CN103146796B - 基于酒糟制备腐植酸的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵领域，特别涉及酒糟的再利用方法，具体为：将酒渣经蒸汽爆破，并通过酶解处理所得的产品做为固体培养基，按数量计，将米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌以4-6∶2-3∶8-12的比混合，得混合菌，将混合菌以按3-5％的接种量接种至步骤B所得酶解产物中，在38-42℃条件下发酵80-120小时，得发酵产物；所述发酵产物中含有腐植酸；本发明通过对蒸汽爆破条件的优化，应用优良的益生菌菌株混菌配比，以及酶工程/发酵工程核心技术，以酒渣为处理原料，开发一条以复合酶-益生菌生物转化为主、物理和化学处理为辅的创新技术路线，明显提高白酒丢糟的附加值，变费为宝，使白酒生产达到零排放，进入循环经济轨道。

Description

基于酒糟制备腐植酸的方法及其应用

技术领域

本发明属于发酵领域，特别涉及酒糟的再利用方法。

背景技术

本发明所指腐植酸，为生物腐植酸，是由作物或木屑及一些辅助原料合理搭配，在不同温度和湿度条件下，由不同的微生物种群发酵、转化，经萃取和浓缩，再络合微量元素等形成的生物化学产品。腐植酸作为饲料添加剂应用方面，矿源腐植酸用作饲料添加剂和畜禽医疗已有多年历史，它具有消炎、止血、收敛、调节肠道功能、提高免疫力的功能，对多种疾病有防治作用。据试验分析，矿源腐植酸分子量大，生物活性物质少，营养成分低，不适宜做生物饲料培养基质。利用微生物发酵技术生产饲料酵母蛋白和生物腐植酸复合物，既可用于畜禽水产饲料添加剂，也可采用不同配料比生产多种畜禽、水产用生物饲料，我们将这一技术获得的产物，定义为腐植酸基生物饲料。

有研究报道，在猪饲料中添加天然腐植酸养猪，有如下作用：腐植酸可调整体内的盐分和碱，中和糠醛。降低青绿饲料中的有害物质，防止腹泻，增强体质，提高抗病力，降低死亡率。减轻排泄物的臭味，对防止公害有利。能促进猪的消化功能，促进新陈代谢，提高饲料利用率；提高猪日增重，促进发育，缩短育肥期。促进消化酶的生命力，有效的分解营养物质，游离出芳香烃，从而提高适口性，增进食欲。消除应激影响，不出现咬尾和狂暴状态。

关于腐植酸制备饲料的报道很多，但是，基于食品生产废弃物制备腐植酸，特别是用酒渣制备腐植酸的报道相对较少。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种酒糟的再利用方法，该方法为制备生物腐植酸提供了很好的解决思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于酒糟制备腐植酸的方法，具体包括以下步骤：

A酒糟的预处理

将酒糟烘干后，粉碎为粒径不小于20目的粉末，加入相当于所述干燥后的酒糟体积0.5-2倍的水介质充分浸泡，并进行蒸汽爆破预处理，得蒸汽爆破预处理料；所述蒸汽爆破预处理的压力不低于1.0MPa,蒸汽爆破预处理时间不低于2分钟；

B酶处理

将所述蒸汽爆破预处理料用纤维素酶和半纤维素酶酶解处理，得酶解产物，将所述酶解产物作固体培养基；所述纤维素酶为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶和β－葡萄糖苷酶中任一种或多种，所述半纤维素酶为木聚糖酶和甘露聚糖酶中任一种或两种，所述纤维素酶和/或半纤维素酶的质量相当于所述蒸汽爆破预处理料的5-10‰；

C发酵

按数量计将米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按4-6:2-3:8-12的比混合，得混合菌，将混合菌以按3-5％的接种量接种至步骤B所得酶解产物中，在38-42℃条件下发酵80-120小时，得发酵产物；所述发酵产物中含有腐植酸。

进一步，所述的基于酒糟制备腐植酸的方法，在步骤C所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物3-6倍体积的水介质，并调节pH值至8-13，搅拌8-18小时后，进行固液分离，保留液体，制成相当于所述水介质0.3-0.5倍体积的浓缩液，所述浓缩液中富含腐植酸。

