CN103189504A - 减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌 - Google Patents

Abstract

提供用于治疗或预防炎性病症的方法和组合物。本发明组合物包含经遗传修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。本发明方法包括给予受试者经修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。给予所述重组细菌促进所需的治疗反应。所述重组细菌可以以单独剂量或系列剂量给予。本发明方法在治疗或预防多种炎性病症包括，例如，治疗或预防炎性肠病、结肠炎或克罗恩病中得到应用。

Description

减少炎性反应的具有减少的脂磷壁酸的重组乳杆菌

发明领域

本发明涉及用于减少炎症的方法和组合物。

对作为文本文件通过 EFS-WEB 提交的序列表的引用

序列表的正式副本作为文本文件通过EFS-Web与说明书一起提交，其遵从美国信息交换标准码(ASCII)，文件名称为406734seqlist.txt，创建日期为2011年6月16日，大小为15.7 KB。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分，因此通过引用以其整体结合到本文中。

发明背景

肠道免疫稳态的维持涉及细菌微生物区系、肠上皮与宿主先天免疫细胞之间的平衡相互作用。这些免疫相互作用的失调可导致免疫功能障碍并引起明显的炎症，这是人炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病通常所具有的。尽管还未完全理解IBD的细胞和分子机制，但数据表明炎性细胞因子(例如IL-12)诱导的慢性肠炎症起关键作用。这些细胞因子启动对强烈牵涉疾病进展的致病性CD4+ T细胞的分化。相应地，研究显示对这些细胞的调节减轻实验性结肠炎。此外，如IL-12、活化树突状细胞(DC)利用IL-12p40亚基分泌的IL-23也牵涉多种自身免疫疾病(包括IBD)的发展。IL-23的炎性性质已被归因于对Th17的诱导。此外，该细胞因子还激活DC中炎性细胞因子例如TNFα和IL-6的产生。合起来，研究显示阻断IL-12p40亚基信号转导显著减少炎症，并表明IL-12和IL-23二者参与导致IBD的炎性级联。与此二者细胞因子相反，IL-10对炎性信号发挥调节作用，从而调节炎性细胞因子引发的免疫反应。

益生菌(probiotic)微生物可与宿主免疫细胞相互作用，并且特定益生菌乳杆菌种类可刺激DC产生炎性细胞因子(即IL-12)和调节性IL-10。乳杆菌是人胃肠道中的正常栖居者(inhabitant)，且为小肠中天然小型生物群的主要组分。认为这些细菌是有益的共生物，并且一些种类和菌株由于人类消费的历史悠久而被普遍认为是安全的。

本领域需要进一步的方法和组合物以改进炎性胃肠病症例如IBD的治疗。

发明简述

提供用于减少受试者炎症的方法和组合物。所述组合物包含经遗传修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸(lipoteichoic acid)展示的重组细菌。方法包括给予受试者经修饰以减少细胞表面上脂磷壁酸展示的重组细菌。给予所述重组细菌促进所需的治疗反应。所述重组细菌可以以单剂量或系列剂量给予。方法在治疗或预防多种炎性病症包括，例如，治疗或预防炎性肠病、结肠炎或克罗恩病中得到应用。

附图简述

图1(A和B)显示LTA生物合成相关通路和基因。C-D显示使用剪接重叠延伸(SOEing) PCR扩增和连接的靶ORF内部区域侧翼的两个非邻接片段(Horton, RM (1995) Mol Biotechnol. Apr;3(2):93-9)。将所得片段克隆到pORI28并转化到包含温度敏感型辅助质粒pTRK669的嗜酸乳杆菌(L. acidophilus) NCK1392中。利用PCR，使用靶区域侧翼的引物，针对缺失突变对ERM敏感型细胞进行筛选，并通过对包含缺失的区域进行测序来确认。

图2 (A)显示用NCK56(也称为嗜酸乳杆菌NCFM)或NCK2025处理的DC的表型。将骨髓来源的DC与NCK56或NCK2025共培养24小时。细胞用相应的抗体染色，固定，随后用FACSCalibur分析。B部分显示单独培养或与NCK56或NCK2025 1:1培养1和6小时的DC。提取RNA、反转录并使用针对TLR1和TLR2的引物进行实时PCR。所显示数据表示单独的DC或这些细胞与NCK56或NCK2025的共培养物(1小时)。C部分显示细胞因子分析。通过ELISA测定NCK56或NCK2025处理以及未处理DC的上清液中释放的细胞因子。D部分显示T细胞增殖。连续四天用NCK56或NCK2025口服治疗多组C57BL/6小鼠(5/组)。取得肠系膜LN-T细胞，并与NCK56或NCK2025处理的以及未处理的DC共培养4天以使用[³H]胸苷掺入测定T细胞增殖。在一些实验中，为恢复抑制的T细胞增殖，将抗IL-10抗体加入来源于与NCK2025共培养的DC的上清液中。来源于各组小鼠的肠系膜LN-T细胞与用嗜酸乳杆菌菌株处理或未处理的DC共培养以测定细胞因子。

图3显示NCK2025对DSS诱导的结肠炎的改善。A部分显示连续4天经口接种NCK56或NCK2025 (5x10⁸cfu/100 µl/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(n=10)。将这些组的小鼠暴露于3% DSS(溶解在饮用水中)中5天，接着7天白水，并评估结肠炎随时间的进展，包括H&E染色、体重减轻、腹泻和潜血检测阳性(hemoccult positivity)。B-E部分显示结肠H&N染色。B显示未处理的小鼠；C部分DSS处理的小鼠；D显示NCK56-DSS处理的小鼠；以及E显示NCK2025-DSS处理的小鼠。F表示结肠炎评分。FOB代表粪便潜血检测血液阳性(fecal hemoccult blood positivity)，DAI代表疾病活性指数。数据表示至少三个独立实验。G部分显示结肠细胞因子分析。NCK56或NCK2025或DSS处理的小鼠(5/组)的结肠用冷PBS清洗，切成碎片，37℃培养18 h。使用ELISA测定细胞因子。

图4显示NCK2025对已建立的结肠炎的减轻。A-D部分显示三组C57BL/6小鼠(10/组)，其首先接受五天周期的3% DSS(溶解在无菌水中)以引发结肠炎，其中的两组随后连续四天用NCK56或NCK2025口服治疗。监测疾病进展，直至实验方案的第13天(此时小鼠被处死)，评估结肠。B-D部分显示结肠H&N染色。B部分显示DSS处理的小鼠；C部分显示DSS-NCK56处理的小鼠；D部分显示DSS-NCK2025处理的小鼠。E部分表示结肠炎评分。FOB代表粪便潜血检测血液阳性，DAI代表疾病活性指数。数据表示至少三个独立实验。F部分显示结肠细胞因子分析。洗涤各组小鼠的结肠，切成碎片，37℃培养18 h。通过ELISA测定细胞因子。

图5显示NCK2025对Treg细胞的诱导。A-B部分显示连续4天经口接种NCK56或NCK2025 (5x10⁸cfu/100 µl/小鼠)或PBS的C57BL/6小鼠(5/组)。在第五天，将小鼠处死，清洗分离的结肠。自每组小鼠制备结肠单细胞悬浮液，并通过Percol梯度富集。淋巴细胞用相应的或同种型匹配抗体染色，并通过FACSCalibur分析。重复实验至少7次。

图6显示IL-10^-/- 小鼠中结肠炎的诱导。A-B：C57BL/6 IL-10^-/-小鼠组(10/组)常规喂养1周。小鼠连续四天接种NCK56或NCK2025，然后喂食低剂量吡罗昔康(piroxicam) 1周，随后喂食高剂量吡罗昔康1周以加速并诱导结肠炎的发病。测定体重减轻，两周后处死小鼠，制备结肠横断面瑞士卷(colon cross-sectional Swiss roll)和组织切片用于H&E染色。C显示吡罗昔康单独处理的小鼠；D显示NCK56-吡罗昔康处理的小鼠；以及E显示NCK2025-吡罗昔康处理的小鼠。这些评分在0-4的范围内无分别地测定。

图7显示在小鼠中，在DSS诱导的结肠炎中用NCK56或NCK202治疗或不治疗时的基因调节。A-B部分显示DSS诱导结肠炎前给予NCK56、NCK2025或未处理达四天的小鼠(5/组)。分离近端或远端结肠区域并提取RNA。cDNA微阵列分析显示小鼠结肠中免疫调节/刺激、信号转导、增殖、凋亡、血管发生和粘附相关通路的差异性基因表达模式。值表示与对照小鼠相比暴露于实验条件的基因表达的倍数增加(>1.0)或表达的倍数减少(<1.0)。

图8提供SEQ ID NOS: 1-16的序列。

发明详述

现在将在下文中参照附图对本发明进行更全面地描述，其中显示本发明的一些但并非全部实施方案。事实上，这些发明可以以多种不同形式实施，并且不应解释为限于本文所示实施方案；更确切地，提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。在全文中相似的数字指相似的元素。

受益于前述说明和相关附图所呈现的教导，这些发明所属领域的技术人员将想到本文所示发明的多种修饰和其它实施方案。因此，应理解的是，本发明并非限于所公开的特定实施方案，且修饰和其它实施方案意欲包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文采用了特定术语，但其仅以一般性和描述性意义使用，而不用于限制目的。

概述

提供用于减少受试者炎症的方法和组合物，包括用于治疗或预防炎性病症的方法和组合物。使用经修饰以减少细菌细胞表面上LTA展示的重组细菌，这些方法和组合物可用于减少胃肠道炎症。胃肠道明显炎症是人IBD (包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)的代表性特征。通过减少细胞表面上的LTA展示，本发明重组细菌比相应的野生型细菌细胞显著减少净的炎性反应。因此，提供多种重组细菌及其使用方法，其在有需要的受试者中通过刺激抗炎细胞因子的产生和限制促炎细胞因子的产生而减少炎性反应。

LTA 展示减少的重组细菌细胞

提供减少细胞表面上LTA展示的方法和组合物。如本文所使用的，细胞表面上LTA展示的减少包括与适当的对照相比，细胞表面上展示的LTA水平的任何统计学上显著的减少。这样的减少可包括，例如，细胞表面上展示的LTA的量至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的减少。测定细胞表面上LTA量的方法包括，例如，丁醇和疏水相互作用色谱(Morath S, Geyer A, & Hartung T (2001) J Exp Med 193(3):393-397)或酶联免疫吸附测定(ELISA) (Tadler等(2005) J Clin Lab Anal. 1989;3(1):21)。

如本文所使用的，术语“表面”、“细胞表面”或“细菌表面”指包括质膜和在质膜外的细菌细胞的区域。革兰氏阳性细菌在质膜外包含一层其中散布磷壁酸的肽聚糖。革兰氏阴性细菌还包含覆盖肽聚糖层的外膜。因此，本发明表面上LTA的展示可在革兰氏阳性细菌质膜或肽聚糖层中或上，或在革兰氏阴性细菌的质膜、肽聚糖层或外膜中或上。

提供经遗传修饰以减少细胞表面上LTA展示的重组细菌细胞。如本文所使用的，术语“重组细菌”或“重组细菌细胞”指其中对于目的基因已产生至少一种遗传改变的细菌或多个(plurality)或细菌细胞，或源自于如此改变的细胞并且包括遗传改变的细胞。因此，如本文所使用的，术语“遗传修饰的”或“遗传修饰”指对于目的基因或核酸序列已产生的遗传改变，例如缺失、添加或取代。在一些实施方案中，所述遗传改变为人工重组技术所导致的改变。

