CN106823006A - 用于髌骨修复的组织工程骨支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其包括：内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；以及外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架经第二脂肪干细胞悬液浸泡处理。本发明所述组织工程骨支架按照可降解材料的降解速度分层设置，提高髌骨置换手术的成功率。本发明还提供了该组织工程骨支架的制备方法。

Description

用于髌骨修复的组织工程骨支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程骨领域。更具体地说，本发明涉及一种用于髌骨修复的组织工程骨支架及其制备方法。
背景技术
目前，人工全膝关节置换术(total knee arthroplasty，简称TKA)是治疗各种膝关节炎症的一种有效且成熟的治疗方式。随着髌骨的机械力学机制的深入研究，髌骨在膝关节活动中所起的作用被越来越多的人所重视。为了降低TKA术后髌前区疼痛的发生率，往往也进行髌骨表面置换。在髌骨表面置换手术过程中，关键步骤是通过对髌骨截骨，并将髌骨假体植入以恢复髌骨正常厚度。合理的髌骨截骨是减少髌骨骨折、髌骨外倾等术后并发症的重要保证。同时，为了保护髌骨血运，应尽量保留髌下脂肪垫。但是在手术中往往会出现髌骨假体磨损、松动以及断裂等，这些并发症可以直接导致髌骨表面置换的失败。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其能够将所述组织工程骨支架按照可降解材料的降解速度分层设置，并匹配脂肪干细胞的成骨分化速度；促进髌骨生长，提高髌骨置换手术的成功率。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其包括：
内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；
中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第一脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为5-7╳105个/mL；
外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架将第二脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第二脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为8-10╳105个/mL。
优选的是，所述内层支架通过将所述羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL。
优选的是，所述第一脂肪干细胞悬液和第二脂肪干细胞悬液中所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。
优选的是，所述脂肪干细胞为自体脂肪干细胞，其通过以下方法获得：将脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合后，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；然后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；随后离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞。
优选的是，所述第一脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞5-7╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
优选的是，所述第二脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞8-10╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
优选的是，所述外层支架外层具有羟基磷灰石涂层。
优选的是，所述内层支架厚度为：2-2.5mm；中层支架的厚度为：10-15mm；外层支架的厚度为：6-8mm。
本发明还提供了所述用于髌骨修复的组织工程骨支架的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一，提取自体脂肪干细胞，具体为：将吸脂手术获得的脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞；
步骤二，制备所述内层支架，取羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL；
步骤三，制备中层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，控制所述中层支架的孔隙率为45％；然后将所述中层支架与第一脂肪干细胞悬液中浸泡48-72h；取出备用；
步骤四，制备外层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，然后将镁合金多孔支架浸泡于第二脂肪干细胞悬液中，保持48-72h；之后利用等离子体喷涂技术将羟基磷灰石涂层喷涂至所述外层支架上，备用；
步骤五，将所述内层支架、中层支架以及外层支架进行连接。
优选的是，所述内层支架、中层支架以及外层支架通过铆钉方式连接，所述铆钉采用镁合金材料制成。
本发明至少包括以下有益效果：本发明所述用于髌骨修复的组织工程骨支架，将自体脂肪干细胞充分填充至所述支架中，所述组织工程骨支架按照降解速度以及生物溶合性分层设置，内层支架选用羟丙基壳聚糖作为基材，其在植入关节后，在体温作用下逐渐释放传代10次以上的脂肪干细胞，促进所述脂肪干细胞进行成骨分化，加快内层支架的软骨快速形成，减少组织工程骨的磨损。所述中层支架采用可降解的镁合金材料，利用粉末冶金技术控制其孔隙率在45％左右，同时利用第一脂肪干细胞悬液浸泡后，脂肪干细胞填充至所述中层支架的孔隙中，随着中层支架的逐步降解，释放第一脂肪干细胞悬液，所述第一脂肪干细胞悬液中的脂肪干细胞在其内培养液中，进行成骨分化，逐步形成髌骨组织。所述外层支架选用经过羟基磷灰石涂层的镁合金多孔支架，适当减缓外层支架的降解速度，为中层支架和内层支架的髌骨组织形成提供充足的时间。同时所述外层支架的孔隙率设置为20％，使得外层支架具有足够的强度，放置组织工程骨支架断裂，提高手术成功率。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其包括：
内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；所述内层支架厚度为：2-2.5mm；所述内层支架通过将所述羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL。利用静电纺丝技术，在制备支架过程中，对脂肪干细胞施加适当的拉伸，促进其成骨分化，增加所述内层支架的孔隙率，便于脂肪干细胞快速成骨分化后并促进软骨生长。同时内层支架选用羟丙基壳聚糖作为基材制备三维多孔支架，提高其生物溶合性，降低患者不适感。
