CN103172617A - 1,5-二取代-1,2,3-三氮唑三氟甲基类化合物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物的制备及其应用，具体地，提供了一个1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物，具有如(I)所示的结构，该化合物对于白血病细胞K562的生长有抑制作用，尤其能够有效抑制K562细胞的存活和生长：

Description

1,5-二取代-1,2,3-三氮唑三氟甲基类化合物的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体而言涉及1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物、其制备方法及用途。 

背景技术

慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种发生于造血干细胞的血液系统恶性克隆增生性疾病，也是最常见的一种白血病。CML约占成人白血病的15％～20％，在各年龄段均可发病，以中老年病例为常见。CML以t(9；22)(q34；q11)染色体易位形成的断裂点簇集区(breakpoint cluster region，BCR)-艾贝尔逊白血病病毒(Abelson leukemia virus，ABL)融合基因为主要标志，BCR-ABL融合基因表达BCR-ABL蛋白。在过去20多年中，研究人员发现BCR-ABL激酶在细胞信号转导和转化中发挥重要作用，它通过磷酸化和活化一系列下游底物，促使CML成熟粒细胞无限增生。BCR-ABL在正常细胞中不表达，所以它是治疗CML理想的药物靶标。 

20世纪90年代初，研究人员期望通过RNA途径抑制BCR-ABL融合基因发挥作用，但没能有效治疗CML。随着融合基因结构和表达产物的阐明，研究者把注意力转移到能直接作用于BCR-ABL蛋白的小分子药物的设计和开发上。近年来，开发的一系列BCR-ABL激酶抑制剂对CML有较好的疗效，例如：伊马替尼，尼罗替尼等。目前已证实了BCR-ABL的许多突变体，它们可分为四类：磷酸结合点突变，即P-loop (包括G250E、Q252R、Y253 F/H和E255K/V)；伊马替尼结合位点突变，破坏了范德华力(包括V289A、F311L、T315I和F317L)；催化域附近的突变(M315和E355G)；活化loop突变，能控制激酶的活化(H396R/P)。大部分突变妨碍激酶形成能与伊马替尼结合的非活化构象，从而产生耐药性10％～20％的CML 病例在伊马替尼治疗失败后，会检测到BCR-ABL T315I突变。它几乎对当前所有被批准的CML治疗药物，包括尼罗替尼和达沙替尼产生抗性。 

到目前为止，没有一种药物可以从根本上抑制或者消除白血病干细胞，达到彻底治愈的效果。因此，亟待发现一种疗效更好，毒副作用小，特异性强的治疗CML的药物。 

发明内容

本发明对尼罗替尼的结构进行优化，用1，2，3-三氮唑环替换尼罗替尼中的酰胺键，为1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物。药理活性结果表明，该类化合物对K562细胞的生长有抑制作用，其可以用于预防或者治疗白血病。 

本发明提供了一种1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物，其化学名称为(2-甲基-5-{5-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]-基-[1，2，3]三氮唑-1-基}-苯基)-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基)-胺，具有如(I)所示结构： 

本发明提供了一种制备1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物的方法，包括下列步骤： 

步骤a：使式(II)化合物 

经过重氮化反应及重氮基卤代生成式(III)化合物 

其中所述的参与卤代反应的底物选自CuCl、CuI或CuBr，首选CuI。 

步骤b：使式(III)化合物在3-甲基丁炔醇-3与钯的催化剂存在下，经高 温反应预定时间，再与NaH在预定温度反应生成式(IV)化合物 

其中，所述的钯的催化剂首选双三苯基膦二氯化钯，反应温度在80～100℃，首选90℃，在与NaH反应时的温度优选110℃。 

步骤c：使(V)化合物 

在预定温度下在极性溶剂中与亚硝酸钠在酸的存在下反应预定时间，然后再与叠氮化钠反应生成式(VI)化合物 

其中，所述的温度在-20至5℃之间，优选0～5℃，所述极性溶剂选自水、二甲基甲酰胺或者二甲基乙酰胺，优选水，所述酸选自盐酸，以及所述预定时间在5分钟至2小时之间的范围内，优选1.5小时；以及 

步骤d：使式(IV)化合物与式(VI)化合物在80～90℃下在极性或非极性溶剂中在催化剂的存在下反应生成式(I)化合物，其中，所述溶剂选自甲苯、乙腈，优选甲苯，以及所述催化剂选自Cp*RuCl(PPh₃)、[Cp*RuCl]₄，优选[Cp*RuCl]₄。 