在一些实施方案中遗传改变包括向细菌细胞基因组内引入异源多核苷酸。如本文所使用的，关于序列“异源的”为来源于外来物种的序列，或者，若源自同一物种，则自其天然形式在组成和/或基因组位点方面基本上被修饰。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，若来自相同/类似物种，则其一或二者自其原始形式和/或基因组位点基本上被修饰，或所述启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

本文所述方法和组合物中可使用任何目的细菌。在具体实施方案中，所述细菌包括益生菌细菌。如本文使用的术语“益生菌”指给予足够量时赋予宿主健康益处的活微生物(FAO 2001：参见网址isapp.net/docs/ProbioticDefinition.pdf)或至少一种有助于受试者肠道健康和平衡的生物。在具体实施方案中，其也被称为“友好的”、“有益的”或“好的”细菌，当受试者摄入时其帮助维持健康肠道并帮助部分或完全减轻病和/或疾病的一种或多种症状。如本文所使用的，“益生菌性质”包括增强的肠功能和稳定性、改善的针对传染和非传染性疾病的防护、免疫系统调节、减轻的乳糖不耐性、改善的消化和营养物吸收、减少的血液胆固醇、减少的变态反应风险和减少的尿道感染风险。在一些实施方案中，益生菌性质包括接受益生菌细菌的受试者中抗炎细性胞因子产生的增加、接受益生菌细菌的受试者中促炎细胞因子产生的减少或接受益生菌细菌的受试者中抗炎与促炎细胞因子产生的比率增加。

在一些实施方案中，已经对本文所述细菌进行修饰以增强一种或多于一种益生菌性质。例如，在一些实施方案中，提供已被修饰以增加胃肠上皮粘附并已被进一步修饰以减少细胞表面上LTA展示的细菌。在其它实施方案中，提供已被修饰以增加酸或胆汁抗性并已被进一步修饰以减少细胞表面上LTA展示的细菌。

在其它实施方案中，所述细菌为乳酸细菌。如本文所使用的，“乳酸细菌”是指选自以下属的细菌：气球菌属(Aerococcu)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、差异球菌属(Alloiococcu)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、乳球形菌属(Lactosphaera)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella) (Holzapfel等 (2001) Am. J. Clin. Nutr. 73:365S-373S; Sneath, ed. (1986) Bergey ’ s Manual of Systematic Bacteriology 第 2 卷, Lippincott, Williams和Wilkins, Hagerstown, MD)。

在又其它实施方案中，使用乳杆菌。“乳杆菌”意指来自乳杆菌属的任何细菌，包括但不限于干酪乳杆菌(L. casei)、类干酪乳杆菌(L. paracasei)、路氏乳杆菌(L. reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)、约氏乳杆菌(L. johnsonni)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌(L. plantarum)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、唾液乳杆菌(L. salivarius)、保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus)以及Wood等概述的许多其它种类(Holzapfel和Wood, eds. (1995) The Genera of Lactic Acid Bacteria ( 乳酸细菌属 ), 第 2 卷., Springer, New York)。在一个具体实施方案中，所述细菌为嗜酸乳杆菌NCFM。

LTA展示减少的细菌的产生、所述细菌起子培养物的制备以及使底物特别是食物底物例如牛奶发酵的方法可根据已知技术实施，所述技术包括但不限于Mäyrä-Mäkinen和Bigret (1993) Lactic Acid Bacteria. Salminen和vonWright编辑. Marcel Dekker, Inc. New York. 65–96.; Sandine (1996) Dairy starter cultures Cogan和Accolas编辑. VCH出版社, New York. 191–206; Gilliland (1985) Bacterial starter cultures for Food. CRC Press, Boca Raton, Florida中所描述的技术。

本文所述细菌细胞可在合适的培养基中培养，如Sambrook等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual ( 分子克隆实验室手册 ) (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中所一般性描述的。

在一些实施方案中，本文所述细菌菌株为生物学上纯的细菌培养物，所述细菌包含至少一种如本文所述导致细胞表面上LTA展示减少的遗传改变。在进一步的实施方案中，所述细菌包含一个或数个核苷酸添加、缺失和/或取代。这些菌株可包括但不限于：嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌或植物乳杆菌。“生物学上纯的”是指90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含其它细菌细胞。在其它实施方案中，本文所述细菌菌株与其它细菌菌株组合存在，以产生混合培养物。

“对照”或“对照细胞”或“对照细菌”为测量重组细菌细胞表型变化提供参考点。对照细菌可包括，例如：(a) 野生型细菌，即，具有与起始材料(其用于产生主题细菌的遗传改变)相同的基因型；或(b) 具有与起始材料相同的基因型但已用空构建体(null construct) (即，用对目的性状无已知作用的构建体，例如包含标记基因的构建体)转化的细菌。

LTA 相关多肽和多核苷酸

已经改变细胞表面上LTA展示减少的重组细菌使得至少一种LTA相关多核苷酸或多肽的活性水平已被调节(即升高或降低)。如本文所使用的，术语“LTA”指脂磷壁酸，一种糖脂锚定在膜中和聚(甘油磷酸酯) (Gro-P)链延伸至壁中的大型两亲性分子。在一些实施方案中，术语“LTA”或“脂磷壁酸”包括壁磷壁酸(WTA)，一种与细胞壁肽聚糖层共价连接的磷壁酸。LTA的生物合成从碳水化合物单元通过糖基转移酶转移以形成锚定在细胞内部膜上的糖脂开始。糖脂通过膜蛋白转运出细胞并锚定在细胞外面的细胞膜上。最终，磷酸甘油转移酶将甘油磷酸酯(Gro-P)单元转运至锚定的糖脂以形成伸长的LTA (图1)。因此，本发明LTA相关多核苷酸和多肽应理解为包括细胞表面上LTA产生、组成、转运、装配以及展示有关的多核苷酸和多肽。在一些实施方案中，细菌表面上LTA的展示减少以调节给予细菌的受试者的炎性反应。

这些LTA相关序列的片段和变体也可用于实施本文所述方法。如本文所使用的，术语“基因”和“重组基因”指包含开放阅读框的核酸分子，特别是编码LTA产生、装配或展示有关蛋白的那些。在一个实施方案中，LTA相关多核苷酸和多肽包含SEQ ID NOS：1和2，或其活性片段或变体。在进一步的实施方案中，LTA相关多核苷酸和多肽包含SEQ ID NOS：3-16或其活性片段或变体。

LTA相关多核苷酸包含编码LTA相关蛋白的编码序列，以及调节序列例如启动子两者。LTA相关多核苷酸可进一步包含正确翻译LTA相关mRNA所必需的位点，例如核糖体结合位点。

分离的LTA、细胞壁、细胞膜、细胞表面相关多肽和蛋白、或分泌的所述多肽和蛋白及其变体和片段为包括在内的。用于本发明目的，术语“蛋白”和“多肽”可互换使用。

如本文所使用的，术语“表达”指源自本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的翻译。表达可还指mRNA翻译为多肽。

减少 LTA 展示

提供调节靶LTA相关多核苷酸表达水平(浓度和/或活性)的方法和组合物。如本文所使用的，“靶序列”包括期需调节表达水平的任何序列。靶序列包括编码和不编码多肽的序列。功能性LTA相关多核苷酸或多肽理解为编码负责细菌表面上LTA产生、装配、转运或展示的蛋白、序列或RNA。因此，表达降低的LTA相关多核苷酸或多肽将产生与其野生型相应物相比LTA表面展示减少的细菌。在一些实施方案中，LTA表面展示减少的细菌可减少或预防患有IBD例如结肠炎的受试者的炎性反应。

“减少”或“降低”多核苷酸或其编码的多肽的表达水平意欲指靶序列的多核苷酸或多肽水平在统计学上低于适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定实施方案中，根据目前公开的主题降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或其编码的多肽水平至少95%的降低、至少90%的降低、至少80%的降低、至少70%的降低、至少60%的降低、至少50%的降低、至少40%的降低、至少30%的降低、至少20%的降低、至少10%的降低、至少5%的降低。在其它实施方案中，降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致与适当对照相比，多核苷酸水平或其编码的多肽水平约3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的降低。用于测定RNA转录物水平、所编码多肽水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文别处讨论。

在一些实施方案中，提高目的多核苷酸或多肽水平可减少细胞表面上LTA的展示。“增加”或“提高”多核苷酸或其编码的多肽水平意指靶序列的多核苷酸或多肽水平在统计学上高于适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定实施方案中，根据目前公开的主题提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致适当对照中相同靶序列的多核苷酸水平或其编码的多肽水平至少95%的提高、至少90%的提高、至少80%的提高、至少70%的提高、至少60%的提高、至少50%的提高、至少40%的提高、至少30%的提高、至少20%的提高、至少10%的提高、至少5%的提高。在其它实施方案中，提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致与适当对照相比，多核苷酸水平或其编码的多肽水平约3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的提高。用于测定RNA转录物水平、所编码多肽的水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文别处讨论。

表面LTA展示减少的重组生物可使用多种技术构建。在本发明中，可降低编码LTA装配途径中一个的至少一种酶例如磷酸甘油转移酶或糖基转移酶的多核苷酸或多肽的表达，如本文所述。

在一个实施方案中，降低LTA相关多肽(包括磷酸甘油转移酶)的水平。在某些实施方案中，降低SEQ ID NO: 2所示磷酸甘油转移酶或其活性片段或变体的表达。磷酸甘油转移酶是参与将Gro-P单元转移至糖脂从而延伸LTA链的多肽。已经知道多种磷酸甘油转移酶多肽和编码所述多肽的基因。如本文所使用的，磷酸甘油转移酶包括LTA合酶(LtaS)、甘油磷酸转移酶(glycerol phosphotransferase)、甘油磷酸转移酶(glycerophosphotransferase)和任何其它催化Gro-P单元转移以形成LTA聚甘油磷酸酯主链的多肽。磷酸甘油转移酶为碱性磷酸酶超家族(MdoB [COG1368] 磷酸甘油转移酶)的成员。参见，例如，NCBI登录号NZ_ACGX01000068.1和NC_010609.1。这些参考的每一个通过引用结合到本文中。

在另一个实施方案中，LTA相关多肽可包括糖基转移酶。在该实施方案中，使用本文别处描述的任何降低多核苷酸或多肽水平的方法降低糖基转移酶水平。在一个实施方案中，降低SEQ ID NO: 4或6所示糖基转移酶或其活性片段或变体的表达。糖基转移酶为参与LTA的糖脂或脂锚合成的多肽。已经知道糖基转移酶多肽和编码所述多肽的基因。如本文所使用的，术语糖基转移酶指催化LTA的糖脂或脂锚合成的任何多肽，包括例如YgpP、Ugt、BgsA、IagA、LafA或LafB。糖基转移酶为糖基转移酶_GTB_型超家族[cl10013]的成员。已知多种糖基转移酶。参见，例如NCBI登录号NC_010609.1和EF138835.1。这些参考的每一个通过引用结合到本文中。

