CN103184170B - 一种新型乳酸杆菌ly-73及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的乳酸杆菌LY-73(Lactobacillus？shenzhenensis？sp.nov.)，是一种分离的全新的乳酸杆菌菌株，其保藏号为：CCTCC？M2011481。该菌株具有高产EPS的特性，可应用于微生态制剂、食品、医药制备、保健品等多个领域。

Description

一种新型乳酸杆菌LY-73及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及乳酸杆菌的新的菌种以及该菌种的应用。

背景技术

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。乳酸菌在自然界中分布很广，在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中，均可分离得到。由于乳酸菌生长而使环境偏酸，从而抑制腐败性菌的生长。中国传统的食品制作保藏技术，如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等就是利用乳酸菌的这一作用。乳酸菌也有助于改善某些肠道菌群紊乱，如酸乳可医治畜、禽的腹泻，对人的肠炎和赤痢也有疗效，有的乳酸菌也可用于生物测定。

乳酸菌是一群相当庞杂的细菌，按伯杰氏系统细菌学手册中的生化及形态分类法，乳酸菌可分为18个属，共有200多种，其中乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和乳酸乳球菌属等属的菌株产胞外多糖(ExopolySaccharides，EPS)的报道比较多。乳酸菌胞外多糖(EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，其分子量一般在4.0×10⁴到6.0×10⁶之间。前述的多个属的乳酸菌能分泌该多糖于细胞外，形成荚膜多糖黏附于细胞表面，或以粘质多糖形式存在于细胞周边培养基中，其形成有利于改善产品的黏度和质地，有的胞外多糖还具有降血脂、免疫调节和抗肿瘤等功能。

大多数产EPS乳酸杆菌菌株是从发酵及乳制品、发酵肉制品以及发酵蔬菜中分离获得的。目前报道的产胞外多糖的主要的乳酸杆菌菌株有：德氏保加利亚杆菌、瑞士乳杆菌等。一般来说，乳酸杆菌EPS的产量都不高。随着人们对乳酸菌EPS的生理活性逐渐认识和接受，开展的相关性研究也日益增多。但产量低、成本高、菌株稳定性差仍是制约其大规模生产的主要因素，因此获得高产EPS乳酸杆菌菌株则成了当务之急。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产EPS的乳酸杆菌菌株及其在微生态制剂、医药制备、食品等各领域中的应用。

本发明的另一目的是提供含有上述菌株的微生物制剂、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种乳酸杆菌LY-73，该菌株命名为：Lactobacillusshenzhenensissp.nov.，已于2011年12月23日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，其保藏号为CCTCCM2011481。

本发明公开了所述乳酸杆菌LY-73和/或该菌株的代谢产物在微生态制剂领域方面的应用。

本发明公开了一种微生态制剂，所述微生态制剂含有上述的乳酸杆菌LY-73。

本发明还公开了所述乳酸杆菌LY-73和/或该菌株的代谢产物在医药制备领域方面的应用。

具体的，在制备用于治疗或辅助治疗免疫疾病的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于治疗或辅助治疗癌症的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于治疗或辅助治疗肠道疾病的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于调节肠道菌群的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于辅助降血压的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于抗氧化的药物或试剂中的应用。