进一步，所述的基于酒糟制备腐植酸的方法，步骤A中，所述蒸汽爆破预处理的压力为1.5MPa,蒸汽爆破预处理时间为8分钟，所述酒糟具体为大麦、豌豆、高粱、大米、糯米、小麦和玉米为原料，通过白酒固体发酵工艺及蒸馏白酒后的剩余渣子。

进一步，所述的基于酒糟制备腐植酸的方法，步骤C中，所述混合菌种中，米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌的数量比为5:3:10。

进一步，所述的基于酒糟制备腐植酸的方法，步骤C中，所述的发酵时间为110小时。

进一步，所述的基于酒糟制备腐植酸的方法，在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物3倍体积的0.1M的碳酸氢钠缓冲液浸泡2小时，用氢氧化钠调节pH值至13，搅拌12小时。

所述的方法制备的腐植酸原料。

本发明的目的之二在于提供上述腐植酸原料的应用，该应用为制备动物饲料和绿色饲养提供了解决方案。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的腐植酸原料在制备饲料原料中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明涉及酒渣的再利用工艺，绿色环保，无二次污染；通过对蒸汽爆破条件的优化，适用于各类粮食酿酒工艺的剩余物的再利用，其处理效率高；应用优良的益生菌菌株以及酶工程/发酵工程核心技术，以白酒丢糟为处理原料，开发一条以复合酶-益生菌生物转化为主、物理和化学处理为辅的创新技术路线，明显提高白酒丢糟附加值，变费为宝，使白酒生产达到零排放，进入循环经济轨道。

更多的有益效果，详见具体实施方式。

具体实施方式

实施例中，纤维素含量的检测方式为范氏纤维素含量检测方法。

一纤维素含量：

1原理：用沸腾的质量体积分数为80％硝酸钙溶液使淀粉溶解，同时将干扰测定半纤维素的溶于水的其它碳水化合物除掉。将沉淀用蒸馏水冲洗以后，用较高浓度的盐酸，大大缩短半纤维素的水解时间，水解得到的糖溶液，稀释到一定体积，用氢氧化钠溶液中和，其中的总糖量用铜碘法测定。

2纤维素含量的测定所需溶液

(1)质量体积分数为80％硝酸钙溶液(2)2mol/l盐酸(3)酚酞指示剂(4)2mol/l氢氧化钠溶液(5)碱性铜试剂(配置方法：称取无水Na₂CO₃ 40g，溶于100ml蒸馏水中,溶后加酒石酸7.5g若不易溶解可稍加热，冷却后移入1000ml的容量瓶中。另取纯结晶CuSO₄ 4.5g溶200ml蒸馏水中，溶后再将此溶液倾入上述容量瓶内，加蒸馏水至1000ml刻度，放置备用)(6)草酸-硫酸混合液(7)质量体积分数为0.5％的淀粉溶液(8)0.1mol/L硫代硫酸钠溶液。

3实验步骤(3个平行)

1)称取自然风干的生物质粉末0.1-0.2g，数值为n；2)装入10ml离心管中，加入10mL 80％的硝酸钙溶液，盖好加热至沸腾，在慢慢沸腾的情况下加热5min；3)分步离心，分别用10mL热水洗涤沉淀3次，之后加5mL丙酮再洗3次；4)在沉淀中加入10mL 2mol/l的盐酸，搅匀，沸水浴中不停搅拌情况下微沸45min；5)离心，残渣分别用10mL蒸馏水冲洗三次，冲洗后的水溶液合并在离心液中；6)加入1滴酚酞，用2mol/l氢氧化钠溶液中和到显橙红色；7)转入100mL的容量瓶，稀释到刻度；8)用干燥滤纸过滤到干燥烧杯中；9)移液管吸取10mL滤液装入大试管中，加入10mL碱性铜试剂，盖好在沸水中煮15min；10)冷却，加入5mL草酸-硫酸混合液(加酸混合的时候必须在不断搅拌的情况下加入)，再加入0.5mL 0.5％淀粉，用0.1mol/l硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失，用去b mL；11)取10mL碱性铜试剂，加5mL草酸-硫酸混合液，再加10mL滤液，加入0.5mL 0.5％的淀粉，0.01N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失，用去a mL；12)纤维素的百分含量为＝0.9×100×[248-(a-b)](a-b)/(1000×n)。

