CN103156902A - 雷公藤及其提取物在抗sars冠状病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了雷公藤及其提取物在预防或者治疗SARS冠状病毒感染中的应用。实验表明：在500μg/mL终浓度下，雷公藤的95％乙醇提取物对SARS主蛋白酶的抑制率达98.8％；而其95％乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物对SARS主蛋白酶的抑制率分别为99.3％、97.2％和83.8％。

Description

雷公藤及其提取物在抗SARS冠状病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，具体而言涉及雷公藤及其提取物的应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)又称传染性非典型肺炎，是一种严重的急性呼吸系统传染病。SARS病原体是冠状病毒属的一种病毒(Peiris J et al.Lancet，2003，361：1319-1325)。冠状病毒属隶属于冠状病毒科，冠状病毒是正链RNA病毒，在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的(Siddell，S.G et al.Coronaviruses，torovirusesand arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology and Microbia Infections，10th edition，Vol.Virology(eds.Mahy，B.W.J.& ter Meulen，V.)823-856(Hodder Arnold.London，2005))。这个属含有约26个种；按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，这个属又可以被分为三个组群：其中第一组群有猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)等；第二组群有SARS冠状病毒等；第三组群有禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)等(Spaan，W.J.M.and Cavanagh，D.Coronaviridae.in Virus taxonomy，VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.，London，2004)。

SARS冠状病毒2/3到3/4的基因组编码了两个复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla和pplab(Ziebuhr，Snijder et al.2000；Thiel，Herold et al.2001；Anand，Yang et al.2005；Ziebuhr 2005)，它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能(Ziebuhr，Snijder et al.2000；Anand，Yang et al.2005；Bartlam，Yang et al.2005)，SARS冠状病毒主要蛋白酶(简称主蛋白酶，main protease)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标。

天然产物又称次级代谢产物，具有结构多样性和生物活性多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ，Gragg GM，Snader KM.Nat Prod Rep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J Nat Prod.2004，67(2)：273-283)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是药物小分子化合物的一个巨大的宝库，因此从中药等天然产物中进行重要病毒或重要疾病相关靶蛋白抑制剂的筛选是很有必要的。

陈建操等在CN1539426A中公开了利用植物多酚用于制备药物和保健品抗SARS病毒以及治疗和/或预防SARS病毒所致的疾病；在CN1568945A中公开了姜黄素在制备治疗SARS的药物中的应用；在CN1568968A中公开了黄烷醇多酚在制备治疗SARS的药物中的应用。邵宁生等在CN1443770A中公开了抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶点。赵原在CN1453030A中公开了一种治疗和预防SARS病的中药，它由下述重量配比的原料制成，徐长卿3-10份、僵蚕3-10份、蝉蜕3-10份、鬼臼3-10份、女青3-10份、贯众10-15份、槟榔6-15份、厚朴3-10份、草果3-6份、女贞子6-15份、大黄3-12份。所述中药可制成水剂、冲剂、丹丸、胶囊的口服药物或针剂，救治已患SARS病的病人。王一飞等在CN1452967A中公开了千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。高平在CN1552387A中公开了一种治疗SARS的清热、润肺药物，是由藿香、茅术、滑石、明雄、前胡、寸香、厚朴、半夏、甘草、青皮、瓜蒌、贝母组成的；在CN1552388A中公开了一种治疗SARS的清热、解毒药物，是由榔片、厚朴、草果、甘草、元芩、双花、明白矾、牛子、知母、柴胡、青皮组成；在CN1552390A中公开了一种治疗SARS的清肺药物，是由知母、甘草、当归、元芩、陈皮、麦冬、地骨皮、百合、石膏、柴胡、半夏组成的；在CN1552391A中公开了一种治疗SARS的消炎、退热药物，是由陈皮、双花、元芩、元柏、连翘、甘草、附子、柴胡、川贝、花粉、龙胆组成的；在CN1552395A中公开了一种预防SARS病毒的中药制剂，由连翘、黄芩、赤芍、归尾、双花、麻黄、防风、大黄、牛子、青叶、花粉、皂角刺、佩兰磨成细粉，制成中药散剂，该发明是在古秘方治疗古代瘟疫病的基础上，在辨证施治的过程中不断修改完善的经验之方。萧伟等在CN1488380A中公开了一种中药组合物在制备抗SARS病毒的药物中的应用，该种中药组合物由羚羊角、平贝母、大黄、黄芩、青礞石、生石膏、人工牛黄和甘草等原料制成。于灵恩在CN1449817A中公开了抗SARS病毒、治疗心脑血管栓塞的中药，其组成为禹白附、黑附子、元胡。丁润泉在CN1454665A中公开了一种治疗SARS病毒的中药，主要包括黄芩、银花、连翘、石苇、黄芪、灵芝、丹参、赤芍、佩兰。李建青等在CN1552321A中公开了阿比朵尔在制备预防和治疗SARS病毒药物中的用途，通过体外细胞实验证明阿比朵尔对SARS病毒有显著的抑制作用。楼士荣在CN1451434A中公开了治疗和预防SARS病毒的中药，包含一枝黄花的原料制成的药物对SARS病毒和冠状病毒有十分明显的针对性杀灭和抑制效果。罗伟生等在CN1721387A中公开了一种从中药大黄中分离提取的大黄蒽醌类化合物具有强大的抑制SARS病毒的作用，体外实验表明，对SARS冠状病毒3C-like proteinase(3C-蛋白酶)药物剂量在100μg/mL时抑制率达85％以上。