具体的，在制备用于治疗或辅助治疗血脂相关疾病的药物或试剂中的应用。

本发明公开了一种药物组合物，所述药物组合物含有有效成分的上述乳酸杆菌LY-73。

本发明公开了一种药物组合物，所述药物组合物含有有效成分的上述乳酸杆菌LY-73的代谢产物。

所述代谢产物包括乳酸菌胞外多糖(乳酸菌EPS)。

本发明还公开了所述乳酸杆菌LY-73和/或该菌株的代谢产物在食品领域方面的应用。

本发明公开了一种食品，所述食品含有上述的乳酸杆菌LY-73。

所述食品可为饮料。

所述饮料可为酸牛奶或含乳饮料。

本发明公开了一种食品，所述食品含有上述的乳酸杆菌LY-73的代谢产物。

本发明公开了一种食品添加剂，所述食品添加剂包含上述的乳酸杆菌LY-73。

本发明公开了一种食品添加剂，所述食品添加剂包含上述的乳酸杆菌LY-73的代谢产物。

所述代谢产物包括乳酸菌胞外多糖(乳酸菌EPS)。

本发明还公开了所述乳酸杆菌LY-73和/或该菌株的代谢产物在保健品领域方面的应用。

本发明公开了一种保健品，所述保健品包含上述的乳酸杆菌LY-73。

本发明公开了一种保健品，所述保健品包含上述的乳酸杆菌LY-73的代谢产物。

所述代谢产物包括乳酸菌胞外多糖(乳酸菌EPS)。

本发明的乳酸杆菌LY-73，是一种分离的全新的菌株，该菌株具有高产EPS的特性，且具有优良的发酵性能，该新菌株可应用于微生态制剂、医药制备、食品、保健品等多个领域。

保藏信息：

菌株名称：Lactobacillusshenzhenensissp.nov.LY-73

保藏日期：2011年12月23日

保藏单位：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)

保藏编号：CCTCCNO：M2011481

具体实施方式

本发明的乳酸杆菌LY-73，是一种分离的全新的菌株，采用16SrDNA通用引物扩增此菌的16SrDNA，其测序结果和EzTaxon比对结果为：和Lactobacillusharbinensissp.(从传统发酵的酸菜中发现的新型乳酸菌Lactobacillusharbinensissp.nov)的相似度为97.6％。结合实验说明该菌株为一个新种，命名为Lactobacillusshenzhenensissp.nov.。

本发明通过相关生物活性实验表明，乳酸杆菌LY-73是一种高产EPS菌株，其产生EPS的量为299mg/L，适用于应用于微生态制剂、食品等多个领域。

微生态制剂(Porbioties)，也叫活菌制剂(Bigone)或生菌剂，是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂。目前微生态制剂已被应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域中。

本发明提供的乳酸杆菌LY-73可用于制备相关利用乳酸杆菌及其代谢产物EPS发挥作用的微生态制剂，具有良好的应用前景。比如，本发明提供的乳酸杆菌LY-73可用作兽用微生态制剂，用于防治畜、禽、鱼的消化道、泌尿道疾病及用于猪、牛、鸡、兔等禽畜的育肥、抗病，可替代抗生素，减少有毒物质在体内的残留量。例如，可在饲料中添加适量的乳酸杆菌LY-73。也可作为生物制品类微生态制剂用于医药方面。

乳酸菌EPS是乳酸杆菌的一种代谢产物，其对形成各种酸乳的质构和特有的营养保健发挥着极其重要甚至是不可替代的作用，它可以增加酸奶的粘度、稳定性和保水性，使产品具有良好的口感、质地和风味。因此，本发明提供的乳酸杆菌LY-73在食品及其加工中也有很好的应用，例如可将本发明中的乳酸杆菌LY-73应用于乳制品及其制备中，可得到口感营养俱佳的酸奶等。

相关研究进一步表明乳酸菌EPS可以改善菌株对肠道黏膜的非特异性粘附，增强菌株对肠道的定殖作用；抗肿瘤作用；调节免疫系统作用；对细胞体具有保护作用；抑制肠道腐败菌的繁殖，防治结肠癌的作用。因此，本发明提供的乳酸杆菌LY-73可应用于肠道疾病、癌症、免疫系统等方面的药物制备。例如可将本发明乳酸杆菌LY-73作为有效组分以医药有效剂量加入到药物组合物或试剂中，也可将本发明乳酸杆菌LY-73的代谢产物(例如乳酸菌EPS)作为有效组分以医药有效剂量加入到药物组合物或试剂中。

本发明提供的乳酸杆菌LY-73还可根据其特点应用于食品添加剂、保健品等领域中，例如将本发明的乳酸杆菌LY-73制成乳酸杆菌干粉，即可作为食品添加剂或保健药中的有效成分，发挥乳酸杆菌及其乳酸菌EPS的多种作用和效果。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1乳酸杆菌LY-73的筛选鉴定

1、采用MRS培养基筛选

称取5克益生菌饮料，分别加到含有45克已灭菌的MRS培养基里梯度稀释，然后选择10^-5的稀释度的饮料100微升涂平板(MRS固体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，K₂HPO₄2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，MgSO₄·7H₂O0.5g，MnSO₄·4H₂O0.25g，PH6.2～6.4，115℃灭菌15min，将平板倒置在37度培养箱中培养。48h后从平板上挑取单菌落，平板划线分纯后待16SrDNA鉴定。

