有较好的粘接性，这是支架完成整个三维构件的加工以及工艺可重复必须满足的要求；②原材料的复合在室温下进行，这就有效的避免了加热熔化高分子聚合物时所施加的高温导致的药物分解。
⑶高分子聚合物溶液的浓度：本发明推荐5%～10%(w/v)，浓度过高，则溶液的粘度大，会影响原材料间混合均匀性，进而影响支架的成形；浓度过低，尽管混合均匀比较容易，但是对后面溶剂的挥发去除造成困难。
⑷水浴温度的选择：水浴搅拌使有机溶剂尽快大量挥发至较高粘度的状态，这是避免无机粉体沉降和团聚的关键一步，所选择的温度建议略高于所使用的有机溶剂的沸点为佳。
⑸本发明采取加溶剂→完全去除溶剂→支架成形这一方式，已有文献中是用有机溶剂将原材料配制成浆料的状态成形支架，然后对支架进行去除溶剂的后处理，可能出现的问题包括：①溶剂去除过程中导致支架三维结构的变形和翘曲以及支架内部产生气泡，破坏了支架构形的完整性，同时也降低了支架的力学强度；②有机溶剂很难完全从支架里直接去除，导致有机溶剂在支架内部的残留，可能会造成细胞毒性问题。所以，本发明对这些问题做出了改进。
⑹梯度挥发溶剂的方法：本发明提出一种梯度挥发溶剂的方法来完全去除原材料复合过程中所使用的有机溶剂，混合溶液的粘度逐步由小到大，最后至完全去除得到干燥的复合材料。在溶剂挥发过程中，可能会出现的无机粉体沉降和团聚以及产生气泡，从而破坏了材料混合后的均匀性，这对后续的支架成形不利，原理同⑵中所述。通过本发明实验过程中的摸索与尝试，发现梯度挥发溶剂的方法能有效地避免这个问题。
⑺MAM自由成形机中支架成形时的工艺参数的选择：支架成形时的工艺参数如挤料腔温度、喷嘴温度、XY平台运动速度、挤压头的挤料速度等需要不断的尝试与摸索，特别是所选择的温度必须结合所使用的高分子聚合物的玻璃化转变温度、熔点以及所选择的药物的熔点及分解温度，工艺温度不能超过药物的分解温度，否则会导致药物的分解及药物失效。
如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比，所述的聚合物分子量为数均分子量。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例
下面以具体实施例对本发明做进一步说明。
实施所用的主要原料为聚乳酸(分子量8万)、四水合硝酸钙、磷酸氢二铵、正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)、盐酸、氯仿、布洛芬；所用设备主要为快速原型设备(MAM-II FreeformFabrication System)。
实施例1：
(1)β-磷酸三钙(β-TCP)粉体的合成：
(a)称取115.42g Ca(NO3)2·4H2O于2L烧杯中，加去离子水967.74ml，并氨水调节pH在8.2±0.1[Ca]；
(b)称取43.03g(NH4)2HPO4于3L烧杯中，加去离子水645.16mL,并氨水调节pH在8.2±0.1[P]；
(c)将Ca溶液置于250mL分液漏斗中，缓慢滴加于P溶液中(可直接用滴管滴加)，并用氨水将溶液pH维持在8.2±0.1；
(d)将混合溶液搅拌24h，得到的沉淀去离子水抽滤3次，醇洗1次；
(e)100℃干燥，除水；
(f)850℃烧结，保温2h，升温速率4℃/min。
得到的粉体过200目筛备用。
(2)聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合材料(20:5:2，w/w/w)的制备：
(a)室温下，将20g聚乳酸溶解于200ml氯仿中，得到聚乳酸溶液；
(b)将2g布洛芬药物加入上述(a)中所得到的聚合物溶液，继续搅拌使药物分散均匀；
(c)将(1)中β-TCP粉体加入上述(b)中所得到的混合溶液中，继续搅拌使无机粉体分散均匀；
(d)将(c)中所得到的混合溶液在70℃水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，混合溶液粘度增大；
(e)将(d)中所得到的混合溶液倒入培养皿中，置于室温下进一步挥发溶剂；
(f)将(e)中所得到的复合材料从培养皿中取出，置于60℃鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
(g)将(f)中的复合材料置于60℃真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂。
(2)聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架(20:5:2，w/w/w)的制备：
将(2)中所制得的聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合材料置于快速原型设备(MAM-II Freeform Fabrication System)的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成三维多孔支架。
实施例2：制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架(20:5:3.5，w/w/w)