在具体实施例中，制备如结构式(I)的1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物的方法，包括： 

步骤a：使式(II)化合物 

在0～5℃下在水中与亚硝酸钠在盐酸的存在下反应1.5小时，然后将反应液缓慢滴加呈回流状态的CuI的水溶液中，滴加速度不宜过快，滴加完毕 继续反应2小时，反应过程跟踪监控，最终生成式(III)化合物 

步骤b：使式(III)化合物在3-甲基丁炔醇-3与双三苯基膦二氯化钯的催化剂存在下，在甲苯中90℃反应3时间，再向反应液中加入NaH，反应温度升温至110℃，反应2小时生成式(IV)化合物 

步骤c：使(V)化合物 

在0～5℃下在水中与亚硝酸钠在盐酸的存在下反应1.5小时，然后再与叠氮化钠反应生成式(VI)化合物 

步骤d：使式(IV)化合物与式(VI)化合物在85℃下在甲苯中在[Cp*RuCl]₄的存在下反应生成式(I)化合物。 

本发明还提供了所述1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物在制备预防或者治疗白血病的药物中的应用。该化合物对K562细胞的生长和活性有一定的抑制作用，本发明中活性测试采用已上市药物伊马替尼为阳性参照物，在48小时伊马替尼和式(I)化合物对K562细胞的抑制IC₅₀值分别为0.282μmol/L和8.735μmol/L。由活性数据分析，可以将这类化合物配制成用来预防或者治疗白血病的药物。 

本发明所述1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物可以根据常规药物配制技术与药物载体或赋形剂(例如药学上可接受的载体和赋形剂)混合形成药物制剂。可以将所述1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物作 为活性成分混合在任何常用的口服剂型中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂和液体制剂(例如酏剂和混悬剂)，其中包含着色剂、矫味剂、稳定剂和掩盖味道的物质。对于混合口服剂型来说，所述1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物作为活性成分可以与各种普通片剂材料(例如淀粉、碳酸钙、乳糖、蔗糖和磷酸二钙)混合以助于压片和装入胶囊。可以将所述含1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物在药学上可接受的无菌液体载体例如无菌水、无菌有机溶剂或者两者的混合物中溶解或混悬。液体载体可以是适合注射剂的载体，比如生理盐水、丙二醇或者聚乙二醇水溶液。在其他情况下，还可以将微粉化的活性成分分散在淀粉或羧甲基纤维素钠的水溶液中或分散在适当的油(例如花生油)中来制得。液体药物制剂(指无菌溶液或混悬剂)可以用于静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射或者皮下注射。 

本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种作为活性成分的本发明所述1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物。除此之外，所述药物组合物还可以包含一种或多种无机或有机、固体或液体的药学上可接受的载体或者赋形剂。术语“药学上可接受的”是指当给药至动物例如哺乳动物(例如人类)时生理学上可耐受且通常不会产生过敏或类似的不良反应(例如头晕等)的添加剂或组合物。药物载体和赋形剂可以包括但不限于稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、甘露糖和/或甘油；润滑剂；聚乙二醇；粘合剂，例如硅酸铝镁、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；并且，如果需要的话，还包括崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠；和/或吸附剂、着色剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂和甜味剂。 

具体实施方式

下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。 

本文所用的缩略语通常为本领域技术人员所熟知的，或者可以是根据基础知识易于理解的。 

在本发明化合物的制备中所采用的起始原料是已知的、能够根据已知方法制备的或者可商购获得的。 

本发明还涉及新的中间体和/或起始原料。特别优选与实施例中提到的那些相同或者相似的反应条件和新中间体。 

中间体和终产物都可以根据常规方法进行后处理和/或纯化，所述常规方法包括调节pH、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、结晶等。 

另外，本发明化合物还可以通过本领域已知的各种方法或者本文所述方法的变通方法进行制备。 

下列实施例仅用于举例说明本发明，不以任何方式对本发明进行限制。 

实施例(2-甲基-5-{5-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]-基-[1，2，3]三氮唑-1-基}-苯基)-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基)-胺的制备 