2、16SrDNA分子鉴定：

以菌落为模板，16SrDNA通用引物8F1492扩增此菌的16SrDNA，连接到T载体上克隆测序。测序长度为1.52kb，测序结果和EzTaxon比对结果为：和Lactobacillusharbinensissp.(从传统发酵的酸菜中发现的新型乳酸菌Lactobacillusharbinensissp.nov)的相似度为97.73％。

3、微生物学特性：

1)形态学与生理学特性

乳酸杆菌LY-73为革兰氏阳性菌，无芽孢、过氧化氢酶阴性，兼性厌氧菌，杆状，直径0.6-0.8μma长度3.5-4.0μm，单个或成对或成链、。无鞭毛、菌落灰白色、光滑、菌落直径1.0mm，温度生长范围为10℃-50℃，最适生长温度37℃，PH值生长范围4.0-9.0。能在6％氯化钠溶液中生长。

2)API测定结果：

碳源	英文	LY-30B	LY-73	Lac.h	Lac.p	Lac.s	Lac.d
								0	CK	-	-	-	-	-	-
GLY	glycerol	+-	+-	+-	-	-	-
								ERY	erythritol	+-	+-	+-	-	-	-
DARA	D-arabinose	+	+	+-	-	-	-

LARA

L-arabinose

+

+

+

-

-

-

RIB

D-ribose

+-

+-

+-

-

-

-

DXYL

D-xylose

-

-

-

-

-

-

LXYL

L-xylose

-

-

-

-

-

-

ADO

D-adonitol

-

-

-

-

-

-

MDX

methyl-β-D-xylopyranoside

-

-

-

-

-

-

GAL

D-Galactose

+

+

+

+

+-

-

GLU

D-glucose

+

+

+

+

+

+

FRU

D-fructose

+

+

+

+

+

+-

MNE

D-mannose

+

+

+

+

+

+-

SBE

L-sorbose

+-

+-

+-

-

+-

-

RHA

L-rhamnose

+

+

-

-

-

-

DUL

dulcitol

+-

+-

-

-

-

-

INO

inositol

-

-

-

-

-

-

MAN

D-mannitol

-

-

-

-

-

-

SOR

D-sorbitol

-

-

-

-

-

-

MDM

methyl-α-D-mannopyranoside

+-

+-

+-

+-

-

-

MDG

Methyl-D-glucopyranoside

+-

+-

+

+

-

-

NAG

N-acetyl-glucosamine

+

+

+

+

+

-

AMY

Amygdalin

+

+

+

+

-

-

ARB

Arbutin

+

+

+

+

-

-

ESC

Esculine

+

+

+

+

+-

+-

SAL

Salicin

+

+

+

+

+

-

CEL

cellobiose

+

+

+

+

-

-

MAL

D-Maltose

+

+

+

+

+

-

LAC

D-Lactose

+-

+-

+-

+-

-

-

MEL

D-melibiose

+

+

+

-

-

-

SAC

D-Sucrose

+

+

+

+-

-

+-

TRE

D-Trehalose

+

+

+

-

-

-

INU

inulin

+-

+-

+

-

-

-

MLZ

D-melezitose

+-

+-

+

+

-

-

RAF

D-raffinose

+

+

+

+-

-

-

AMD

starch

+-

+-

+-

-

-

-

GLYG

glycogen

-

-

-

-

-

-

XLT

xylitol

-

-

-

-

-

-

GEN

Gentiobiose

+-

+-

+

+-

-

-

TUR

D-turanose

-

-

+-

-

-

-

LYX

D-lyxose

-

-

-

-

-

-

TAG

D-Tagatose

+-

+-

+-

+

-

-

DFUC

D-fucose

-

-

-

-

-

-

LFUC

L-fucose

-

-

-

-

-

-

DARL

D-arabitol

-

-

-

-

-

-

LARL

L-arabitol

-

-

-

-

-

-

GNT

gluconate

-

-

+-

+-

-

-

2KG

2-ketogluconate

+-

+-

+-

-

-

-

5KG

5-ketogluconate

-

-

-

-

-

-

以上表格数据显示，本发明中LY-73与同源相似度高的其他菌株比较，该菌株的碳源利用存在差异。

3)DNA杂交结果

根据DNA杂交结果显示，LY-73同16srDNA相似度最高的模式菌株L.harbinensisKACC12409T的杂交同源值是25.85％。

结合以上形态学和生理学、API测定结果等说明该菌株LY-73是一个新种，本发明中将该菌株命名为Lactobacillusshenzhenensissp.nov。

实施例2乳酸杆菌LY-73的生物活性

1、产胞外多糖(EPS)