对磷壁酸的D-Ala取代的质量和水平可减少细胞表面上LTA的展示。D-丙氨酰LTA的合成需要dlt操纵子编码的四个蛋白，DltA、DltB、DltC或DltD。因此，在一些实施方案中，LTA相关多核苷酸或多肽可包括Dlt操纵子中所示多核苷酸或多肽，包括SEQ ID NOS: 9-16。因此，在另一个实施方案中，使用本文别处所述任何降低LTA相关多核苷酸或多肽水平的方法降低DltA、DltB、DltC或DltD水平。已知dlt操纵子的多种成员。参见，例如NCBI登录号AAF09201 (DltA)、NCBI登录号AAB17658.1 (DltB)、NCBI登录号CAR86674.1 (DltC)和NCBI登录号CAQ65981.1 (DltD)。这些参考的每一个通过引用结合到本文中。LTA的结构可使用已知技术通过NMR和MS测量。参见，例如，Morath S, Geyer A, & Hartung T (2001) J Exp Med 193(3):393-397。

LTA相关多核苷酸或多肽表达的降低可通过本领域熟知的多种技术实现。例如，可通过突变降低基因表达。所述突变可为插入、缺失、取代或其组合，只要该突变导致功能性LTA相关蛋白表达降低或导致LTA相关多核苷酸表达降低使得细胞表面上LTA展示减少。LTA展示减少的细菌可用于减少受试者炎性反应，从而治疗或预防炎性肠病，例如结肠炎。

可使用重组DNA技术向染色体的特定位点引入突变。这样的突变可为插入、缺失、一个核苷酸被另一个核苷酸置换或其组合，只要突变基因导致功能性LTA相关蛋白表达降低或导致LTA相关基因表达降低使得细胞表面上LTA展示减少。这样的突变可通过缺失若干碱基对获得。在一个实施方案中，单个碱基对的缺失可致使LTA相关蛋白无功能，从而减少细菌表面上LTA的展示，这是因为由于该突变，其它碱基对不再处于正确的阅读框中。在其它实施方案中，移去多个碱基对例如100个碱基对。在又其它的实施方案中，缺失整个LTA相关基因的长度。在开放阅读框中引入终止密码子的突变或导致开放阅读框移码的突变可用于降低LTA相关基因的表达。

用于降低LTA相关基因表达以减少LTA展示的其它技术为本领域所熟知。例如，技术可包括通过定向诱变修饰基因序列、限制酶消化后重新连接、基于PCR的诱变技术、等位交换、等位置换、RNA干扰或翻译后修饰。标准重组DNA技术例如将LTA相关基因克隆入质粒、用限制酶消化基因、随后用内切核酸酶处理、重新连接以及同源重组为本领域所熟知，并在Maniatis/Sambrook (Sambrook, J.等 Molecular cloning: a laboratory manual (分子克隆：实验室手册). ISBN 0-87969-309-6)中描述。定向诱变可使用Clontech出售的TRANSFORMER试剂盒通过体外定向诱变方式获得。PCR技术在(Dieffenbach & Dreksler; PCR primers, a laboratory manual (PCR引物，实验室手册). ISBN 0-87969-447-3和ISBN 0-87969-447-5)中详细描述。

认为编码区中的突变以及正确转录和翻译所必需的序列(包括调节序列例如启动子)中的突变落在本发明的范围内。

在某些实施方案中，通过定向诱变修饰重组细菌以在表面上具有减少的LTA展示。在其它实施方案中，LTA展示减少的细菌自细菌种群中分离。将理解的是，本文所用术语分离的指从其天然环境中分离出的细菌。这可例如从混合细菌种群或环境样品中纯化。分离的细菌基本上不含其它细菌种类和该细菌天然环境组分。基本不含其它细菌种类和天然环境组分的细菌包括污染细菌种类或天然环境组分少于约30%、20%、10%、5%或1%的细菌制备物。

测定法

检测所公开多肽和/或核酸分子表达的测定法可包括LTA的检测和/或定量。用于检测LTA的方法在本文别处描述。细菌细胞表面上LTA展示的减少可导致暴露在细菌中的宿主细胞的抗炎性反应增加或促炎性反应减少。测量抗炎性或促炎性反应的测定法，例如，还可用于评估本发明LTA相关多肽的表达。测量炎性反应的方法亦在本文别处描述。

片段和变体

根据上下文，“片段”指多肽或蛋白氨基酸序列的一部分，或编码多肽或蛋白氨基酸序列的一部分的多核苷酸。片段可保留原始蛋白的活性，因此，这样的“活性”片段包括，例如，LTA相关蛋白的片段，例如保留磷酸甘油转移酶活性的SEQ ID NO: 2的片段。LTA相关核苷酸序列的片段，例如编码活性磷酸甘油转移酶的SEQ ID NO: 1的片段，可编码具有生物学活性的蛋白片段。此外，LTA相关蛋白片段包括SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14和16的片段。生物学活性核苷酸片段可如下制备：分离LTA相关多核苷酸或多肽的部分，表达LTA相关蛋白的编码部分并评估LTA相关蛋白的编码部分的活性。在其它实施方案中，LTA相关蛋白核苷酸序列的片段不需编码生物学活性多肽，而是可包含表达时抑制靶LTA相关多肽表达的多核苷酸(即有义、反义、miRNA或siRNA抑制)。LTA相关多核苷酸的片段包括SEQ ID NOS: 1、3、5、7、9、11、13和15的片段。LTA相关核酸分子的片段包含至少约15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个核苷酸或多达本文所公开全长LTA相关核苷酸序列中存在的核苷酸总数的核苷酸。

氨基酸序列的片段包括包含与LTA相关蛋白的氨基酸序列足够相同或衍生自LTA相关蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，或部分长度的蛋白并且显示至少一种LTA相关蛋白活性(即调节细胞表面上展示的LTA水平)，但其包含比本文所公开全长LTA相关蛋白少的氨基酸。LTA相关蛋白的生物学活性部分可为这样的多肽，其为例如10、25、50、100、150、200个连续氨基酸长度或多达本发明全长LTA相关蛋白(即SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14或16)中存在的氨基酸总数。这些生物学活性部分可通过重组技术制备并针对天然LTA相关蛋白的一种或多种功能活性，例如磷酸甘油转移酶活性进行评估。如本文所使用的，片段包含SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14或16的至少5个连续氨基酸。然而，本发明包括其它片段，例如蛋白中多于6、7、8或9个氨基酸的片段。

在一些实施方案中提供已被修饰以降低本文别处所提供核苷酸和氨基酸序列的变体表达的重组细菌。变体意指足够相同的序列。因此，本发明包括细菌，其经修饰以降低与编码SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14或16中LTA相关蛋白的核苷酸序列足够相同的核酸分子的表达或降低包含SEQ ID NOS: 1、3、5、7、9、11、13或15核苷酸序列或其互补序列(complement)的核酸分子的表达。变体多核苷酸进一步包括包含一个或数个添加、缺失或取代的序列。变体还包括本发明核苷酸序列编码的变体多肽。此外，本发明多肽具有与SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14或16中所示氨基酸序列足够相同的氨基酸序列。“足够相同的”意指一种氨基酸序列或核苷酸序列与另一氨基酸序列或核苷酸序列性比，包含足够或最小数目的相当或相同氨基酸残基或核苷酸，因此提供共同的结构域和/或表明共同的功能活性。保守变体包括由于遗传密码简并性而不同的那些核苷酸序列。

一般而言，分别与SEQ ID NOS: 2、4、6、8、10、12、14或16的任一氨基酸序列或SEQ ID NOS: 1、3、5、7、9、11、13或15的任一核苷酸序列具有至少约45%、55%、或65%同一性、优选至少约70%或75%同一性、更优选至少约80%、85%或90%、最优选至少约91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中被定义为足够相同的。本发明所包括的变体蛋白具有生物学活性，即其保留所需的天然蛋白LTA相关生物学活性，例如SEQ ID NO: 2的磷酸甘油转移酶活性。参见，例如，Varcamonti等 (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69: 1287–1289。蛋白的生物学活性变体可与该蛋白具有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10例如6-10、少至5、少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基的差异。

LTA相关多肽可通过多种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于诱变和多核苷酸改变的方法为本领域所熟知。参见，例如，Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel等 (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; U.S.专利号4,873,192; Walker和Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (分子生物学技术) (MacMillan出版公司, New York)及其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白生物学活性的氨基酸取代的指导可参见Dayhoff等 (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)的模型，其通过引用结合到本文。可进行保守取代，例如一个氨基酸用另一个具有相似性质的氨基酸进行交换。本领域技术人员将理解的是，本文所公开LTA相关多肽的活性可通过常规筛查测定法，例如本文别处所描述的测定法评估。

如本文所使用的，“天然序列”多肽包括与来源于自然的相应多肽具有相同氨基酸序列的多肽。这些天然序列多肽可从自然分离或可通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列”特别地包括多肽的天然存在的截短、可溶或分泌形式、天然存在的变体形式以及天然存在的等位变体。

如本文所使用的，两个多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”为当在特定比较窗口内比对最大对应性时，涉及两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数关于蛋白而使用时，公认不相同的残基位点往往因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，并因此不改变该分子的功能性质。当序列差异在于保守取代时，序列同一性百分数可向上调整以校正取代的保守性质。因这些保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调整的方法为本领域技术人员所熟知。典型地，其涉及给作为部分而非完全错配的保守取代评分，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，当相同氨基酸给予分数1，非保守取代给予分数0时，保守取代给予0-1之间的分数。计算保守取代的评分，例如在程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)中执行。

如本文所使用的，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列所确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)。所述百分数如下计算：确定两序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位点数目以得到匹配位点数目，将匹配位点数目除以比较窗口中的总位点数并将该结果乘以100以得到序列同一性百分数。

除非另外说明，本文所提供序列同一性/相似性值指使用GAP版本10获得的值，其使用下列参数：使用GAP权重50和长度权重3的核苷酸序列%同一性和%相似性以及nwsgapdna.cmp评分矩阵，使用GAP权重8和长度权重2的氨基酸序列%同一性和%相似性以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等价程序。“等价程序”意指对于任何两个目的序列，与GAP版本10产生的相应比对相比时，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对以及相同的序列同一性百分数的任何序列比较程序。

治疗和预防方法

提供用于减少受试者炎症的方法，包括给予本文别处所述重组细菌。在一些实施方案中，给予LTA展示减少的重组细菌可改善受试者的IBD例如结肠炎症状。在其它实施方案中，给予LTA展示减少的重组细菌可预防受试者IBD例如结肠炎发病。在一些实施方案中，LTA相关蛋白(包括，例如，磷酸甘油转移酶)表达降低(包括，例如，SEQ ID NO:1或其活性片段或变体表达降低)的重组细菌在细胞表面上具有减少的LTA展示，并且可改善已建立结肠炎的症状和预防结肠炎发病。参见下文实施例1。在一些实施方案中，提供用于在受试者中局部治疗和/或预防胃肠道炎症、治疗和/或预防胃肠道炎性病症以及局部治疗肠疼痛的方法。

“治疗”在本文中定义为治愈、愈合、缓和、减轻、改变、医治、改良、改善或影响患有胃肠病症的受试者的症状。待治疗受试者可患有胃肠病症或处于出现胃肠病症的风险中，包括例如，患有炎性肠病或处于出现炎性肠病的风险中。