雷公藤为植物卫矛科(Celastraceae)植物雷公藤(Tripterygium wilfordiiHook.f.)的根。味苦、辛，性凉，有大毒。具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、杀虫解毒的功效，现代药理学研究表明它具有免疫调节作用、抗肿瘤作用、改善微循环作用、抗炎杀菌等。王晓民等在CN1276209A中公开了雷公藤属植物提取物能预防和治疗神经系统疾病。鲁君华在CN1321482A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗生殖器溃疡和皮肤病。罗都强等在CN1289540A中公开了雷公藤具有杀虫活性。王汉东在CN1398603A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗颈、肩、腰、腿疼疾病。林开春在CN1337157A中公开了雷公藤非水提取物具有迅速杀虫作用。康小海在CN1397323A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗子宫内膜异位症。郑家润等在CN1060845A中公开了雷公藤中的雷公藤酮具有抗生育作用。张林豪在CN1066592A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗肾炎蛋白尿病。朱钦文在CN1098933A中公开了雷公藤作为组方之一制备成治疗类风湿关节炎和肾炎等疾病的雷公藤搽剂。黄世宽在CN1117853A中公开了雷公藤可代替啤酒花作为组方药之一用于治疗血管瘤。黄德轩在CN1141794A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗骨质增生。胡硕泉在CN1615922A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗再生障碍性贫血。杨华山在CN1846732A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗畜禽类流行性疾病。徐冬生在CN1872174A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗烧伤与烫伤。陈卫军在CN1850165A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗牛皮癣。于震鹏在CN101040927A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗强直性脊柱炎。邱日辉在CN101194923A中公开了雷公藤作为组方药之一用于治疗系统性红斑狼疮。

虽然雷公藤已被用于治疗多种疾病，但尚未见到雷公藤在抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性中的应用。

发明内容

在对雷公藤进行研究的过程中，我们发现雷公藤及其提取物具有抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用。可以将其制备成SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，从而预防或治疗SARS冠状病毒感染。

在一个方面，本发明提供了雷公藤在制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。

在上述应用中，所述雷公藤为卫矛科(Celastraceae)植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的根。