中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第一脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为5-7╳105个/mL；所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。中层支架的厚度为：10-15mm。所述第一脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞5-7╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。中层支架选用镁合金可降解材料制备，适当缩小其孔隙率，保证中层支架在内层支架脂肪干细胞生长转化过程中维持一定机械强度，防止手术恢复过程中，髌骨断裂。所述第一脂肪干细胞悬液例如选用将一定量的脂肪干细胞悬浮于成骨诱导培养基中，随着中层支架的降解，脂肪干细胞逐渐转化成软骨组织，提高手术成功率。
以及外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架将第二脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第二脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为8-10╳105个/mL。所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。所述第二脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞8-10╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。所述外层支架外层具有羟基磷灰石涂层。外层支架的厚度为：6-8mm。所述外层支架选用设置有羟基磷灰石涂层的镁合金支架，目的是减缓外层支架的降解速度，为中层支架和内层支架脂肪干细胞的分化，生长提供足够的时间。
其中，所述脂肪干细胞为自体脂肪干细胞，其通过以下方法获得：将脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合后，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；然后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；随后离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞。所述脂肪干细胞选用自体脂肪分离、培养、传代而成，减少患者的排异反应，提高手术成功率。
实施例1
本发明提供一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其包括：
内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；所述内层支架厚度为：2.5mm；所述内层支架通过将所述羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8个/mL。其中所述静电纺丝装置例如选用高压静电发生器、喷头和接收装置，静电纺丝时选用的电压例如为45kV；喷头孔径例如为0.6mm，接收装置与喷头距离例如为20cm。经过多层纤维叠加形成三维多孔支架，其孔隙率例如为50％。
中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第一脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为5-7╳105个/mL；所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。中层支架的厚度为：15mm。所述第一脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞7╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
以及外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架将第二脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第二脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为8-10╳105个/mL。所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。所述第二脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞8-10╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。所述外层支架外层具有羟基磷灰石涂层。外层支架的厚度为：8mm。所述中层支架和外层支架均采用粉末合金进行特殊定制，控制其孔隙率。本发明所述中层支架和外层支架均是工厂定制。
实施例2
本发明提供一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其包括：
内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；所述内层支架厚度为：2.5mm；所述内层支架通过将所述羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8个/mL。其中所述静电纺丝装置例如选用高压静电发生器、喷头和接收装置，静电纺丝时选用的电压例如为45kV；喷头孔径例如为0.6mm，接收装置与喷头距离例如为20cm。经过多层纤维叠加形成三维多孔支架，其孔隙率例如为50％。
中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第一脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为5-7╳105个/mL；所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。中层支架的厚度为：15mm。所述第一脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞7╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
以及外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架将第二脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第二脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为8-10╳105个/mL。所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。所述第二脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞8-10╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。所述外层支架外层具有羟基磷灰石涂层。外层支架的厚度为：8mm。所述中层支架和外层支架均采用粉末合金进行特殊定制，控制其孔隙率。本发明所述中层支架和外层支架均是工厂定制。
对比例
关节置换手术中，选用常规的髌骨假体进行植入。