给予重组细菌可用于预防或治疗目的。“预防”意指重组细菌预防性地提供，即细菌在任何症状之前提供。预防性给予重组细菌用于预防或减弱任何后续的症状。当治疗性地提供时，细菌在症状出现时(或其后不久)提供。物质的治疗性给予用于减弱任何实际症状。

“受试者”意指动物。在具体实施方案中，受试者为哺乳动物，例如灵长类或人。在其它实施方案中，受试者包括驯养动物例如猫科动物或犬科动物，或农用动物例如反刍动物、马、猪、家禽或绵羊。在具体实施方案中，用本发明药物制剂进行治疗的受试者为人。在一些实施方案中，进行治疗的人可为新生儿、婴儿、幼儿、青春期前的少年、青少年或成年人。本发明的受试者可能患有胃肠病症的症状或可能有胃肠病症的风险(例如已进行抗生素治疗的受试者)。

胃肠病症

本发明方法和组合物涉及炎性胃肠病症的治疗。如本文所使用的，术语“炎性胃肠病症”或“胃肠病症”或“胃肠道炎性病症”指免疫系统或免疫系统细胞介导的胃肠道或肠疾病。炎性胃肠病症包括，例如，炎性肠病(IBD)例如克罗恩病和溃疡性结肠炎、淋巴细胞结肠炎、显微镜下结肠炎、胶原性结肠炎、自身免疫性肠病、变应性胃肠疾病和嗜酸性胃肠疾病，以及腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛或便秘。在某些实施方案中，本发明方法涉及肥胖症或肥胖症症状包括IBD、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛或便秘的治疗或预防。参见，例如，Kadooka Y等 (2010) Eur J Clin Nutr. 64(6):636-43，其通过引用结合到本文中。

在一些实施方案中，炎症的减少可包括刺激肠健全；降低肠通透性；改善粘蛋白合成、分泌和/或质量；改善肠上皮的成熟和分化；改善营养吸收；增加转移抗微生物活性的可溶性因子的产生；刺激、改善或支持感染抗性；支持针对病毒或细菌感染的细胞或体液应答；增加细胞毒性(抗病毒和抗肿瘤两者)；支持全身和/或粘膜接种应答；提高或支持细胞和/或体液免疫；提高或支持天然免疫(包括嗜中性粒细胞、吞噬细胞、巨噬细胞和天然杀伤细胞活性)；提高或支持适应性T细胞和B细胞免疫；刺激辅助T细胞1 (Th1)细胞因子模式(提高IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α；人白细胞抗原-Dr (HLA-Dr)表达)；抑制炎症或产生全身和粘膜炎症介质(包括细胞因子和/或趋化因子)；通过降低总IgE和/或变应原特异性IgE而降低敏化；降低变应性细胞因子的产生；降低Th2支持性免疫球蛋白概况及其组合。

本文所用术语“抗炎细胞因子”指在具有该细胞因子受体的细胞中引发抗炎反应的天然存在的或重组的蛋白、其类似物或其片段。本发明抗炎细胞因子可为控制促炎细胞因子应答的免疫调节分子。本发明抗炎细胞因子包括白介素(IL)-1受体拮抗物、IL-4、IL-10、IL-11和IL-13、IL-16、IFN-α、TGF-β、G-CSF。

本文所用术语“促炎细胞因子”是指有利于炎症的免疫调节细胞因子。本发明的促炎细胞因子包括IL1-α、IL1-β、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-17、IL-18、TNF-α、LT、LIF、制瘤素或IFN-α、IFN-β、IFN-γ。

在一些实施方案中，给予重组细菌导致抗炎细胞因子产生的增加。如本文所使用的，抗炎细胞因子产生的增加或提高包括与适当的对照相比抗炎细胞因子水平的任何统计学上显著的增加。所述增加可包括，例如，抗炎细胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更大的增加。所述增加还可包括，例如，抗炎细胞因子水平至少约3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-85%、80%-95%、90%-105%、100%-115%、105%-120%、115% -130%、125%-150%、140%-160%、155%-500%或更大的增加。测定抗炎细胞因子水平的方法是已知的。参见，例如，Leng S., 等 (2008) J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63(8): 879-884。测定抗炎细胞因子产生的方法包括多重微珠测定法(multiplex bead assay)、ELISPOT和流式细胞术。参见，例如，Maecker 等 (2005) BMC Immunology 6:13。

方法和组合物还包括降低促炎细胞因子产生的方法和组合物，其可减少或防止炎性反应。如本文所使用的，促炎细胞因子产生水平的降低包括与适当对照相比受试者中促炎细胞因子产生水平的任何统计学上显著的降低。所述降低可包括，例如，促炎细胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的降低。测定细胞因子水平的方法是已知的，包括，例如Leng S., 等 (2008) J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63(8): 879-884。测定促炎细胞因子产生的方法包括多重微珠测定法、ELISPOT和流式细胞术。参见，例如，Maecker 等 (2005) BMC Immunology 6:13。

炎性细胞因子的产生还可通过测定抗炎细胞因子产生与促炎细胞因子产生的比率测量。在特定方面，与适当对照相比抗炎细胞因子产生与促炎细胞因子产生的比率增加约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、300、600、900、1000倍或更多。在其它方面，与适当对照相比抗炎细胞因子产生与促炎细胞因子产生的比率增加约1-5倍、约5-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40倍-60倍、约60倍-80倍、约80倍-约100倍、约100-200倍、约200倍-300倍、约300-400倍、约400-约500倍、约500-约500倍、约500倍-约700倍、约700倍-800倍、约800倍-约1000倍或更多。测定抗炎细胞因子产生与促炎细胞因子产生的比率的方法可参见例如，Leng S., 等 (2008) J Gerontol A Biol Sci Med Sci 63(8): 879-884。测定细胞因子产生的方法包括多重微珠测定法、ELISPOT和流式细胞术。参见，例如，Maecker 等 (2005) BMC Immunology 6:13。

炎性病症

在一些实施方案中，通过使用本文别处所述组合物和方法减少炎症，可治疗或预防免疫和炎性病症。例如，可通过本文所述方法和组合物治疗或预防的病症包括，但不限于：关节炎(类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、银屑病、皮炎包括特应性皮炎、慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化症、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)、脑膜炎、过敏性鼻炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏性病况、湿疹、哮喘、T细胞浸润和慢性炎症反应相关病况、动脉粥样硬化、自身免疫心肌炎、白细胞粘附缺陷、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮(包括肾炎、非肾脏的、盘状、脱发)、青少年糖尿病、多发性硬化症、过敏性脑脊髓炎、细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型过敏症相关免疫反应、结核病、结节病、肉芽肿病包括韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、粒细胞缺乏症、血管炎(包括ANCA)、再生障碍性贫血、Coombs阳性贫血、Diamond Blackfan贫血、免疫溶血性贫血包括自身免疫溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白血球减少症、白细胞渗出相关疾病、CNS炎性病症、多发性器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、变应性视神经炎、Bechet疾病、Castleman氏综合征、古德帕斯丘综合征、兰伯特-伊顿肌无力综合征、Reynaud氏综合征、Sjorgen氏综合征、史-约综合征(Stevens- Johnson syndrome)、实体器官移植排斥(包括高群体反应性抗体滴度的预处理、组织中的IgA沉积等)、移植物抗宿主疾病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮(均包括寻常天疱疮和落叶状天疱疮)、自身免疫性多内分泌腺病、莱特尔氏病(Reiter's disease)、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合物性肾炎、IgA肾病、IgM多神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢自身免疫性疾病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症、自身免疫性内分泌性疾病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's Thyroiditis))、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄森氏病(Addison's disease)、格雷夫氏病(Grave's disease)、自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)、I型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和席汉氏综合症(Sheehan's syndrome)、自身免疫性肝炎、淋巴间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格林-巴利综合症(Guillain-Barre'Syndrome)、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、贝格尔氏病(Berger's Disease) (IgA肾病)、急进性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、ALS或冠状动脉疾病。

在具体实施方案中，通过减少受试者的炎症，治疗或预防心脏病症。如本文所使用的心脏病症包括但不限于：心力衰竭(包括但不限于心脏肥大、左心衰竭和右心衰竭)、缺血性心脏病(包括但不限于心绞痛、心肌梗死、慢性缺血性心脏病和心脏性猝死)、高血压性心脏病(包括但不限于全身性(左侧)高血压性心脏病和肺部(右侧)高血压性心脏病)、瓣膜性心脏病(包括但不限于钙化引起的瓣膜变性，例如钙化性主动脉瓣狭窄、先天性二叶主动脉瓣钙化、二尖瓣环钙化、二尖瓣粘液瘤样变性(二尖瓣脱垂)、风湿热、风湿性心脏病、感染性心内膜炎、和非感染的赘生物例如非细菌性血栓性心内膜炎和全身性红斑狼疮心内膜炎(Libman-Sacks疾病)、类癌性心脏病和人工瓣膜并发症)、心肌病(包括但不限于扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病和心肌炎)、心包疾病(包括但不限于心包积液、心包积血、心包炎包括急性心包炎和愈合性心包炎(healed pericarditis)、类风湿性心脏病)、赘生物性心脏病(neoplastic heart disease) (包括但不限于原发性心脏肿瘤，例如粘液瘤、脂肪瘤、乳头状纤维弹性组织瘤、横纹肌瘤、肉瘤，和非心脏赘生物的心脏效应)、先天性心脏病(包括但不限于左向右分流-晚发绀，例如房间隔缺损、室间隔缺损、动脉导管未闭、和房室间隔缺损；右向左分流-早发绀，例如法洛四联症、大动脉易位、动脉干、三尖瓣闭锁、和完全性肺静脉异常连接；阻塞性先天异常，例如主动脉缩窄、肺动脉狭窄和闭锁、主动脉狭窄和闭锁)以及心脏移植相关病症。

药物组合物

在一些实施方案中，将LTA展示减少的细菌菌株以营养药物组合物(nutraceutical composition)例如营养补剂和/或食品添加剂的形式给予受试者。在具体的实施方案中，药物组合物包含已经修饰以降低编码磷酸甘油转移酶的多核苷酸或多肽(例如SEQ ID NO: 1和2中所示多核苷酸和多肽)表达的重组细菌。在其它实施方案中，将提取物以药物组合物的形式给予受试者。如本文其它部分所述，给予可包括单剂量或多剂量给予。

药物组合物可以是液体制剂或固体制剂。当药物组合物是固体制剂时，其可配制成片剂、口含片(sucking tablet)、咀嚼片、口香糖、胶囊剂、小药囊剂、散剂、颗粒剂、包衣颗粒、包衣片、肠包衣片、肠包衣胶囊、口溶条(melting strip)或膜。如果药物组合物是液体制剂，则其可配制成口服溶液剂、混悬剂、乳剂或糖浆剂。所述组合物还可包含独立选自(但不限于)以下的载体材料：乳酸发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白质。

本文所用术语“药物组合物”可配制成食物组合物、膳食补充剂、功能食品、医药用食品或营养制品，只要达到所需作用，即治疗或预防胃肠道炎性病症。所述食物组合物可选自饮料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、饼干、薄脆饼干、谷类食物、健康条(health bar)、涂味品(spreads)和营养制品。食物组合物还可包含载体材料，其中所述载体材料选自乳酸发酵食品、发酵乳制品、抗性淀粉、膳食纤维、碳水化合物、蛋白质和糖基化蛋白质。