步骤1.1：3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)碘苯的制备 

取50ml三口圆底烧瓶，依次加入超纯水25ml、3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯胺(1.00g，4.15mmol)、NaNO₂(0.57g，8.29mmol)，将反应体系的温度降至0℃，缓慢滴加HCl(0.45g，12.44mmol)，滴加过程中保持反应体系保持0℃不变，滴加完毕继续搅拌30分钟。然后将反应液缓慢滴加到CuI(0.75g，4.97mmol)的呈回流状态的水溶液中，20分钟滴加完毕，保持温度不变，继续反应3h。反应过程中通过TLC监测反应进程。反应结束，用EA萃取(25ml)三次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化得产物1.12g，产率为88.78％。 

该化合物的MS：[M+H]⁺353.09；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δppm8.46(s，2H)，7.99(s，1H)，7.98(s，1H)，7.17(s，1H)，2.35(s，3H)。 

步骤1.2：3-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯乙炔的制备 

取50ml三口圆底烧瓶，依次加入25ml三甲胺作为反应溶剂，步骤1.1所得的化合物(1.15g，3.27mmol)、3-甲基丁炔醇-3(0.30g，8.29mmol)及催化剂双三苯基膦二氯化钯将反应体系的温度升至90℃，保持温度不变，继续反应3小时。反应过程中通过TLC监测反应进程。反应结束，将反应液过滤，浓缩，将所得残留物加入到20ml甲苯溶液中，再加入NaH(86mg， 3.60mmol)，反应体系升温至110℃，反应2小时，将反应液过滤，旋干，将残留物溶于20ml二氯甲烷中，用20ml 5％的NaHCO₃水溶液洗两次，有机相经无水硫酸镁干燥，旋干，硅胶柱层析纯化得产物0.57g，产率为69.70％。 

该化合物的MS：[M+H]⁺251.07；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δppm7.81(s，1H)，7.69(s，1H)，7.66(s，1H)，7.58(s，1H)，7.05(s，1H)，3.27(s，1H)，2.31(s，3H)。 

步骤1.3：(5-叠氮-2-甲基-苯基)-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基)-胺的制备 

取100ml三口圆底烧瓶加入水15ml，在0℃下，依次加入N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-氨基嘧啶(0.50g，1.80mmol)和NaNO₂(0.25g，3.62mmol)，充分搅拌，然后缓慢滴加HCl(0.192g，5.41mmol)，滴加完成后，保持反应体系的温度在0～5℃之间，反应1.5小时。反应液的颜色加深。然后再缓慢滴加NaN₃(0.14g，2.17mmol)的水溶液，滴加过程中会产生大量的泡沫，此时需要补加反应溶剂水。滴加完成后，保持温度在0～5℃之间，继续反应3小时。在反应的过程中会发现反应液的颜色由深黄色又变回浅黄色且伴有黄色的泡沫。反应结束后，将反应液用乙酸乙酯(40ml)萃取3次，合并有机相，用饱和食盐水(10ml)洗涤3次，经无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将残留物经硅胶柱层析(CH₂Cl₂/MeOH＝20∶1)纯化，得到0.52g产物，为黄色状固体，产率为95.28％。 

该化合物的MS：[M+H]⁺304.12；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δppm 9.27(s，1H)，8.75(d，J＝4.0Hz，1H)，8.54(d，J＝4.0Hz，1H)，8.42(d，J＝8.0Hz，1H)，8.23(s，1H)，7.45(m，1H)，7.24(d，J＝5.2Hz，1H)，7.18(d，J＝8.0Hz，1H)，7.12(s，1H)，6.69(m，1H)，2.36(s，3H)。 

步骤1.4：(2-甲基-5-{5-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]-基-[1，2，3]三氮唑-1-基}-苯基)-(4-吡啶-3-基-嘧啶-2-基)-胺的制备 

取25ml三口圆底烧瓶，在氮气保护下，依次加入甲苯(15ml)、步骤1.2所的化合物(0.18g，0.70mmol)，步骤1.3所的化合物(0.22g，0.83mmol)，然后再加入[Cp*RuCl]₄(50mg，0.046mmol)，将反应体系升温至85℃，保持反应体系密闭继续反应12小时。待反应结束后，将反应液过滤旋干浓缩，将 残留物经硅胶柱层析(CH₂Cl₂/MeOH 8∶1)纯化，得产品0.20g，产率为51.63％。 

