CN103173525A - Dscc1基因的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种DSCC1基因的用途,用于制备诊断肝癌的产品。本发明还公开了一种用于诊断肝癌的试剂盒,该试剂盒包含特异性针对DSCCl基因的引物或探针,或包含特异性结合DSCCl蛋白的抗体。本发明的DSCC1基因,可作为诊断肝癌的特异标志基因,使肝癌诊断更加准确、快速。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种DSCC1基因的用途。
背景技术
细胞周期是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程,包括间期和分裂期。DNA复制和修复是细胞有丝分裂间期的重要过程之一,包括引发、延伸、终止三个阶段。在延伸过程中,DNA复制因子C复合物(Ctf18-RFC)帮助增殖细胞核抗原PCNA或箍复合物Rad9-Hus1-Rad1(9-1-1)与DNA目的区段结合,从而发挥包括染色体凝聚、DNA损伤修复、基因组稳定性维持等DNA复制相关方面的作用。DSCC1基因(又名DCC1,NM_024094)编码45KD蛋白,其酵母同源物主要调控复制过程中姐妹染色单体凝聚。作为Ctf18-RFC的辅助因子,DSCC1和Ctf8与其形成异源五聚体装载核心复合物,帮助PCNA与DNA结合,并激活DNA聚合酶polδ,从而维持正常的细胞周期。
细胞周期调控、DNA损伤修复、基因组不稳定性均可认为是癌变发生的早期阶段,提示DSCC1可能与肿瘤发生相关。目前DSCC1在肿瘤中的表达变化情况、其在肿瘤发生发展中的作用和关联性均未见文献报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种DSCC1基因的用途,DSCC1基因可作为诊断肝癌的分子标志物。
为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面,提供了一种DSCC1基因的用途,用于制备诊断肝癌的产品。
优选的,所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增DSCC1基因的引物。
所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括:与DSCC1基因的核酸序列杂交的探针。
所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括:与DSCC1蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的另一方面,还提供了一种用于诊断肝癌的试剂盒,所述试剂盒包含特异性针对DSCC1基因的引物或探针,或包含特异性结合DSCC1蛋白的抗体。
利用本发明的试剂盒,可以检测病人DSCC1基因的表达情况,从而诊断病人是否患有肝癌。
在本发明中,术语“引物”是指一种寡核苷酸,可以是天然的也可以是合成的,它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点,在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物,即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下,在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途,但一般在15~25个核苷酸之间。
在本发明中,所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。
在本发明中,可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对DSCC1蛋白特异的抗体。例如,将提纯的人DSCC1基因产物或它的抗原片段或人工合成的含有与DSCC1蛋白有连续5个相同的氨基酸的多肽片段注射入动物体内以产生多抗体。同样,表达人DSCC1蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体也可以是单克隆抗体,这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。
经实验证明,本发明DSCC1基因在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,因此DSCC1基因可作为诊断肝癌的特异标志基因,使肝癌诊断更加准确、快速。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的DSCC1基因在人肝癌组织和癌旁组织中差异表达的半定量RT-PCR结果图。
具体实施方式
下列实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编,马学军,舒跃龙的译.北京:科学出版社,2004)中所述的方法进行。
实施例1用半定量RT-PCR方法检测肝癌样本中DSCC1基因的表达变化
半定量反转录-聚合酶链反应(SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术,较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。
运用半定量RT-PCR方法,检测20对肝癌样本中DSCC1基因的表达变化,发现其在肝癌组织中呈明显的上调表达趋势。具体实验步骤如下:
1.组织分离
实验用组织来源于HBV阳性并表达甲胎蛋白的原发性肝癌的手术病人(RT-PCR证实AFP在肝癌均为阳性而癌旁为阴性)。手术切除的肝脏一经离体,迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织,放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据。
2.RNA抽提
采用TAKARA公司的Trizol(D9108)对20对肝癌样本(癌和癌旁)组织进行抽提,并用安捷伦2100对产物的纯度和浓度进行检测。具体操作是:
将碾杵和匀浆器等器皿在200℃干烤4h,去除RNA酶,冷却;加入液氮中预冷,将组织从液氮中迅速取出,碾成粉末;用刮匙将组织放入预先加入TRIzol试剂的匀浆器中,匀浆数分钟;将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中,加入氯仿后,4℃离心分层;将上层水相转入一无RNA酶的离心管中,加入氯仿后,4℃离心分层;将上层水相转入一无RNA酶的离心管中,加异丙醇,4℃离心沉淀RNA;用75%乙醇洗涤沉淀2次;用无RNA酶的去离子水溶解沉淀。抽提的RNA进行质量鉴定(用安捷伦2100测定RNA浓度、纯度和完整性),结果见下表1。质量鉴定好的RNA存放在-80℃冰箱待用。
表1 20对肝癌样本的RNA抽提质量检测结果
3.反转录
采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047),对1μgRNA进行反转,该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤,可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。
操作方法:
(1)基因组DNA的去除反应
试剂 | 使用量 |
5×gDNA Eraser缓冲液 | 2μl |
gDNA Eraser | 1μl |
总RNA | 1μg |
RNase Free dH2O | 补至10μl |
42℃2min,4℃放置。
(2)反转录反应
反应体系配制均在冰上进行,具体体系如下:
试剂 | 使用量 |
5×PrimeScript缓冲液2 | 4μl |
PrimeScript RT酶混合物I | 1μl |
RT引物混合物 | 1μg |
去除基因组DNA的RNA反应液 | 10μl |
RNase Free dH2O | 补至20μl |
37℃15min,85℃5sec,4℃放置。
4.PCR反应
模板:上述反转录产物按1∶10比例稀释后作为PCR反应的模板。
引物如下:
PCR反应的体系:
PCR反应采用TAKARA公司的耐热性Taq DNA聚合酶(DR001),以人基因组为模板时,能很好地扩增3.0kbp(p53基因)的DNA片段。
试剂 | 使用量 |
Takara Taq(5U/μl) | 0.1μl |
10×PCR缓冲液(Mg2+Plus) | 2μl |
dNTP混合物(2.5mM each) | 1.6μl |
引物混合物(5μM each) | 1.6μl |
模板 | 0.5-4μl |
ddH2O | 补至20μl |
PCR反应条件:
目的基因:
5.实验结果显示,DSCC1基因在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中DSCC1基因的表达水平(见图1),差异率达80%,DSCC1特异扩增片断大小为257bp,内参β-actin的产物片断大小为273bp,在图1中,“N”指癌旁组织,“C”指肝癌组织。
6.根据上述实验结果,可通过半定量RT-PCR诊断肝癌:设计DSCC1基因的PCR引物,检测肝癌组织中DSCC1基因的表达量,如果DSCC1基因的表达量显著升高,则说明患肝癌的可能性高,反之则低。
实施例2用基因芯片检测肝癌样本中DSCC1基因的表达变化
使用基因芯片检测肝癌及癌旁组织中基因表达水平的差异,发现DSCC1基因表达差异明显。其中,基因芯片实验主要包括如下四个步骤:芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
1.芯片制备目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体。通过点样法将靶基因作为探针按顺序排列在载体上,靶基因可分为基因组DNA、cDNA(或人工合成DNA)。
2.样品制备待测样品中总RNA的抽提步骤如下:分离肝癌及癌旁组织,再用TRIZol法抽提总RNA。
提取的总RNA可进一步用于样品cDNA探针制备,其过程包括荧光探针的制备(cDNA第一链标记)、纯化和定量。定量后的探针吸回至1.5ml离心管中,加热抽干,保存于-20℃,待杂交。
3.芯片杂交
1)准备工作:(1)洗涤盖玻片,将盖玻片依次放入ddH20、95%乙醇、ddH20,各3min,最后放入干燥的50ml离心管中1000rpm,离心3min,去除残留的水渍,放置待用;(2)配制10%PBS溶液;(3)平衡杂交炉,用水平仪校准杂交炉,保持水平;(4)配制如下洗片液:20×SSC溶液、10%SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5%SDS)、洗液II(1×SSC/0.1%SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。
2)预杂交预杂交液的配制是30μl的总体积中有9μl的20×SSPE缓冲液、3μl的50×Denhandts缓冲液及18μl ddH20,再从干燥箱中取出芯片,将适量的预杂交液滴加于芯片上,盖上盖玻片,然后将芯片放入加有PBS的杂交盒中,置于42℃杂交箱中预杂交约1小时。预杂交完成之后取出芯片用ddH20浸洗片刻,待盖玻片脱落后将芯片放入干燥的离心管中离心,去除残留的水渍,放置待用。
3)杂交取出经定量的Cy3和Cy5标记的探针,各用9~15μl ddH20充分溶解混合于1.5ml离心管内,然后配制杂交液,Cy3/Cy5荧光标记探针的杂交液由20×SSPE缓冲液、50×Denhandts缓冲液和溶解有探针的ddH20组成,接着,取杂交液滴加在芯片上,并盖上盖玻片。最后,将该杂交芯片放入加有PBS的杂交盒,置于42℃杂交箱中杂交12~20小时。
4.洗涤、扫描和数据分析芯片杂交反应结束后,需进行芯片洗涤。再通过特定的扫描仪比如激光共聚焦扫描仪进行扫描,扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号,随后进行数据分析和处理。由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡,需对原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据。经分析,由基因芯片检测肝癌及癌旁组织中DSCC1基因的表达差异,结果显示DSCC1基因在肝癌组织中表达显著上调。