按照实施例1的步骤制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架，不同之处在于：20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，随后加入3.5g布洛芬，最后加入5gβ-磷酸三钙粉体。
实施例3：制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架(20:5:5，w/w/w)
按照实施例1的步骤制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架，不同之处在于：20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，随后加入5g布洛芬，最后加入5gβ-磷酸三钙粉体。
实施例4：制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架(18:2:4，w/w/w)
按照实施例1的步骤制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架，不同之处在于：18g聚乳酸溶解于180ml的氯仿中，随后加入4g布洛芬，最后加入2gβ-磷酸三钙粉体。
实施例5：制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架(20:0:5，w/w/w)
按照实施例1的步骤制备聚乳酸/β-磷酸三钙/布洛芬复合支架，不同之处在于：20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，随后加入5g布洛芬，不加入β-磷酸三钙粉体。
实施例6：制备聚乳酸/介孔生物活性玻璃/布洛芬复合支架(20:5:3，w/w/w)
(1)介孔生物活性玻璃(m58S,Si/Ca/P=58:23:9,w/w/w)的合成：
(a)4.25g TEOS、0.49g TEP、2.97g四水合硝酸钙、1.5g P123和60ml2M HCl分别溶于15ml去离子水中，35℃水浴搅拌12h；
(b)(a)中的混合液在100℃下水热处理24h之后，在100℃下干燥；
(c)(b)中得到的粉体在650℃下烧结6h。
煅烧后的粉体过400目筛备用。
(2)按照实施例1的步骤制备聚乳酸/介孔生物活性玻璃/布洛芬复合支架，不同之处在于：20g聚乳酸溶解于200ml的氯仿中，随后加入3g布洛芬，最后加入5g本实施例中(1)得到的介孔生物活性玻璃粉体。
表1示出实施例1～5所制备的支架的孔隙率(I～V分别对应于实施例1～5中支架)。各组支架的孔隙率误差较小，这表明快速原型技术的精确可控性；另外，孔隙率受组分间比例的变化较小，这表明支架孔隙率主要取决于计算机对模型的网格宽度、层高等工艺参数的设置。
支架孔隙率的测试方法：
采用阿基米德定律用液体置换法来测定支架的孔隙率，无水乙醇作为置换液。具体步骤如下：支架的表观体积V1通过测量支架的直径和高度计算得到，然后将支架完全浸没到装有V2体积的无水乙醇的量筒中，循环抽真空至无气泡逸出，使支架孔中注满无水乙醇，读取此时体积V3。孔隙率按照公式ε=(V1+V2-V3)/V1进行计算。
药物释放液体外抗菌活性实验：
用生理盐水稀释菌液至细菌浓度为107cfu/ml，取各组支架3d的药物释放液(PBS溶液作为对照组)3.5ml加入离心管中，再加入0.5ml菌液，振荡均匀后，放入37℃培养箱培养；培养24h后，振荡均匀，每个取100ul滴加到琼脂板上进行涂板，涂板后放入37℃培养箱中培养，16h后取出观察细菌菌落情况。
形态性能
图2示出了实施例1～5中所制备的支架的光学照片。所有支架的几何形状均遵循计算机对模型参数的设置，具有极小的不规则性。
图3示出实施例1～5中所制备的支架的表面及断面扫描电镜图。所有支架均具有高度贯通性，孔尺寸在260um左右，线条宽度在320um左右，很接近相关的参数设计值，体现了快速原型技术对支架工艺参数的精确可控性。
图4实施例1～5中所制备的支架的亲水性比较。药物相的含量和无机相的含量均能改变支架的亲水性，并且无机相的掺入更能显著改善支架的亲水性，这对支架表面细胞的贴附有利。
图5示出实施例1～5中所制备的支架的力学性能比较。药物含量的增加会导致支架抗压模量的下降，一定量的无机相的掺入能显著提高支架的抗压模量，但是过多无机相的掺入反而会降低支架的力学性能。
图6示出实施例1～5中所制备的支架在降解过程中PH值变化情况的比较。实施例5中支架在降解过程中的PH值在前4周降解中由7.4持续降低至4.6，并继续保持在较低水平，而实施例1、2、3和4(含有无机相β-磷酸三钙)第1周明显降低之后逐步上升，并保持较高的PH值。这表明支架组分间的比例对降解过程中溶液PH值变化影响很大，无机相的掺入对聚合物在降解过程中产生酸性物质导致的PH值降低有一定的补偿作用。
图7示出实施例1～5中所制备的支架在降解过程中质量损失百分比变化情况的比较。实例1～3对比可以得出结论：由于药物的溶解，药物含量越大，质量损失越大；实例3～5对比可以得出结论：无机相的掺入加快了支架的降解。因此，可以通过改变组分间的相对比例可以在很大程度上来调控支架的降解行为。