按照本发明使用的或按照本发明产生的本发明的药物组合物还可包含众所周知的其它物质，例如惰性溶媒或药学上可接受的辅助剂、载体、防腐剂等。

本公开内容还包括重组细菌彼此的组合，和/或与一种或多种可用于治疗胃肠道炎性病症的其它药剂的组合。例如，本发明细菌可与有效剂量的治疗胃肠道炎性病症的常规抗炎剂例如泼尼松(prednisone)、美沙拉秦(mesalamine)、硫唑嘌呤、TNF抑制剂、氨甲喋呤或6-巯嘌呤组合给予。术语“组合给予”指活性剂的同时给予和序贯给予两者。组合疗法当然并不限于本文提供的药剂，而是包括用于治疗炎性病症的任何组合物。

治疗有效量

“治疗有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”意指给予受试者时减少炎性反应或防止炎性反应增加的LTA展示减少的重组细菌的量。“阳性治疗反应”指，例如，改善炎性胃肠病症的至少一种症状的病况。

有效量的治疗剂根据预定目的确定。术语“单位剂量“是指适用于受试者的物理独立单位，各单位含有经计算产生所需的与其给予(即合适的途径和治疗方案)相关的反应的治疗组合物的预定量。按照治疗次数和单位剂量两者的待给予的量，取决于待治疗的受试者、受试者的状态和所需保护。治疗组合物的确切量还取决于从业人员的判断，并且为每个个体所特有。一般而言，重组细菌的剂量可随例如患者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和既往病史等因素而变化。在具体的实施方案中，可合乎需要的是，给予细菌的范围为约10⁴-约10¹² CFU、10⁵ - 10¹¹ CFU、10⁶ - 10¹⁰ CFU、10⁸ - 10¹⁰ CFU或10⁸ - 10¹² CFU。

在本发明的一些实施方案中，所述方法包括给予多剂量的细菌。所述方法可包括给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多治疗有效剂量的包含本文所述细菌的组合物。在一些实施方案中，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或超过30天的时程内给予剂量。多剂量组合物的给予频率和持续时间是这样的，使得降低或预防炎性反应，从而治疗或预防胃肠病症。此外，用治疗有效量的本发明的重组细菌治疗受试者可包括单一治疗或可包括系列治疗。还应理解的是，可在具体治疗进程中增加或减少用于治疗的细菌的有效剂量。剂量的改变可起因于本领域已知的和本文描述的用于检测炎症的诊断测定结果，并且从该结果来看是显然的。

保藏物

申请人于2011年1月10日在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，马纳萨斯，VA 20110 USA对嗜酸乳杆菌NCK2025进行了保藏，ATCC保藏号为PTA-11587。自本申请提交日期之前，2011年1月10日保藏在ATCC的细菌培养物取自由北卡罗来纳州立大学，100 Schaub Hall，校园邮箱(Campus Box)7624，罗利(Raleigh)，北卡罗来纳州，27695维持的保藏物。在本申请未决期间，向专利商标局局长及局长授权而定的人员提出请求时，可获得该保藏物。在本申请任何权利要求的许可时，申请人将依照37 C.F.R. §1.808使公众可获得该保藏物。该嗜酸乳杆菌NCK2025保藏物将在作为公共保藏机构的ATCC保藏机构维持达30年的时间，或在最新要求后5年，或专利可实施期限(哪个期限较长就维持该较长的期限)，且如果保藏物在该期限内变得非存活的，则将更换。另外，申请人已符合或将符合37 C.F.R. §§1.801 - 1.809的全部要求，包括在保藏时提供样品存活性的说明。申请人无权免除有关生物材料转移或其商业运输时法律所强加的任何限制。

根据上文提供的描述，提供下列实施方案：

已编号的实施方案：

1. 重组或分离的细菌，其已经被遗传修饰以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。

2. 实施方案1的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低磷酸甘油转移酶表达。

3. 实施方案1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO:1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

4. 实施方案1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。

5. 前述实施方案中任一个的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌为益生菌细菌。

6. 实施方案5的重组或分离的细菌，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。

7. 实施方案6的重组或分离的细菌，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。

8. 实施方案7的重组细菌，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。

9. 实施方案8的重组或分离的细菌，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。

10. 实施方案8的重组或分离的细菌，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。

11. 制备重组或分离的细菌的方法，所述方法包括遗传修饰细菌以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)展示。

12. 实施方案11的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。

13. 实施方案11或12的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

14. 实施方案11-13中任一个的方法，其中所述重组细菌为益生菌细菌。

15. 实施方案14的方法，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。

16. 实施方案15的方法，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。

17. 实施方案16的方法，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。

18. 实施方案17的方法，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。

19. 实施方案17的方法，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。

20. 实施方案17-19中任一个的方法，其中所述嗜酸乳杆菌已经被修饰以降低包含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。

21. 减少受试者炎症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的实施方案1-10中任一个的重组或分离的细菌。

22. 治疗或预防受试者胃肠道炎性病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的实施方案1-10中任一个的重组或分离的细菌。

23. 实施方案21或22中任一个的方法，其中所述受试者为动物。

24. 实施方案23的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

25. 实施方案24的方法，其中所述受试者为人。

26. 实施方案23的方法，其中所述受试者为驯养动物。

27. 实施方案23的方法，其中所述受试者为农用动物。

28. 实施方案21-27中任一个的方法，其中所述受试者患有胃肠病症。

29. 实施方案28的方法，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

30. 实施方案21-29中任一个的方法，其中所述细菌增加所述受试者中一种或多种抗炎细胞因子的产生。

31. 实施方案30的方法，其中所述抗炎细胞因子为IL-10。

32. 实施方案21-31中任一个的方法，其中所述细菌降低所述受试者中一种或多种促炎细胞因子的产生。

33. 实施方案32的方法，其中所述促炎细胞因子选自IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα及其任何组合。

34. 实施方案21-33中任一个的方法，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

35. 包含实施方案1-10中任一个的重组或分离的细菌的药物组合物。

36. 实施方案1-10中任一个的重组或分离的细菌，其用作药物。

37. 实施方案1-10中任一个的重组或分离的细菌，其用于治疗或预防受试者例如实施方案23-27中任一个的受试者的胃肠道炎性病症。

38. 实施方案36或37的重组或分离的细菌，其中所述细菌导致所述受试者中抗炎细胞因子产生的增加。

39. 实施方案38的重组或分离的细菌，其中所述抗炎细胞因子为IL-10。

40. 实施方案36-39中任一个的重组或分离的细菌，其中所述细菌降低所述受试者中一种或多种促炎细胞因子的产生。

41. 实施方案40的重组或分离的细菌，其中所述促炎细胞因子选自IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα及其任何组合。

42. 实施方案36-41中任一个的重组或分离的细菌，其中将所述细菌配制为以治疗有效量给予受试者，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

43. 实施方案36-42中任一个的重组或分离的细菌，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

44. 实施方案1-10中任一个的细菌在制造药物中的用途。

45. 44中的细菌在制造用于治疗或预防受试者例如实施方案23-27中任一个的受试者的胃肠道病症的药物中的用途。

46. 实施方案44或45中的细菌在制造用于治疗炎性病症的药物中的用途。

47. 实施方案46的细菌的用途，其中所述病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

48. 实施方案1-10中任一个的细菌作为药物的用途。

49. 实施方案48中细菌的用途，其中所述药物用于治疗或预防受试者例如实施方案23-27中任一个的受试者的胃肠道病症。

50. 实施方案48或49中的细菌的用途，其中所述病症为炎性病症。

51. 实施方案50的细菌的用途，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

未编号的实施方案

根据第一个方面，提供重组或分离的细菌，其经遗传修饰以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。

在一个实施方案中，重组或分离的细菌已被遗传修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。在具体实施方案中，重组或分离的细菌已被遗传修饰以使磷酸甘油转移酶的表达与未修饰的对照相比降低约3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%。

在进一步的实施方案中，重组或分离的细菌以被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13或15中任一所示核酸序列或其片段或变体具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

在进一步的实施方案中，重组或分离的细菌已被遗传修饰以降低包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列或其片段或变体的多核苷酸表达。

根据第二个方面，提供制备重组或分离的细菌的方法，所述方法包括遗传修饰细菌以减少该细菌表面上脂磷壁酸的展示。在具体实施方案中，通过定向诱变修饰细菌。

在进一步的实施方案中，所述重组或分离的细菌已被修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。

将理解的是，降低磷酸甘油转移酶的表达可由DNA、RNA或翻译后水平的破坏导致，获得这种表达降低的合适方法在本领域是已知的，并在本文中进一步详细讨论。

在另一个实施方案中，所述重组或分离的细菌已被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13或15中任一个所示核酸序列或其片段或变体具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

在进一步的实施方案中，嗜酸乳杆菌已被修饰以降低包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13或15所示核苷酸序列或其片段或变体的多核苷酸表达。

在进一步的实施方案中，所述重组或分离的细菌为益生菌细菌。特别地，乳酸细菌。更特别地，乳杆菌特别是嗜酸乳杆菌。甚至更特别地，遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。

在具体实施方案中，重组或分离的细菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。

第三方面，提供减少受试者炎症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的本文别处所述重组或分离的细菌。

在一个实施方案中，炎症的减少治疗或预防心脏疾病例如冠状动脉疾病或心力衰竭。

第四方面，提供治疗或预防胃肠道炎性病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的本文别处所述重组或分离的细菌。

在一个实施方案中，受试者为动物，更特别地哺乳动物。

在另一个实施方案中受试者为人。

在进一步的实施方案中受试者为驯养动物。

在又进一步的实施方案中，受试者为农用动物。

在进一步的实施方案中，受试者患有胃肠病症。

在具体实施方案中，所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

将理解的是，细菌可增加受试者中一种或多种抗炎细胞因子的产生。

在具体实施方案中，抗炎细胞因子为IL-10。

在另一个实施方案中，细菌降低受试者中一种或多种促炎细胞因子的产生。

在进一步的实施方案中，促炎细胞因子选自：IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα或其任何组合。

在进一步的实施方案中，细菌以治疗有效量给予，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

根据第五个方面，提供包含本文所述重组或分离的细菌的药物组合物。

根据第六个方面，提供用作药物的本文所述重组或分离的细菌。

根据第七个方面，提供用于治疗或预防受试者胃肠道病症的本文所述重组或分离的细菌。

特别地，所述病症为炎性病症。

更特别地，所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

在另一个实施方案中，用于本文所述方法的重组或分离的细菌增加受试者抗炎细胞因子的产生。

在一个实施方案中，抗炎细胞因子为IL-10。

在另一个实施方案中，用于本文所述方法的重组或分离的细菌降低受试者一种或多种促炎细胞因子的产生。

在进一步的实施方案中，促炎细胞因子选自：IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα或其任何组合。