实施例3免疫检测肝癌样本中DSCC1蛋白的表达变化
1.抗原蛋白获得
(1)利用基因工程表达:可从Genbank数据库中获得人DSCC1基因的cDNA序列,通过PCR扩增获得编码框,插入原核生物或真核生物表达载体中,表达DSCC1蛋白,并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白质。
(2)通过培养高表达DSCC1基因的人体来源细胞或组织,再分离纯化DSCC1蛋白。
2.抗体制备
可采用以下几种方法制备抗体:
(1)细胞融合法:用上述制备的DSCC1蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等),获得脾脏细胞,再与骨髓瘤细胞融合,并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
(2)利用噬菌体表面展示库,克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。
(3)利用纯化的蛋白质免疫动物,制备多抗血清。
3.检测
(1)用制备的抗体(多抗或单抗),用组织化学方法进行肝癌的病理检测,阳性信号为肝癌。
(2)取患者血清,用ELISA方法检测,阳性反应为肝癌可疑病人。
(3)将DSCC1抗体作为蛋白质芯片的探针之一,用于肝癌诊断。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>DSCC1基因的用途
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>引物
<400>1
actcggacca ttggagccag agg 23
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>2
tcgagtgtct atccaccagc gc 22
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<222>(1)..(22)
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>引物
<400>4
actgtgttgg cgtacaggtc tt 22
Claims (8)
1.一种DSCC1基因的用途,其特征在于,用于制备诊断肝癌的产品。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述诊断肝癌的产品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片检测、或免疫检测诊断肝癌的产品。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述用半定量RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增DSCC1基因的引物。
4.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述用基因芯片检测诊断肝癌的产品包括:与DSCC1基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括:与DSCC1蛋白特异性结合的抗体。
6.一种用于诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含特异性针对DSCC1基因的引物对。
7.一种用于诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含特异性针对DSCC1基因的探针。
8.一种用于诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含特异性结合DSCC1蛋白的抗体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110436722 CN103173525A (zh) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | Dscc1基因的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201110436722 CN103173525A (zh) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | Dscc1基因的用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103173525A true CN103173525A (zh) | 2013-06-26 |
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ID=48633712
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201110436722 Pending CN103173525A (zh) | 2011-12-22 | 2011-12-22 | Dscc1基因的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103173525A (zh) |
-
2011
- 2011-12-22 CN CN 201110436722 patent/CN103173525A/zh active Pending
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C05 | Deemed withdrawal (patent law before 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130626 |