本发明一共选用60名患者进行关节置换手术，其中20名在关节置换手术中选用本发明实施例1所述用于髌骨修复的组织工程骨支架，其中20名在关节置换手术中选用本发明实施例2所述用于髌骨修复的组织工程骨支架，另外20名在关节置换手术中选用常规的髌骨假体进行植入。
手术三个月后检查关节部位的髌骨完整度，发现选用实施例1和实施例2所述组织工程骨支架的患者，髌骨发育完整度良好，没有出现中间断裂，松动，甚至关节炎症的情况。手术六个月后手术部分没有发现支架材料，说明支架材料已经全部降解。而对比例中，3名患者出现髌骨断裂导致手术失败。5名患者出现了关节炎症。
本发明还提供了所述用于髌骨修复的组织工程骨支架的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一，提取自体脂肪干细胞，具体为：将吸脂手术获得的脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞；
步骤二，制备所述内层支架，取羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL；
步骤三，制备中层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，控制所述中层支架的孔隙率为45％；然后将所述中层支架与第一脂肪干细胞悬液中浸泡48-72h；取出备用；
步骤四，制备外层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，然后将镁合金多孔支架浸泡于第二脂肪干细胞悬液中，保持48-72h；之后利用等离子体喷涂技术将羟基磷灰石涂层喷涂至所述外层支架上，备用；
步骤五，将所述内层支架、中层支架以及外层支架进行连接。所述内层支架、中层支架以及外层支架例如通过铆钉方式连接，所述铆钉采用镁合金材料制成。三者也可以通过可降解的生物粘合剂进行粘合。所述生物粘合剂例如为：聚乙烯醇交联生物粘合剂或者异氰酸酯基封端可降解粘合剂等。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (10)

1.一种用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，包括：
内层支架，其为由羟丙基壳聚糖制成三维多孔支架，所述三维多孔支架上负载脂肪干细胞后并置于生物反应器中进行传代培养10次以上；
中层支架，其为由可降解镁合金材料制成的多孔支架，所述中层支架的孔隙度为45％；所述中层支架经过第一脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第一脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为5-7╳105个/mL；
外层支架，其为由可降解镁合金材料制成，所述外层支架的孔隙度为20％；所述外层支架经第二脂肪干细胞悬液浸泡处理；所述第二脂肪干细胞悬液中脂肪干细胞的含量为8-10╳105个/mL。
2.如权利要求1所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述内层支架通过将所述羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL。
3.如权利要求1所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述第一脂肪干细胞悬液和第二脂肪干细胞悬液中所用脂肪干细胞均为传代10次以上的脂肪干细胞。
4.如权利要求3所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述脂肪干细胞为自体脂肪干细胞，其通过以下方法获得：将脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合后，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；然后加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；随后离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞。
5.如权利要求4所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述第一脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞5-7╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
6.如权利要求5所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述第二脂肪干细胞悬液由以下组分制成：脂肪干细胞8-10╳105个/mL、10mmol/Lβ-2磷酸甘油、1μmol/L地塞米松、50mg/L抗坏血酸磷酸钠、100U/ml青霉素以及100U/ml链霉素。
7.如权利要求1所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述外层支架外层具有羟基磷灰石涂层。
8.如权利要求1所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架，其特征在于，所述内层支架厚度为：2-2.5mm；中层支架的厚度为：10-15mm；外层支架的厚度为：6-8mm。
9.如权利要求8所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，提取自体脂肪干细胞，具体为：将吸脂手术获得的脂肪组织依次进行消化处理和离心分离，得到脂肪干细胞；将所述脂肪干细胞与含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液混合得到细胞悬液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，每4-5天后更换一次培养液，待细胞生长达到80％融合，加0.25％胰酶-EDTA进行消化；加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液终止消化；离心后取细胞沉淀，加入含15％胎牛血清的高糖DMEM的培养液，所述细胞悬液置于37℃、CO2含量为5％的培养箱中培养，按1:2-3传代，获得传代培养10次以上的脂肪干细胞；
步骤二，制备所述内层支架，取羟丙基壳聚糖溶解于去离子水中，搅拌后静置使其充分溶解；然后加入脂肪干细胞搅拌均匀，通过静电纺丝技术制备三维多孔支架；所述脂肪干细胞的含量为107-8×108个/mL；
步骤三，制备中层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，控制所述中层支架的孔隙率为45％；然后将所述中层支架与第一脂肪干细胞悬液中浸泡48-72h；取出备用；
步骤四，制备外层支架，利用粉末冶金技术制备镁合金多孔支架，然后将镁合金多孔支架浸泡于第二脂肪干细胞悬液中，保持48-72h；之后利用等离子体喷涂技术将羟基磷灰石涂层喷涂至所述外层支架上，备用；
步骤五，将所述内层支架、中层支架以及外层支架进行连接。
10.如权利要求9所述的用于髌骨修复的组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，所述内层支架、中层支架以及外层支架通过铆钉方式连接，所述铆钉采用镁合金材料制成。
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