标题化合物的MS：[M+H]⁺554.20；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δppm9.25(s，1H)，8.78(s，1H)，8.39(d，J＝3.6Hz，1H)，8.32(d，J＝5.6Hz，2H)，7.96(s，1H)，7.91(s，1H)，7.76(s，1H)，7.64(s，1H)，7.61(s，1H)，7.48-7.46(m，1H)，7.37(d，J＝4.8Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.21(d，J＝3.6Hz，1H)，6.97-6.94(m，2H)，2.48(s，3H)，2.30(s，3H)。 

药理活性部分

本发明采用MTT比色法测定细胞活性。 

MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒结晶形成的量与细胞数成正比。 

MTT全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-diphenytetrazoliumromide，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。 

MTT粉末购买于Sigma公司，使用时用磷酸缓冲液(PBS)配制成浓度为5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，然后于4℃下避光保存。 

MTT比色法测定细胞活性包括下面几个步骤： 

步骤1)：加药前一天下午用K562细胞(购自北京金紫晶生物科技有限公司)铺96孔板。收集对数生长期的K562细胞，活细胞计数后调整细胞浓度至2.5×10⁴cells/mL。向96孔板中接种细胞，每孔加入100μL细胞悬液铺板，最终待测细胞为2500cells/孔。四周边缘孔不接种细胞，仅加入100μL细胞培养基(本实验中所使用的细胞培养基为改良型RPMI-1640(Hyclone)基础培养基，添加10％的胎牛血清(Hyclone))。5％ CO₂，37℃孵育过夜，以使细胞 充分贴壁。 

步骤2)：次日上午加药。首先稀释药物，配制相应的药物浓度梯度。向前一天铺好的96孔板的细胞中加入100μL相应的浓度的药物，本实验中设置了8个浓度梯度，体系中药物终浓度梯度为：40μM，30μM，20M，10μM，5μM，1μM，0.5μM，0.1μM。每个浓度设置5个重复。同时设置不加药仅接种细胞的孔为对照组，对照组不加药，补加100μL的细胞培养基即可；设置未接种细胞仅加培养基的孔设为空白孔，也补加100μL细胞培养基。5％ CO₂，37℃培养箱孵育48小时。 

步骤3)：48小时后每孔再加入20μL MTT溶液(5mg/ml，MTT)，继续培养4小时。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲洗2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 

步骤4)：4小时后终止培养，小心吸去孔内液体。每孔加入150μL二甲基亚砜，37。℃培养箱孵育10分钟。采用酶联免疫检测仪MULTISKAN FC(Thermo scientific)测定490nm处各孔的吸光值，测量时以空白孔作为调零孔。 

步骤5)：处理数据。首先采用下列公式计算抑制率： 

抑制率＝1-加药组OD值/对照组OD值 

然后以药物浓度为横坐标，细胞活力为纵坐标，用数据处理软件SPSS软件(IBM公司)进行几率单位加权回归法(Bliss法)进行数据处理，作图，得到IC₅₀值。 

根据上述测试方法，测得实施例化合物在48小时对K562细胞的抑制IC₅₀值为8.735μmol/L。 

根据上述内容，可以了解本发明化合物对K562细胞有抑制作用，能够有效抑制K562细胞的存活和生长。本发明化合物可以用于预防或者治疗白血病，有望能够替代易产生耐药性的伊马替尼。 

为了清楚和易于理解的目的，通过举例说明和实施例详细地描述了上述发明。可以在附随的权利要求的范围内进行改变和修改，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，可以理解，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。因此，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。 

Claims (4)

1.5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物，本发明中化合物具有如(I)所示结构：

2.制备权利要求1所述的1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物的方法，包括下列步骤：

步骤a：使式(II)化合物

经过重氮化反应及重氮基卤代生成式(III)化合物

步骤b：使式(III)化合物在3-甲基丁炔醇-3与钯的催化剂存在下，经高温反应预定时间，再与NaH反应生成式(IV)化合物

步骤c：使(V)化合物

在预定温度下在极性溶剂中与亚硝酸钠在酸的存在下反应预定时间，然后再与叠氮化钠反应生成式(VI)化合物

以及

步骤d：使式(IV)化合物与式(VI)化合物以80～90℃在极性或非极性溶剂中在催化剂的存在下反应生成式(I)化合物。

3.权利要求1所述的1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物在制备预防或者治疗白血病的药物中的应用。

4.一种药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的根据权利要求1所述的1，5-二取代-1，2，3-三氮唑三氟甲基类化合物。