图8示出实施例1～5中所制备的支架体外药物释放曲线比较。所有支架的药物释放分为突释和缓释两个阶段，并且随着药物含量和无机相的改变，释放规律也随之变化。因此，可以通过改变药物含量以及掺入无机相等方法来调控支架中药物的释放行为。
图9示出实施例1～5中所制备的支架体外药物释放液的抗菌活性比较(a为对照组，b～f分别对应于实施例1～5)。实施例1～5中所制备支架的3d药物释放液呈现出不同的杀菌效果，此结果与图7的药物释放曲线的结果一致。这表明：本发明中支架的制备方法并没有造成药物的抗菌活性的丧失。
图10示出实施例6中所制备的支架的体外药物释放曲线。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种制备具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)有机/无机/药物复合材料的制备，所述制备步骤包括：
(1a)提供具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料，将所述有机聚合物材料溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5％～10％(w/v)的聚合物溶液；
所述有机聚合物材料选自聚乳酸(PLLA)、乙醇酸和丙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)或其组合；
所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜、1,4-二氧六环或其组合；
(1b)提供药物，将所述药物在上述(1a)中所得到的聚合物溶液中分散均匀，得到混合溶液；
所述的药物选自布洛芬(IBU)、庆大霉素、氟尿嘧啶(5-FU)、氟美松(DEX)、或阿仑膦酸钠(AL)；
(1c)提供具有骨诱导性的无机粉体，将具有骨诱导性的无机粉体在上述(1b)中所得到的混合溶液分散均匀，得到均匀分散液；
所述具有骨诱导性的无机粉体选自磷酸钙类生物材料、生物活性玻璃类生物材料或其组合；
(1d)采用梯度挥发溶剂的方式去除(1c)中所得到的混合溶液中的有机溶剂，获得的方式有机/无机/药物复合材料；
所述步骤(1d)中，包括如下步骤：
①将(1c)中所得到的混合溶液在设定温度的水浴中继续搅拌，使溶剂大量挥发，直至混合溶液粘度增大；
②将①中所得到的混合溶液置于室温下进一步挥发溶剂，得到复合材料；
③将②中所得到的复合材料置于鼓风干燥箱中继续挥发溶剂；
④将③中的复合材料置于真空干燥箱中，以完全去除有机溶剂，得到所述有机/无机/药物复合材料；
(2)将所述步骤(1)中所获得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1a)中，所述有机聚合物材料在室温下溶解于相应的有机溶剂，得到浓度为5％～10％(w/v)的聚合物溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1b)中，所提供的药物是布洛芬(IBU)。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1c)中，
所述磷酸钙类生物材料选自β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA)或其组合；和/或
所述生物活性玻璃类生物材料选自介孔生物活性玻璃(MBG)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将(1d)中所制得的有机/无机/药物复合材料置于MAM自由成形设备的挤料腔中，设置好相关参数，在计算机的控制下，将挤料腔中的材料经喷嘴挤出逐层叠加在工作台上，形成具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机/无机/药物复合材料中的重量比例为：20：0～5：2～5，依序分别为具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料、所述具有骨诱导性的无机粉体和药物的重量比例。
7.一种如权利要求1所述的方法制备得到的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架。
8.如权利要求7所述的三维多孔支架，其特征在于，所述有机/无机/药物复合材料中的比例为：20：(0～5)：(2～5)，依序分别为具有生物可降解性的脂溶性有机聚合物材料、所述具有骨诱导性的无机粉体和药物的重量比例。
9.一种移植物，其特征在于，所述移植物含有如权利要求7所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架和接种于所述复合三维多孔支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3复合三维多孔支架。
10.一种如权利要求7所述的具有药物缓释作用的有机/无机复合三维多孔支架的用途，其特征在于，用于制备骨移植物的支架。
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