将理解的是，细菌以治疗有效量提供，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

根据第八个方面，提供本文别处所述细菌在制造药物中的用途。

在具体实施方案中，所述药物用于治疗或预防受试者胃肠道病症。

在进一步的实施方案中，所述病症为炎性病症。

在进一步的实施方案中，所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

根据第九个方面，提供本文所述细菌作为药物的用途。

在具体实施方案中，所述药物用于治疗或预防受试者的胃肠道病症。

在进一步的实施方案中，所述病症为炎性病症。

在进一步的实施方案中，所述病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

将显而易见的是，关于本文所述任何方面的受试者可为任何合适的受试者，例如关于上述第四方面所描述的受试者。

进一步的方面如上所述。对于本领域技术人员将显而易见的是，关于一个特定方面所描述的任何特征同样适用于所有其它方面，除非另外特别说明或明显不相容。

下列实施例以说明的方式而非限制的方式提供。

实验

实施例 1

减少嗜酸乳杆菌的 LTA 展示。在嗜酸乳杆菌NCFM (NCK56)中，鉴定基因LBA0444-LBA0447并注释其在LTA生物合成中的推定作用(图1B)。基因LBA0444和LBA0448两侧为推定的rho非依赖性终止子(Kingsford C, Ayanbule K, & Salzberg S (2007) Genome Biology 8(2):R22)，提示此两基因为共转录的并起操纵子作用。虽然LBA0444-LBA0447基因在LTA生物合成中具有推定的作用，但LBA0448为在该级联中似乎不发挥作用的假定蛋白。

乳杆菌物种可有效激活DC中的多种信号，其继而诱发T细胞免疫反应(Mohamadzadeh M, 等 (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102(8):2880-2885; Konstantinov SR, 等 (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(49):19474-19479)。为了进一步研究修饰DC功能涉及的分子机制，我们特别删除了嗜酸乳杆菌NCK56的磷酸甘油转移酶基因(LBA0447)。该基因组区域的PCR分析显示该缺失突变体NCK2025失去2 kbp(图1C-D)。该区域内的测序确定了LBA0447的消除。亲本NCK56和突变体NCK2025的细胞壁提取物的色谱分析证明磷酸甘油转移酶基因已缺失的突变体中不存在LTA。

NCK2025 处理的 DC 。DC与NCK56或LTA-阴性突变体(NCK2025)的共培养显示NCK2025下调DC表面上的MHC II、CD40、CD80和CD86 (图2A)。此外，用NCK56处理DC诱导TLR1和2的转录，而在NCK2025处理的DC中此两种模式识别受体(PRR)未活化(图2B)。两个菌株均诱导DC中IL-10的产生；然而，该细胞因子的产生在与NCK2025共培养的DC中显著增加(图2C)。伴随地，IL-12和TNFα在NCK2025处理的DC中显著减少(图2C)。通过共培养肠系膜LN来源的T细胞与用NCK56或NCK2025处理的骨髓来源的DC来测定T细胞增殖。相对于NCK56，与T细胞共培养的NCK2025处理的DC中T细胞增殖显著消除(图2D)。有趣的是，向NCK2025处理的DC上清液中加入抗IL-10抗体部分地恢复了T细胞的增殖，提示IL-10可为DC:T细胞共培养物中调节T细胞增殖的关键因子。对收集的DC:T细胞共培养物上清液的分析显示T细胞中IL-10被高度诱导，而IFNγ、IL-2和TNFα自NCK2025处理的小鼠的T细胞中最小程度地释放(图2E)。

NCK2025 对 DSS 诱导的结肠炎的改善。为确定NCK2025在体内的免疫调节性质，在3% DSS暴露前(预防的)或后(治疗)用NCK56或NCK2025连续处理四天的小鼠中分析DSS诱导的结肠炎。数据显示相对于基线(图3B) DSS在未处理的C57BL/6小鼠(图3A、C)中诱导临床和组织学结肠炎。临床上，小鼠在第9天后开始减轻体重，且到第13天为约10%的总体重损失并在约10-11天发生严重的血性腹泻(图3A)。相比之下，经口接种NCK2025的小鼠显著防止体重损失、减少腹泻和潜血检测阳性(图3A)。总体而言，从第2天起“疾病活性指数”(DAI)一直显著降低。此外，用NCK2025预处理小鼠降低组织学结肠炎评分多达90% (21.5±1.4至2.3±0.5) (图3B-F)。相应地，图3E表示具有限制在粘膜的有限炎症的完整、未成为溃疡的上皮。为明确论述LTA缺失在NCK2025对结肠炎的预防中的作用，第三组小鼠用NCK56处理。野生型嗜酸乳杆菌NCK56不预防结肠炎发病(图3A和3D)，并且小鼠出现与未处理小鼠相似的临床和组织学结肠炎。为阐明结肠组织表达的细胞因子，从各组小鼠中提取结肠并培养过夜。结肠细胞因子分析显示来源于NCK56和DSS处理小鼠的结肠中IL-6、IL-12、TNFα和IFNγ水平较高(图3G)。相比之下，来源于NCK2025处理小鼠的结肠培养物中IL-10产生显著上升。经NCK2025处理的小鼠结肠中IL-12、IL-6、IFNγ和TNFα显著减少(图3G)。

此外，在DSS诱导的结肠炎中，对接种NCK56与NCK2025的小鼠远端和近端区域基因的研究显示免疫刺激的(即CD40、CCL11)、信号转导(即Stat1、Stat4)和增殖/凋亡/血管发生/蛋白水解酶(即TIMP1、FASL、ICAM1)基因的上调，提示NCK56而非NCK2025处理的小鼠中有活性的炎性反应(图7A和7B)。有趣的是，多种调节的、信号转导和抗炎基因[即血小板活化因子乙酰水解酶(PLA2G7)、血清应答因子(SRF)、TGFβ、(p21-活化激酶PAK1、RAF1、基质金属蛋白酶(TIMP1)的组织抑制剂、Tyk2]在NKC2025而非NCK56或DSS单独处理的小鼠结肠远端(非近端)区域被高度调节(图7A)。这暗示这些基因在DSS诱导的结肠炎更严重的远端结肠变得显著活化以发挥其调节功能。

NCK2025 对 DSS 诱导的结肠炎的治疗作用。为了论述已建立结肠炎的小鼠中NCK2025暴露的作用，用NCK56或NCK2025处理前先将小鼠暴露在3%DSS中。一旦疾病症状发生，小鼠接受NCK56或NCK2025连续四天(图4A)。数据显示NCK56和NCK2025二者均减弱已建立的结肠炎，但减弱程度明显不同。用NCK2025处理小鼠导致体重稳定化以及腹泻和失血的快速消退，而NCK56处理的小鼠持续失去体重，但速率较慢，并且腹泻和失血的消退明显较慢(图4A)。组织学分析显示第13天DSS处理的小鼠中持续的活性结肠炎和溃疡形成，且结肠炎评分为16.8 ± 2.2 (图4B、E)。NCK2025处理的小鼠具有明显改善的结肠炎评分(8.4±2.2, p=0.01)，表明加速的愈合，包括稀少的溃疡形成、再生的隐窝结构和炎症主要限制在粘膜(图4D、E)。再次，NCK56处理轻度改善组织学结肠炎评分(14.7±2.0, p=NS)，伴随表皮恢复，但有限的隐窝再生以及粘膜和粘膜下层的持续性活性炎症(图4C, E)。有趣的是，NCK2025处理的小鼠的细胞因子分析显示IL-10的上调和这些小鼠结肠中IL-12、TNFα、IL-6和IFNγ的最小程度释放(图4F)。相比之下，NCK56或DSS单独处理的小鼠结肠中IL-12、TNFα、IFNγ和IL-6被高度诱导，并且在这些组的小鼠中IL-10最小程度释放(图4F)。

NCK2025 对结肠 CD4⁺FoxP3⁺T 细胞的诱导。CD4⁺ Treg细胞的作用近来已经在抑制对自身和共生小型生物群的免疫反应失调方面特别关注(Fontenot JD, Gavin MA, & Rudensky AY (2003) Nat Immunol 4(4):330-336)。因此，对NCK2025 (其在经处理小鼠的DC和结肠微环境中诱导IL-10)进行研究以确定与NCK56相比其是否增加结肠CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞。实际上，图5A&B显示与NCK56相比经NCK2025处理小鼠的结肠中Treg细胞被显著诱导，提示这些细胞的抑制剂作用可影响DSS诱导的粘膜过度炎症。

IL-10 的调节作用。体外研究的数据以及体内细胞因子分析提示NCK2025改善结肠炎的作用依赖于粘膜IL-10的诱导( Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, & Muller W (1993) Cell 75(2):263-274)。为证实这些观测结果，如上在IL-10^-/-小鼠中实施“预防性”和治疗性研究。IL-10^-/-小鼠在暴露于共生细菌时出现自发的Th1介导的结肠炎，具有与人克罗恩病类似的深的、透壁的溃疡损伤(Berg DJ, 等 (1996) J Clin Invest 98(4):1010-1020)。在结肠炎发病前，小鼠连续四天接种NCK56或NCK2025 (或不处理作为对照组)。如上所述结肠炎的发病通过吡罗昔康处理诱导。临床上，在28天内监测体重减轻，处死后分离结肠以评估组织结肠炎的程度。在诱导的结肠炎的起初两周期间，未观察到NCK56或NCK2025对预期的体重减轻的防护(图6A)。总起来说，全部三组出现相似的组织学结肠炎和结肠炎评分(图6B-E)，提示NCK2025的免疫调节性质需要内源性IL-10。

讨论

控制肠免疫耐受的免疫机制损坏导致慢性IBD (Macdonald TT & Monteleone G (2005) Science 307(5717):1920-1925; MacDonald TT & Gordon JN (2005) Gastroenterol Clin North Am 34(3):401-412, vii-viii)。CD患者固有层中IFNγ⁺T细胞数目的增加有力地提示IBD发病机制中Th1极化的参与( Fuss IJ, 等 (1996) J Immunol 157(3):1261-1270; 25-27; Neurath MF, Duchmann R, & Meyer zum Buschenfelde KH (1996) Dtsch Med Wochenschr 121(22):735-741 (in ger); Neurath MF, 等 (1996) J Exp Med 183(6):2605-2616)导致失控的肠炎症和组织破坏(Powrie F (1995) Immunity 3(2):171-174)。当被高度活化DC释放的炎性细胞因子(即IL-12)外周激活时，CD8⁺ (Cheroutre H (2006) Gastroenterology 131(2):667-670; Vezys V & Lefrancois L (2002) J Immunol 169(12):6677-668)和CD4⁺ T细胞( Elson CO, 等 (2005) Immunol Rev 206:260-276; Wirtz S & Neurath MF (2000) Int J Colorectal Dis 15(3):144-160)均触发肠炎症。因此，有效的免疫疗法需要深入理解引起免疫耐受(通常由调节信号维持)损坏的免疫信号转导机制(Wirtz S, 等 (1999) J Immunol 162(4):1884-1888)。

近来，对嗜酸乳杆菌基因组的测序和注解允许对该细菌细胞表面的可影响粘膜细胞和分子事件的组分进行基因操作，最终导致治疗应用(Konstantinov SR, 等 (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(49):19474-19479; Altermann E, 等 (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102(11):3906-3912)。嗜酸乳杆菌的细胞壁和细胞表面蛋白包含维持细胞形状和激活免疫细胞(包括DC)的关键组分( Konstantinov SR, 等 (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(49):19474-19479)。为了研究细菌与先天细胞(即DC)之间的复杂通讯(crosstalk)及其与结肠炎的关联，删除嗜酸乳杆菌中编码磷酸甘油转移酶(其合成LTA的甘油链)的基因。数据显示嗜酸乳杆菌LTA阴性突变体，NCK2025，在小鼠DC中诱导调节信号(即IL-10)和较少的协同刺激分子(CD40, CD86)，有效将这些细胞转变为调节性DC(Belkaid Y & Oldenhove G (2008) Immunity 29(3):362-371)。这些调节性DC随后与CD4⁺ T细胞的相互作用明显改变T细胞活化。此外，NCK2025处理改善DSS诱导的结肠炎，提示用该细菌菌株预处理动物诱导如结肠组织学所证实的抵抗DSS攻击的调节免疫、体重减轻、减少的腹泻和潜血检测阳性。