在上述应用中，所述雷公藤经溶剂提取。其中，所述溶剂选自水、醇或其混合物。所述醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、乙二醇等，优选甲醇或乙醇。在一个具体实施例中，雷公藤经95％乙醇提取得到雷公藤的95％乙醇提取物。

在上述应用中，对经提取后的雷公藤进一步进行有机溶剂萃取。其中所述有机溶剂选自石油醚、氯仿、乙酸乙酯、或正丁醇中的一种或多种。在一个具体实施例中，对经95％乙醇提取后的雷公藤依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。

在本发明中还提供了雷公藤提取物及其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中的任意一种在制备抑制SARS冠状病毒感染的药物中的应用，尤其是在制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明采用离体活性测量的方法，对雷公藤进行活性测定，结果表明，雷公藤及其提取物具有很好的抑制SARS冠状病毒主蛋白酶活性的作用，说明雷公藤及其提取物可以成为预防或者治疗SARS冠状病毒感染的潜在药物，或者与本领域公知的药物上可接受的适当载体或者赋形剂组成药物组合物，用于预防或者治疗SARS冠状病毒感染。

附图说明

图1是雷公藤95％乙醇提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图；

图2是雷公藤95％乙醇提取物各萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。

雷公藤的提取和萃取

将一定量的雷公藤药材用5-10倍量水、醇、或其混合物提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，经过滤后减压浓缩得到雷公藤的粗提物。

将该粗提物用1-5倍量的双蒸水超声1-3小时使其分散后，倒入分液漏斗中，依次用极性由小到大的有机溶剂如依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，充分振摇，静置，每种溶剂萃取3次，分离有机相和水相，并将有机溶剂相萃取液蒸发浓缩至干，得到雷公藤的有机溶剂萃取物。

药理活性测试部分

1.SARS冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化

根据文献(Yang H et al.Proc Natl Acad Sci.2003 Nov；100(23)：13190-5)进行SARS冠状病毒主蛋白酶的表达和纯化。具体方法如下：

1.1SARS冠状病毒主蛋白酶的表达载体的构建，具体步骤包括：

a.利用北京华大基因中心提供的编号为BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文库，用PCR技术进行体外扩增；

正向引物：5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′

反向引物：5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′

b.经PCR扩增的基因片段经BamHI和XhoI双酶酶切后，用琼脂糖凝胶电泳回收大小为1kb左右的片段；

c.将回收片段与T载体进行连接，然后用连接产物转化大肠肝菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；

d.从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒(博大泰克公司B型质粒小量快速提取试剂盒)提取质粒，并用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收大小约为1kb左右的目标基因片段；

e.将目标载体pGEX-4T-1(购自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；

f.将d和e获得的片段连接(将酶切回收后的目标基因片断和目标载体片段按照摩尔数3∶1～6∶1的比率混合，按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反应30分钟～18小时)，转化大肠肝菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，SARS冠状病毒的主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-4T-1载体中。

1.2SARS冠状病毒主蛋白酶的表达与纯化，具体步骤包括：

a.将上述步骤1.1中得到的含有编码SARS冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1载体转化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；

b.在a中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入1L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入1mM左右的IPTG，在16℃培养12小时左右；

c.5000～8000rpm离心10～15min收集细胞，然后冰浴超声破菌20～30min；破菌液13000rpm～15000rpm离心20～40min后收集上清液；

d.将上清液加入PBS预平衡的GST亲和层析柱(GE公司)中，用PBS淋洗20～30个柱床体积去除杂蛋白。最后加入2mL 0.1mg/mL左右的人类鼻病毒3C蛋白酶，在4℃酶切12～20小时，之后收集SARS冠状病毒主蛋白酶；

e.将上一步骤d中获得的SARS冠状病毒主蛋白酶再用Mono Q(GE公司)阴离子交换层析进行纯化，便可得到纯度较高的SARS冠状病毒主蛋白酶。

2.SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法

本发明所采用的筛选SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的方法是饶子和等在CN101418334A中公开的筛选方法，具体方法如下：