胞外多糖的提取和合成量测定：

(1)乳酸菌胞外多糖的分离：取50mI分离的乳酸菌纯菌株LY-73发酵乳样品，发酵条件为：MRS培养基、37℃培养2天。用70ml80％的三氯乙酸处理发酵后的乳样品，4℃过夜沉淀蛋白，16000r/min，离心30min除去蛋白和菌体，上清液加入3倍无水乙醇，4℃过夜后16000r/min，离心30min，弃去上清，沉淀用温水溶解，转移到透析袋内4℃透析，直到透析液离子强度不变。

(2)乳酸菌胞外多糖合成量的测定：采用硫酸苯酚法测定乳酸菌胞外多糖的产量，以葡萄糖量计算。

①葡萄糖标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准样品35.4mg加去离子水溶解并转移入250ml容量瓶摇匀定容至刻度。精确吸取溶液5.0，8.0，11.0，14.0，17.0ml于50ml容量瓶中，以去离子水稀释摇匀、定容即得标准溶液。分别精确吸取上述标准溶液2.0ml于具塞试管中，加6％苯酚1.0ml摇匀，迅速加入浓硫酸5.0ml，摇匀放置5min，沸水浴15min后取出冷却至室温。于490nm波长下测定吸光度，以去离子水加苯酚和浓硫酸试剂同上操作为空白对照。

②胞外多糖合成量的测定：样品经分离得粗多糖后于50ml容量瓶定容，取2.0ml于具塞试管中，加6％苯酚1.0ml摇匀，迅速加入浓硫酸5.0ml，同标准曲线的操作，测定吸光度后查标准曲线得多糖的浓度，再乘以稀释倍数，即得多糖的合成量。

用上述方法测定该菌株LY-73产生EPS的量为299mg/L。

实施例3乳酸杆菌LY-73在微生物制剂中的应用

在育肥饲料中加入乳酸杆菌LY-73，使其含菌量不少于10⁷个/g饲料，每日施加0.1～3g，一般添加量为0.02％～0.2％。

实施例4乳酸杆菌LY-73在食品中的应用(制作酸奶)

1.玻璃瓶等消毒灭菌。玻璃瓶在灭菌器内灭菌半小时，如用蒸锅灭菌需45分钟，接种室内需紫外线灭菌50分钟，接种工具在高压蒸汽灭菌器内灭菌30分钟。

2.牛奶灭菌。把鲜牛奶装入加热罐，并加入10-12％的白糖，在85-90℃下灭菌30分钟或用其它方法灭菌。

3.接种。把温度低于43℃的灭菌牛奶分装于灭好菌的玻璃瓶中，按牛奶2％-4％的接种量在接种室内接种乳酸杆菌LY-73并搅拌均匀，注意罐装要满，不留空隙，接好后立即封口，以保证乳酸发酵的厌氧条件。然后再送入0-5℃的冷藏室内进行冷藏后熟8-10小时，即可。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种乳酸杆菌LY-73(Lactobacillusshenzhenensissp.nov.)，其保藏号为CCTCCNO：M2011481。

2.权利要求1所述乳酸杆菌LY-73在微生态制剂、医药、食品、保健品制备方面的应用。

3.一种微生态制剂，其特征在于：所述微生态制剂包含保藏号为CCTCCNO：M2011481的乳酸杆菌LY-73。

4.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有保藏号为CCTCCNO：M2011481的乳酸杆菌LY-73。

5.一种食品，其特征在于：所述食品含有保藏号为CCTCCNO：M2011481的乳酸杆菌LY-73。

6.根据权利要求5的食品，其特征在于：所述食品为饮料。

7.一种食品添加剂，其特征在于：所述食品添加剂包含保藏号为CCTCCNO：M2011481的乳酸杆菌LY-73。

8.一种保健品，其特征在于：所述保健品包含保藏号为CCTCCNO：M2011481的乳酸杆菌LY-73。