调节粘膜内明显炎性反应的一个机制为IL-10 (Kraus TA, 等 (2005) J Clin Invest 115(8):2234-2243; Kraus TA & Mayer L (2005) Curr Opin Gastroenterol 21(6):692-696)。我们的数据清楚地显示该细胞因子不仅由DC，而且还由经NCK2025处理小鼠的结肠组织高度分泌，此现象在治疗DSS结肠炎的预防性和治疗性策略中均可见到。先前已经表明IL-10通过其发挥抗炎作用的能力调节先天和获得性免疫反应两者(Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, & O'Garra A (2001) Annu Rev Immunol 19:683-765; Trinchieri G (2007) J Exp Med 204(2):239-243)。该细胞因子通过下调MHC II、协同刺激分子和DC中IL-12的产生(其全部强烈参与T细胞分化和活化)功能上抑制T细胞(Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, & O'Garra A (2001) Annu Rev Immunol 19:683-765; de Waal Malefyt R, Abrams J, Bennett B, Figdor CG, & de Vries JE (1991) J Exp Med 174(5):1209-1220)。此外，IL-10还通过其启动淋巴细胞中多重信号级联(包括Jak1, Tyk2和Stat3通路)的活化的IL-10受体( Finbloom DS & Winestock KD (1995) J Immunol 155(3):1079-1090)调节CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、B细胞和Th1极化(Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, & O'Garra A (2001) Annu Rev Immunol 19:683-765) 。这些观测结果证明粘膜耐受性的调节和维持由强烈修饰致病CD4⁺ T免疫反应的IL-10严格控制，与本文给出的结果一致。此外，近来使用发生严重结肠炎的IL-10缺陷小鼠证明了IL-10在对良性抗原的反应中的关键作用(Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, & Muller W (1993) Cell 75(2):263-274)。如上所见，NCK2025的免疫调节作用不足以完全逆转IL-10^-/-中已建立的结肠炎，然而，当以预防/治疗性方式给予时其确实消除了结肠炎的诱导，突出了IL-10在调节炎症发病中的关键作用。

重要地，不断增加的证据支持以下观念：IL-10分泌型Treg细胞控制DC炎性性质(Lund JM, Hsing L, Pham TT, & Rudensky AY (2008) Science 320(5880):1220-1224)，其继而调节有效的T细胞免疫的诱导，以控制继发的组织损伤(Matarese G, De Rosa V, & La Cava A (2008) Trends Immunol 29(1):12-17)。在此方面，我们证明嗜酸乳杆菌LTA阴性突变体处理增加小鼠结肠中CD4⁺FoxP3⁺Treg细胞的数量。这些观测结果有力支持Treg细胞在炎性病症中的关键作用，如先前在人和啮齿动物模型(其中FoxP3基因突变导致失控的增殖以及Th1和Th2细胞因子信号的显著增加)中所证实的(Fontenot JD, Gavin MA, & Rudensky AY (2003) Nat Immunol 4(4):330-336)。可调节IL-10及其随后对先天和T细胞的作用的其它机制仍有待确定。涉及嗜酸乳杆菌中LTA合成的整个基因的完全缺失产生衍生细菌，其显著影响肠道微环境、诱导调节信号(即IL-10、Treg细胞)并能在诱导的炎性免疫反应期间修复细胞共存。嗜酸乳杆菌呈现独特的彻底改变DC功能的S层蛋白展示(Konstantinov SR, 等 (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(49):19474-19479, Mohamadzadeh M, Duong T, Sandwick SJ, Hoover T, & Klaenhammer TR (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(11):4331-4336)。嗜酸乳杆菌的S层由三个S层A、B和X基因组成(Goh YJ, 等 (2009) Appl Environ Microbiol 75(10):3093-3105, Goh YJ & Klaenhammer TR (2009) Front Biosci 14:1362-1386)，其中“自组装”的S层蛋白A或B为覆盖该细菌表面的主要蛋白。当免疫反应通过给予益生菌微生物调节(即活性IBD)或保持不受干扰(即肠道感染)时，非永久寄居肠中的外来细菌的遗传修饰可提供更多治疗选择。其将有助于开发可优化口腔免疫反应调节的治疗媒介物。因此，建立这样一种针对自身免疫疾病的益生菌干预必须从多个免疫角度精心协调以取得较好的临床结果。

首先，炎症的主导调控不应保持不变，这是因为炎症是常规免疫的一部分(Nathan C (2002) Nature 420(6917):846-852)。寄居肠道的细菌可损害维持肠道调节/协同刺激免疫平衡所需的免疫反应。例如，感染期间，免疫过程允许识别病原体，并激活促进从感染中恢复的先天和获得性免疫反应。因此，协调一系列事件的炎症必须进行适当分期和调节以实现微生物消除，但仍防止由于多种免疫级联和病原体存在所致的不必要的组织损伤。这样的炎性过程可通过可引起炎性反应的扩大、抑制或调节的反馈回路和特定检查点控制。所述正和负反馈回路依赖于介导炎性反应的多种分子，最终在其控制中发挥调节作用。重要地，调动信号向细菌清除的活性免疫需要调节信号(即IL-10)(其部分地由炎性信号诱导)控制的最佳细胞协同控制。

第二，为了达到瞬时调节性免疫，必须谨慎选择和使用工具，包括细菌种类。在此方面，广泛使用的减少炎症的益生菌微生物，嗜酸乳杆菌NCFM的LTA缺失衍生物的遗传构建在我们的方法中可作为工具。由于该细菌不含有新的基因或DNA序列，且不在肠道永久寄居，其可用作经口接种时诱导调节性免疫反应的理想媒介物。这暗示一旦下调炎症的目标实现，可停止任何益生菌补充剂以重新建立“正常的”肠道免疫。最后，这些研究确定了在疾病例如感染中不忽略有效免疫活化所需的协同刺激信号的情况下，嗜酸乳杆菌LTA缺失如何启动先天细胞的调节机制。

总体而言，当深入了解细胞相互作用并确定最终导致自身免疫、炎症或抗炎反应的关键分子时，靶向的预防性或治疗性策略将是有效的。

方法

试剂。吡罗昔康和舒林酸获自Sigma (St. Louis, MO)。葡聚糖硫酸钠 (DSS)获自MP Biochemicals (Solon, OH)。NS-398获自Cayman化学公司(Ann Arbor, MI)。CD4、CD25、FoxP3、CD3、CD11c、CD11b、CD40、CD80、CD86、IL-10和小鼠GM-CSF的单克隆抗体购自Invitrogen (Carlsbad, California)和eBioscience (San Diego, CA)。

细菌菌株。嗜酸乳杆菌NCK56和NCK2025以1%接种并在de Man, Rogosa和Sharpe肉汤(MRS, Difco)中37℃繁殖15 h。随后，将1 ml的各培养物转移至50 ml新MRS中，37℃孵育18小时。嗜酸乳杆菌菌株的集落形成单位(CFU)数目通过在600 nm处测量光密度确定(Greene JD & Klaenhammer TR (1994) Appl Environ Microbiol 60(12):4487-4494)。离心收集细胞，用无菌PBS洗两次，以5x10⁸ CFU/ml包含20%甘油的PBS重悬，随后-80储存直至用于体外刺激未成熟DC(1:1)。对于经口接种小鼠，生长48小时的细菌用无菌PBS洗两次，以5x10⁹/ml PBS重悬，并用于小鼠经口接种(5x10⁸cfu/100 µl PBS/小鼠)。

小鼠。6-8周龄C57BL/6和IL-10^-/- (C57BL/6背景)小鼠购自Jackson 实验室(Bar Harbor, ME)，和Germantown, NY。小鼠在西北大学动物护理所微隔离笼中在无特定病原、无螺杆菌条件下饲养。我们未观察到IL-10^-/-小鼠结肠中的任何自发炎症征兆。实验根据实验动物护理和使用指南中的NIH指导方针(NIH-72-23)在可信任机构进行，并且动物实验方案经地方伦理委员会批准。

靶向磷酸甘油转移酶。使用标准整合和切除方法、工具和菌株构建磷酸甘油转移酶(LBA0447)缺失的嗜酸乳杆菌NCK56的突变体菌株(Pfeiler EA & Klaenhammer TR (2009) Appl Environ Microbiol 75(18):6013-6016, Russell WM & Klaenhammer TR (2001) Appl Environ Microbiol 67(9):4361-4364)。构建pORI28缺失载体，其包含两个靶向片段，在LBA0447两侧的Del1_SphI和Del2_BglII。双交换整合和切除事件后，NCK2025恢复为基因组中LBA0447含有1,984 bp的缺失。NCK2025中LBA0447区域内的PCR扩增和DNA测序证实了~2 kbp的丢失，并显示缺失周围的基因无另外的突变。

LTA 生化分析。嗜酸乳杆菌NCK56 (5x10⁸/cfu/10 ml)和NCK2025 (5x10⁸/cfu/10 ml)从冷冻的原种(-80℃)在不含ERM的deMan、Rogosa和Sharpe肉汤(MRS, Difco, Lawrence, KS)中37℃繁殖。随后，如前所述分析NCK56和NCK2025中的LTA表达(Morath S, Geyer A, & Hartung T (2001) J Exp Med 193(3):393-397)。简单来说，将两菌株NCK56和NCK2025的冷冻提取物溶解在pH4.7的柠檬酸盐缓冲液(0.5 M)，随后聚合(syndication)15分钟。将细菌裂解液(30 ml)与等体积正丁醇混合，室温搅拌20分钟。随后，离心(17,200 x g) 40分钟，收集水相，然后加入新鲜柠檬酸盐缓冲液进行第二次萃取。进行两次再萃取，将三次的水相合并并冻干。用色谱起始缓冲液(35 ml，15%正丙醇/0.1 M醋酸铵，pH 4.7)重悬样品后，将所有样品离心(26,900 x g，1 h)并过滤(0.2 µm)。将来自两种细菌菌株的冻干物质溶解在0.7%三氟乙酸中，HPLC分析0.45 mg各菌株提取物。色谱通过连续监测260 nm的吸光度获得。