SARS冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的。该荧光底物的氨基酸序列来源于SARS冠状病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。

用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。

在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入备选样品的DMSO溶解物(使其终浓度为：500μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。设定阴性对照：不加入备选样品，其余条件相同。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每3秒钟记录一次荧光读数，共测定10个点。以时间为X轴，荧光值为Y轴作图便可得到酶活动力学曲线。通过图上前两个点的数值计算斜率便可得到反应的初速度V，将阴性对照的反应初速度定义为V₀，加入备选样品的反应初速度定义为V_i，从而计算出加入相应备选样品后主蛋白酶的剩余活性(V_i/V₀)，相应备选样品的抑制率则为(1-V_i/V₀)。可以对剩余活性小于20％(或抑制率大于80％)的备选样品进行进一步的分离纯化以找到更集中的活性部位。

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1雷公藤95％乙醇提取物的制备

取2公斤的雷公藤药材(购买于安徽省亳州市新兴药材有限公司)用8倍量95％乙醇回流提取3次，每次提取2小时，将提取液经过滤后合并，用EYELA N1001型旋转蒸发仪(日本理化公司)减压浓缩，蒸干后得到254g浸膏。

实施例2雷公藤95％乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物的制备

将实施例1中所得的雷公藤95％乙醇提取物取出200g，用280毫升双蒸水悬浮超声2小时使其分散，然后将其倒入1升分液漏斗中，按照有机溶剂极性由小到大依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取3次，每次用有机溶剂280毫升，充分振摇，静置6小时，分离出有机溶剂相并按有机溶剂种类合并，将各种有机溶剂萃取液用EYELA N1001型旋转蒸发仪浓缩，得到干膏状的雷公藤石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物，其中得到石油醚萃取物7.4克、乙酸乙酯萃取物73.5克、正丁醇萃取物34.8克。

实施例3雷公藤提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶抑制活性的测定

将实施例1中得到的雷公藤95％乙醇提取物和实施例2中得到的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物各取5mg，溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中使其浓度为50mg/mL。

在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠状病毒主蛋白酶(终浓度0.5μM)，加入上面4种提取物样品的DMSO溶液(使其终浓度为：500μg/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。设定阴性对照：不加入提取物样品，其余条件相同。激发波长和发射波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每3秒钟记录一次荧光读数，共测定10个点。以时间为X轴，荧光值为Y轴作图得到这4种提取物对SARS冠状病毒主蛋白酶的活性抑制曲线，如图1和图2所示。根据曲线计算得到如下结果：在500μg/mL终浓度下，雷公藤95％乙醇提取物对SARS主蛋白酶的抑制率达98.8％；其相应的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物对SARS主蛋白酶的抑制率分别为99.3％、97.2％和83.8％。

根据上述实施例可以看出，雷公藤95％乙醇提取物及其各萃取物对SARS冠状病毒主蛋白酶均具有良好的抑制活性。表明雷公藤及其提取物和萃取物可以分别用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂，从而可以预防或者治疗SARS冠状病毒感染。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，应当理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此，上面的说明书旨在用于说明而不是用于限制。所以，本发明的范围不应参考上述说明书来确定，而应当参照下面所附权利要求以及这些权利要求所享有的等同原则所确定的全部范围确定。

Claims (9)

1.雷公藤在制备预防或者治疗SARS冠状病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述雷公藤为卫矛科(Celastraceae)植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的根。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述雷公藤经溶剂提取。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述溶剂选自水、醇或其混合物。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述醇是甲醇或乙醇。

6.根据权利要求3所述的应用，其中所述溶剂是95％乙醇。

7.根据权利要求3所述的应用，其中对经溶剂提取后的雷公藤进一步进行有机溶剂萃取。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述有机溶剂选自石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇中的一种或多种。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的应用，其中，所述雷公藤用于制备SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂。

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