二腐植酸的测定方法

1原理

用焦磷酸钠碱液或氢氧化钠溶液从样品中抽提腐植酸；再在强酸性溶液中，用重铬酸钾将腐值酸中的碳氧化成二氧化碳，根据重铬酸钾消耗量和腐植酸含碳比.计算腐植酸的产率。

2试剂

1)焦磷酸钠碱抽提液：称取15g化学纯焦磷酸钠(Na₄P₂O₇·lOH₂0)(HG3—1288)和7g化学纯氢氧化钠(GB/T 629)，溶解到1L蒸馏水中，密闭保存。2)氢氧化钠抽提液1％：称取10g化学纯氢氧化钠，溶解到1L蒸馏水中，密闭保存。3)重铬酸钾标准溶液c(1/6K₂Cr₂O₇)＝O.1mol/L：将优级纯重铬酸钾(GB/T 642)在130C下干燥3h，置于干燥器中冷却，然后准确称取4.903 6g放入烧杯中，加入蒸馏水溶解，再转入l 000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，摇匀。4)重铬酸钾溶液c(1/6K₂Cr₂0₇)＝O.4mol/L：称取20g重铬酸钾溶于少量水中，将溶液转入1000ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，摇匀。5)硫酸亚铁铵标准溶液c[FeSO₄(NH₄)₂SO₄]＝0.1mol/L。6)邻菲罗啉指示剂：称取1.5g邻菲罗啉(GB/T 1293)及1g硫酸亚铁铵或0.7g硫酸亚铁(GB/T 664)溶于100ml蒸馏水中，用棕色瓶保存。7)二苯胺指示剂(GB/T 681)：称取0.5g二苯胺溶于20ml蒸馏水中，加入100ml浓硫酸。8)硫酸(GB/T 625)：化学纯，95％。

4测定步骤

1)样品中总腐植酸的测定

称取样品0.2g于250ml三角瓶中，加入焦磷酸钠碱抽提液100ml，在三角瓶口盖一小漏斗，置于(100±1)℃的水浴中(温度达不到时，加适量甘油调节)，加热抽提2小时。

取出三角瓶，冷却到室温，将抽提液及残渣全部转入200ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，摇匀。用中速定性滤纸干过滤，弃去最初的约10ml溶液，随后滤出50-100ml滤液，供测定用。

准确吸取滤液5ml于250ml三角瓶中，用移液管准确加入5ml 0.4mol/L重铬酸钾溶液和15ml浓硫酸，于(100±1)℃水浴中加热氧化30min，取下冷到室温，用蒸馏水稀释到100ml左右，冷却后加3滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴至砖红色。另外准确吸取2份0.4mol/L重铬酸钾，每份5ml，各加5ml焦磷酸钠碱抽提液和15ml浓硫酸，按本条的规定氧化和滴定，测定空白值。

2)样品中游离腐植酸的测定

除用质量分数为1％氢氧化钠溶液代替焦磷酸钠碱液进行抽提外，其余参照上述步骤。

4.5测定结果按下述公示计算：

${\mathrm{HA}}_{\mathrm{ad}}=\frac{3(V_0-V_1)c}{m\×1000}\×\frac{a}{b}\×100$

其中：HA_ad——一般分析样品中的总腐植酸或游离腐植酸产率，％

V₁——滴定试液所消耗的标准硫酸亚铁铵溶液的体积，ml；

V₀——滴定空白所消耗的标准硫酸亚铁铵溶液的体积，ml；

C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L；

3——碳的摩尔质量，g/mol；

a——碱抽提液的总体积，mL；

b——测定时所取试液的体积，mL；

m——样品质量，g。

第一部分蒸气爆破预处理

实施例1酒糟的蒸汽爆破预处理

酒糟的预处理方法步骤：将高粱酒的酒糟烘干后，粉碎为粒径为20目的粉末，加入相当于所述干燥后的酒糟体积0.5倍的蒸馏水浸泡12小时，并进行蒸汽爆破预处理，得蒸汽爆破预处理料1；所述蒸汽爆破预处理的压力为1.0MPa,蒸汽爆破预处理时间为2分钟。

实施例2酒糟的蒸汽爆破预处理

酒糟的预处理方法步骤：将大米制备的白酒的酒糟烘干后，粉碎为粒径为60目的粉末，加入相当于所述干燥后的酒糟体积2倍的蒸馏水浸泡12小时，并进行蒸汽爆破预处理，得蒸汽爆破预处理料2；所述蒸汽爆破预处理的压力为1.5MPa,蒸汽爆破预处理时间为8分钟。