细胞培养。从周围组织中除去小鼠股骨并机械纯化，骨髓用冷PBS冲洗。细胞用Tris缓冲的氯化铵处理以溶解红细胞。随后，通过抗CD19、CD3、MHC II和Gr-1的特异性抗体阳性(positively)除去B细胞、T细胞、IA⁺细胞和Gr-1⁺粒细胞(PharMingen, San Diego, CA)。剩余的细胞为I-A^–，并在加上10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640完全培养基(只含GM-GSF (25 ng/ml))的6孔板中培养6天。每隔一天用含GM-CSF的新鲜培养基饲养培养物。第六天收集细胞用于不同实验。为研究T细胞活化和增殖，连续四天给予C57BL/6小鼠NCK56或NCK2025 (以5x10⁸ CFU/100 µl/小鼠)。一周后，处死小鼠以分离各组小鼠的肠系膜LN。通过负磁珠损耗(negative magnetic bead depletion)富集肠系膜T细胞。为了测定T细胞活化和增殖，将梯度剂量的NCK56或NCK2025处理和未处理的DC(10⁴/96孔板孔)与分离的肠系膜LN CD4⁺ T细胞(10⁵/孔)在不含血清的培养基中培养5天。然后，96孔板各孔收集25 µl并冷冻用于细胞因子分析。然后在最后16 h内每孔用0.5 µCi [³H]胸苷给予细胞脉冲(New England Nuclear) (Pulendran B, 等 (2004) Eur J Immunol 34(1):66-73)。在一些实施方案中，在DC:T细胞共培养物中分别使用抗IL-10抗体(终浓度100 ng/ml)。

DSS 诱导的结肠炎。对于接种/预防研究，给几组C57BL/6小鼠(10小鼠/组)连续四天经口接种NCK56或NCK2025(5x10⁸ cfu/100 µl PBS/小鼠)。这些组的小鼠和对照小鼠接受6天一周期的饮用水中的3% DSS，随后接受1天的常规饮用水，然后在第8天处死。未接种组中第一个DSS周期后观察到急性结肠炎。研究期间监测疾病进展，包括体重减轻、腹泻和粪便潜血检测血液阳性(FOB)。其后，处死小鼠，将结肠横断面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蜡。组织切片(4 µm)用苏木精和伊红(H&E)染色，如前所述无分别地(blindly)评分(Cooper HS, 等 (1993) Lab Invest 69(2):238-249, Murthy SN, 等 (1993) Dig Dis Sci 38(9):1722-1734)。基于0-28范围的分级考虑炎性浸润的程度、糜烂的存在情况、溃疡形成或坏死，以及损伤的深度和表面延伸。对于治疗研究，3组C57BL/6小鼠(10/组)首先接受5天周期的3% DSS以引发结肠炎，其中2组随后连续四天通过口腔管饲法用NCK56或NCK2025(5x10⁸ cfu/100 µl PBS/小鼠)治疗。监测疾病进展直至实验方案的第13天，此时小鼠被处死，并如上评估结肠。

结肠组织培养。结肠组织培养如前文所述进行(Sellon RK, 等 (1998) Infect Immun 66(11):5224-5231)。简单来说，3%DSS施用前或后用嗜酸乳杆菌菌株处理的各小鼠组的结肠组织用冷PBS彻底清洗。将组织切成1 cm小块并在包含庆大霉素(50 µg/ml)的完全RPMI 1640中280 rpm振摇30分钟。结肠组织在添加5%胎牛血清(FCS)、50 µg/ml 庆大霉素和1%青霉素/链霉素/两性霉素B的RPMI 1640培养基中37℃培养18小时。然后收集上清液，-80℃保存直至用于细胞因子分析。

IL-10-/- 结肠炎。几组C57BL/6 IL-10^-/- (10/组)从不含病原体的房间转移至常规房间，并允许适应1周。随后小鼠连续四天接种NCK56或NCK2025 (5x10⁸ cfu/100 µl PBS/小鼠)，然后喂食低剂量吡罗昔康1周，随后喂食高剂量吡罗昔康1周，以加速和同步化结肠炎的发病，如前所述(Berg DJ, 等 (2002) Gastroenterology 123(5):1527-1542)。2周的标准食物后(第28天)，处死小鼠，将结肠横断面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蜡。组织切片(4 µm)用H&E染色，在0-4的范围内无分别评分，如前所述(Berg DJ, 等 (2002) Gastroenterology 123(5):1527-1542)。

流式细胞术。嗜酸乳杆菌处理和未处理的DC(5x10⁵)用表面标记单克隆抗体在4℃孵育30分钟，用加0.1%FCS的PBS充分洗涤，用0.1%多聚甲醛固定，通过FACSCalibur四激光细胞计量术使用标准CELLQUEST获取分析软件(Becton Dickinson)进行分析。每个条件至少获得10⁴ 个门控事件。在一些实验中，为了取得结肠淋巴细胞，几组小鼠(5 小鼠/组)连续4天接种NCK56或NCK2025 (5x10⁸ cfu/100 µl无菌PBS/小鼠)。将小鼠处死，清洗结肠，如前所述从固有层分离单细胞(Haddad W, 等 (2003) J Exp Med 198(3):369-377)。淋巴细胞使用Percol富集，并用抗CD4 FITC, CD25 APC抗体和7AAD染色。随后，将染色的细胞固定、透化、用抗FoxP3 PE或同种型抗体染色，并通过FACSCalibur分析。

实时 PCR 。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, MD)从骨髓DC分离总RNA。使用大容量cDNA反转录试剂盒从5ug RNA合成cDNA，通过实时半定量PCR使用ABI 7500实时PCR系统和Power Syber green 2X PCR master混合物(Applied Biosystems, Foster City, CA)测定TLR1和TLR2基因的表达。对于跨越内含子结点的区域选择TLR1的引物(正向-

；反向-)和TLR2的引物(正向-

；反向-

)以排除基因组DNA的扩增。使用ddCT方法用Gapdh作为内源对照(正向-

；反向-

)，结果反映相对于对照样品的倍数增加。

低密度 cDNA 微阵列。DSS单独、NCK56-DSS或NCK2025-DSS处理的各组小鼠(5x/组)的结肠远端和近端区域用PBS冲洗，并立即浸入RNALater (Qiagen, MD)中稳定RNA。用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, MD)提取RNA，使用Agilent Nanochip生物分析 (Agilent, Santa Clara, CA)评估其质量。所有使用的样品具有大于7的RNA完整数(RIN)。如制造商(Eppendorf DualChip microarray, Germany)所述实施反转录和微阵列的杂交。简单来说，如下将6ug RNA进行反转录：通过将样品首先用Oligo(dT)_12-18引物(Invitrogen)在70℃孵育10分钟然后加入RT混合物(Superscript III)、dNTP (Invitrogen)、生物素标记的ATP和CTP并在42℃孵育90分钟接着70℃15分钟。加入RNase H，样品在37℃孵育20分钟，接着95℃3分钟以终止反应。将所得cDNA加入杂交室，在Eppendorf thermomixer中在60℃混合以1400rpm孵育过夜。清洗载玻片，如制造商(Eppendorf, Germany)所述使用Silverquant检测系统通过检测生物素掺入测定RNA水平。通过比较样品与来自相同结肠区域的对照使用Silverquant分析软件(Eppendorf, Germany)进行分析。

说明书中提到的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请通过引用通过引用结合到本文中，并且在某种程度上如同各个出版物或专利申请明确且单独地指出通过引用结合。

虽然已通过说明和用于清楚理解目的的实施例的方式描述了前述发明的一些细节，但将显而易见的是，某些变更和修饰可在所附权利要求书的范围内实施。

Claims (51)

1.重组或分离的细菌，其已经被遗传修饰以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。

2.权利要求1的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。

3.权利要求1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO:1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

4.权利要求1或2的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。

5.前述权利要求中任一项的重组或分离的细菌，其中所述重组或分离的细菌为益生菌细菌。

6.权利要求5的重组或分离的细菌，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。

7.权利要求6的重组或分离的细菌，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。

8.权利要求7的重组细菌，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。

9.权利要求8的重组或分离的细菌，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。

10.权利要求8的重组或分离的细菌，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。

11.制备重组或分离的细菌的方法，所述方法包括遗传修饰细菌以减少所述细菌表面上脂磷壁酸(LTA)的展示。

12.权利要求11的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被修饰以降低磷酸甘油转移酶的表达。

13.权利要求11或12的方法，其中所述重组或分离的细菌已经被遗传修饰以降低包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表达。

14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述重组细菌为益生菌细菌。

15.权利要求14的方法，其中所述益生菌细菌为乳酸细菌。

16.权利要求15的方法，其中所述乳酸细菌为乳杆菌。

17.权利要求16的方法，其中所述乳杆菌为嗜酸乳杆菌。

18.权利要求17的方法，其中所述遗传修饰对嗜酸乳杆菌NCFM实施。

19.权利要求17的方法，其中所述嗜酸乳杆菌为以ATCC登记号PTA-11587保藏的嗜酸乳杆菌NCK2025。

20.权利要求17-19中任一项的方法，其中所述嗜酸乳杆菌已经被修饰以降低包含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的多核苷酸表达。

21.减少受试者炎症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌。

22.治疗或预防受试者胃肠道炎性病症的方法，包括给予受试者治疗有效量的权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌。

23.权利要求21或22中任一项的方法，其中所述受试者为动物。

24.权利要求23的方法，其中所述受试者为哺乳动物。

25.权利要求24的方法，其中所述受试者为人。

26.权利要求23的方法，其中所述受试者为驯养动物。

27.权利要求23的方法，其中所述受试者为农用动物。

28.权利要求21-27中任一项的方法，其中所述受试者患有胃肠病症。

29.权利要求28的方法，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

30.权利要求21-29中任一项的方法，其中所述细菌增加所述受试者中一种或多种抗炎细胞因子的产生。

31.权利要求30的方法，其中所述抗炎细胞因子为IL-10。

32.权利要求21-31中任一项的方法，其中所述细菌降低所述受试者中一种或多种促炎细胞因子的产生。

33.权利要求32的方法，其中所述促炎细胞因子选自IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα及其任何组合。

34.权利要求21-33中任一项的方法，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

35.包含权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌的药物组合物。

36.权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌，其用作药物。

37.权利要求1-10中任一项的重组或分离的细菌，其用于治疗或预防受试者例如权利要求23-27中任一项的受试者的胃肠道炎性病症。

38.权利要求36或37的重组或分离的细菌，其中所述细菌导致所述受试者中抗炎细胞因子产生的增加。

39.权利要求38的重组或分离的细菌，其中所述抗炎细胞因子为IL-10。

40.权利要求36-39中任一项的重组或分离的细菌，其中所述细菌降低所述受试者中一种或多种促炎细胞因子的产生。

41.权利要求40的重组或分离的细菌，其中所述促炎细胞因子选自IL-12、IL-6、IFNγ、TNFα及其任何组合。

42.权利要求36-41中任一项的重组或分离的细菌，其中将所述细菌配制为以治疗有效量给予受试者，其中所述细菌的治疗有效量为约10⁸ - 10¹² CFU/天。

43.权利要求36-42中任一项的重组或分离的细菌，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

44.权利要求1-10中任一项的细菌在制造药物中的用途。

45.44中的细菌在制造用于治疗或预防受试者例如权利要求23-27中任一项的受试者的胃肠道病症的药物中的用途。

46.权利要求44或45的细菌在制造用于治疗炎性病症的药物中的用途。

47.权利要求46的细菌的用途，其中所述病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

48.权利要求1-10中任一项的细菌作为药物的用途。

49.权利要求48的细菌的用途，其中所述药物用于治疗或预防受试者例如权利要求23-27中任一项的受试者的胃肠道病症。

50.权利要求48或49的细菌的用途，其中所述病症为炎性病症。

51.权利要求50的细菌的用途，其中所述胃肠病症选自炎性肠病、克罗恩病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、肥胖症、腹泻、胃气胀、肠胃气胀、腹部绞痛、腹痛、便秘及其任何组合。

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