除了实施例1的高粱酒和实施例2的大米白酒的酒糟之外，还分别采用大麦、豌豆、糯米、小麦和玉米为原料为原料制备的白酒的酒糟按上述工艺进行蒸汽爆破预处理。1)蒸汽爆破过程中，高压热蒸汽进入纤维原料中，并渗入纤维内部的空隙。由于水蒸汽和热的联合作用产生纤维原料的类酸性降解以及热降解，低分子物质溶出，纤维聚合度下降。2)在高压蒸汽释放时，已渗入纤维内部的热蒸汽分子以气流的方式从较封闭的孔隙中高速瞬间释放出来，纤维内部及周围热蒸汽的高速瞬间流动，使纤维发生一定程度上的机械断裂。这种断裂不仅表现为纤维素大分子中的键断裂，还原端基增加，纤维素内部氢键的破坏，还表现为无定形区的破坏和部分结晶区的破坏。3)在蒸汽爆破过程中，水蒸汽渗入纤维各孔隙中并与纤维素分子链上的部分羟基形成氢键。同时高温、高压、含水的条件又会加剧对纤维素内部氢键的破坏，游离出新的羟基，增加了纤维素的吸附能力。瞬间泄压爆破使纤维素内各孔隙间的水蒸汽瞬间排除到空气中，打断了纤维素内的氢键。分子内氢键断裂同时纤维素被急速冷却至室温，使得纤维素超分子结构被“冻结”，只有少部分的氢键重组。这样使溶剂分子容易进入片层间，而渗入的溶剂进一步与纤维素大分子链进行溶剂化，并引起残留分子内氢键的破坏，加速了葡萄糖环基的运动，最后导致其它晶区的完全破坏，直至完全溶解。4)在高温、高压下，纤维素分子内氢键受到一定程度的破坏，纤维素链的可动性增加，有利于纤维素向有序结构变化。同时，纤维素分子链的断裂，使纤维素链更容易再排列。

实施例3酒糟的蒸汽爆破预处理

酒糟的预处理方法步骤：将大米制备的白酒的酒糟烘干后，粉碎为粒径为60目的粉末，加入相当于所述干燥后的酒糟体积2倍的质量分数为1％的石灰水浸泡12小时，并进行蒸汽爆破预处理，得蒸汽爆破预处理料3；所述蒸汽爆破预处理的压力为1.5MPa,蒸汽爆破预处理时间为8分钟。

实施例4

实施例1-3制备的蒸汽爆破预处理料，通过SEM图比较，蒸汽爆破预处理料表面出现大量的孔洞，长条状结构已消失，物料已经完全呈现出无规则的结构，说明超声处理已经破坏了其结晶结构。蒸汽爆破预处理料的无规则结构使其比表面积大大增加，利于后续纤维素和半纤维素的利用。未经处理的蒸汽爆破预处理料表面平滑，致密有序，此种规整的结构不利于后续纤维素和半纤维素的利用。

通过对实施例1-3中蒸汽爆破预处理料和对比料(未经蒸汽爆破处理的)的纤维素及半纤维素含量进行检测，并对相对于对比料中纤维素及半纤维素含量进行了统计，其中：实施例1的纤维素含量提高了25％，半纤维素提高了13％；实施例2的纤维素含量提高了32％，半纤维素提高了16％；实施例2的纤维素含量提高了43％，半纤维素提高了27％。

第二部分蒸汽爆破预处理料的发酵

实施例5酶解处理

将实施例3所得蒸汽爆破预处理料用纤维素酶和半纤维素酶酶解处理，得酶解产物，将所述酶解产物作固体培养基；所述纤维素酶为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶和β－葡萄糖苷酶的混合酶(按重量比为1:1:1混合)，所述半纤维素酶为木聚糖酶和甘露聚糖酶的混合酶(按重量比为1:1:1混合)，所述纤维素酶和/或半纤维素酶的质量相当于所述蒸汽爆破预处理料的7‰。

实施例6单菌种发酵

将米酒酵母以按5％的接种量接种至所述酶解产物作固体培养基中，在38℃条件下发酵120小时，得发酵产物；所述发酵产物中含有腐植酸。

在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物5倍体积的水介质，并调节pH值至11，搅拌18小时后，进行固液分离，保留液体，制成相当于所述水介质0.5倍体积的浓缩液，所述浓缩液中富含腐植酸。按上述腐植酸的测定方法测定，酒糟烘干后粉碎的粉末中，所述生物腐植酸的平均含量为10％，米酒酵母的数量为8×10⁷个/克。

实施例7双菌种发酵

按数量计将米酒酵母、枯草芽孢杆菌按5:2.5的比例混合，得混合菌，将混合菌以按5％的接种量接种至步骤B所得酶解产物中，在38℃条件下发酵120小时，得发酵产物；所述发酵产物中含有腐植酸。

在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物6倍体积的水，并调节pH值至8，搅拌8小时后，进行固液分离，保留液体，制成相当于所述水介质0.5倍体积的浓缩液，所述浓缩液中富含腐植酸。按上述腐植酸的测定方法测定，酒糟烘干后粉碎的粉末中，所述生物腐植酸的平均含量为14％，混合菌的数量为9×10⁶个/克。

实施例8三菌种发酵

按数量计将米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按5:3:10的比例混合，得混合菌，将混合菌种以按5％的接种量接种至步骤B所得酶解产物中，在39℃条件下发酵110小时，得发酵产物；所述发酵产物中含有腐植酸。

在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物3倍体积的0.1M的碳酸氢钠缓冲液浸泡2小时，并调节pH值至13，搅拌12小时后，进行固液分离，保留液体，制成相当于所述水介质0.5倍体积的浓缩液，所述浓缩液中富含腐植酸。按上述腐植酸的测定方法测定，酒糟烘干后粉碎的粉末中，所述生物腐植酸的平均含量为18％，混合菌的数量为2×10⁸个/克。

实施例9腐植酸制备饲料

BFA可做为优秀的生物饲料、生物肥料、生物农药及其它工业产品的原料产品，应用领域非常广泛，潜在市场巨大，前景广阔。如果能够突破产量少、成本高的产业化瓶颈。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.基于酒糟制备腐植酸混合物的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A酒糟的预处理

将酒糟烘干后，粉碎为粒径不小于20目的粉末，加入相当于所述干燥后的酒糟体积0.5-2倍的水介质充分浸泡，并进行蒸汽爆破预处理，得蒸汽爆破预处理料；所述蒸汽爆破预处理的压力不低于1.0MPa,蒸汽爆破预处理时间不低于2分钟；

B酶处理

将所述蒸汽爆破预处理料用纤维素酶、半纤维素酶进行酶解处理，得酶解产物，将所述酶解产物作固体培养基；所述纤维素酶为葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶和β－葡萄糖苷酶，所述半纤维素酶为木聚糖酶和甘露聚糖酶，所述纤维素酶和/或半纤维素酶的质量相当于所述蒸汽爆破预处理料的5-10‰；

C发酵

按数量计，将米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌按4-6:2-3:8-12的比混合，得混合菌，将混合菌按3-5％的接种量，接种至步骤B所得酶解产物中，在38-42℃条件下发酵80-120小时，得发酵产物；在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物3倍体积的0.1M的碳酸氢钠缓冲液浸泡2小时，并调节pH值至13，搅拌12小时后，进行固液分离，保留液体，制成相当于所述水介质0.3-0.5倍体积的浓缩液，所述浓缩液中富含腐植酸。

2.根据权利要求1所述的基于酒糟制备腐植酸混合物的方法，其特征在于：步骤A中，所述蒸汽爆破预处理的压力为1.5MPa,蒸汽爆破预处理时间为8分钟，所述酒糟具体为大麦、豌豆、高粱、大米、糯米、小麦和玉米为原料，通过白酒固体发酵工艺及蒸馏白酒后的剩余渣子。

3.根据权利要求1所述的基于酒糟制备腐植酸混合物的方法，其特征在于：步骤C中，所述混合菌中，米酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌的数量比为5:3:10。

4.根据权利要求1所述的基于酒糟制备腐植酸混合物的方法，其特征在于：步骤C中，发酵时间为110小时。

5.根据权利要求1所述的基于酒糟制备腐植酸混合物的方法，其特征在于：在所得发酵产物中加入相当于所述发酵产物3倍体积的0.1M的碳酸氢钠缓冲液浸泡2小时，用氢氧化钠调节pH值至13，搅拌12小时。

6.权利要求1-5任一项所述的方法制备的腐植酸混合物。

7.权利要求6所述的腐植酸混合物在制备饲料中的应用。