CN103134782A - 图像获取装置、图像获取方法和图像获取程序 - Google Patents

Abstract

本发明涉及图像获取装置、图像获取方法和图像获取程序。图像获取装置包括：光源，被配置为用激发光照射具有荧光标记的生物样品，该激发光激发荧光标记；光学系统，包括物镜，该物镜被配置为放大生物样品的成像目标；图像传感器，被配置为形成由物镜放大的成像目标的图像；移动控制器，被配置为在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，该成像范围至少包括对应于成像目标的厚度的范围，和数据处理单元，被配置为曝光图像传感器，同时在成像范围中移动聚焦位置并获取生物样品的荧光图像，由此根据荧光图像计算在成像目标的厚度方向上的荧光标记的分布信息。

Description

图像获取装置、图像获取方法和图像获取程序

技术领域

本公开涉及通过使用显微镜获得图像的图像获取装置、图像获取方法和图像获取程序。

背景技术

过去，在乳腺癌等的治疗中，已经使用这样的方法，其中分析外科手术切除的组织的切片，并且根据该分析结果，在手术之后选择有助于病人的药物。

例如，通过使用Abbott Laboratories的HER-2DNA探针试剂盒，对外科手术切除的组织切片进行荧光染色。当用激发光照射组织切片时，HER-2/neu基因发射红色荧光，并且α卫星DNA序列发射绿色荧光。因此，HER-2/neu基因由读取亮点标记，并且α卫星DNA序列由绿色亮点标记。

在使用荧光显微镜诊断中，计数红色亮点和绿色亮点的数目。在红色亮点的数目是绿色亮点数目的2.2倍或更多的情形中，确定HER-2阳性反应。在此情况下，在将F.Hoffmann-La Roche公司的被称为Herceptin（商品名称）的分子靶向药物给予患者时，预计在手术后患者的预后相当好（参看HER-2Examination Guide，3rd edition，Trastuzumab Pathology WorkingGroup，September 2009，p.10<FISH-method determination method>）。

此外，日本专利申请公告第2011-107669号公开了从生物样本的荧光图像中检测标记细胞的亮点的技术。日本专利申请公告第2011-107669号公开了生物样品图像获取装置。该生物样品图像获取装置成像由物镜放大的生物样品的目标位点。在成像中，适当移动物镜的焦点，以便能够改进检测亮点的准确度。

发明内容

在使用如上所述的荧光显微镜等的诊断中，重要的是适当地设定光学系统的聚焦位置。例如，在载玻片上放置例如组织切片的样品，并且经由密封剂在其上放置盖玻片。因此创建的制片被设置在荧光显微镜的载物台上。此时，由于种种理由，例如样品厚度不均匀、载玻片厚度不均匀以及载玻片和载物台之间捕获的灰尘，所以必须为在载物台上安装的每个标本调整聚焦位置。

同时，随着光学系统的数值孔径（NA）变得越高，通过使用荧光显微镜观察的亮点的亮度和图像的分辨度变得越高。因此，利用使用数值孔径（NA）高的光学系统的显微镜，上述诊断的正确性趋于提高。然而，当光学系统的数值孔径（NA）增加时，聚焦深度变窄并且容易错过聚焦位置。换句话说，很难进行上述聚焦位置的调节。

关于此问题，例如，可以采用下列方法。也就是说，以小于聚焦深度的间隔变化聚焦位置，为每个变化进行成像，并且分析拍摄的图像以检索聚焦位置。然而，在这个方法中，必须获取大量图像并且使用大容量存储器用于存储对应于所获取图像的图像数据。此外，必须参照多个图像数据项目，以便计算聚焦位置，因为这涉及大量工时所以效率低。

考虑到如上所述的情况，期望提供能够有效地成像具有荧光标记的生物样品的图像获取装置、图像获取方法和图像获取程序。

根据本公开的实施方式，提供了图像获取装置，其包括光源、光学系统、图像传感器、移动控制器和数据处理单元。

该光源被配置为用激发光照射具有荧光标记的生物样品，该激发光激发荧光标记。

该光学系统包括物镜，物镜被配置为放大生物样品的成像目标。

图像传感器被配置为形成由物镜放大的成像目标的图像。

移动控制器被配置为在成像范围中移动光学系统的聚焦位置（焦点位置），该范围至少包括对应于成像目标的厚度的范围。

数据处理单元被配置为在成像范围中移动聚焦位置期间使将图像传感器暴光，并且获得生物样品的荧光图像，由此基于荧光图像计算在成像目标的厚度方向上荧光标记的分布信息。

在该图像获取装置中，光学系统的聚焦位置在成像范围中移动，该成像范围至少包括成像目标的厚度范围。在移动期间，图像传感器被曝光，并且获得生物样品的荧光图像。然后，根据生物样品的荧光图像，计算在成像目标的厚度方向上荧光标记的分布信息。因此，例如，可以容易地计算用于适当地成像荧光标记的聚焦位置。因此，可以有效成像具有荧光标记的生物样品。

移动控制器可以被配置为在成像目标的厚度方向上移动聚焦位置，以及在垂直于厚度方向的平面方向上移动聚焦位置。

数据处理单元可以被配置为基于荧光图像的荧光标记的形状计算分布信息。

移动控制器可以被配置为在多个分割成像范围的每个中移动光学系统的聚焦位置，这些分割成像范围在成像目标的厚度方向上分割成像范围。在此情况下，数据处理单元可以被配置为基于在多个分割成像范围中获得的多个荧光图像计算分布信息。

数据处理单元可以被配置为计算多个荧光图像中的每个的频率分量，并且基于具有最高最大频率分量的荧光图像计算分布信息。

数据处理单元可以被配置为计算多个荧光图像中的每个的亮度，并且基于具有最大亮度的荧光图像计算分布信息。

图像获取装置可以进一步地包括成像模式确定单元，该单元被配置为基于计算出的分布信息确定用于生物样品的成像模式。

根据本公开的另一个实施方式，提供了图像获取方法，其包括：用激发光照射具有荧光标记的生物样品，该激发光激发荧光标记；在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，该成像范围至少包括对应于生物样品的成像目标的厚度的范围，该光学系统包括被配置为放大成像目标的物镜；在成像范围内移动聚焦位置期间将图像传感器暴光，图像传感器被配置为形成由物镜放大的成像目标的图像，并且获得生物样品的荧光图像；并且基于获得的荧光图像计算在成像目标的厚度方向上的荧光标记的分布信息。

根据本公开的又一个实施方式，提供了图像获取程序，其使计算机执行：用来自光源的激发光照射具有荧光标记的生物样品，该激发光激发荧光标记；在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，该成像范围至少包括对应于生物样品的成像目标的厚度的范围，该光学系统包括被配置为放大成像目标的物镜；在成像范围内移动聚焦位置期间将图像传感器暴光，图像传感器被配置为形成由物镜放大的成像目标的图像，并且获得生物样品的荧光图像；并且基于获得的荧光图像计算在成像目标的厚度方向上的荧光标记的分布信息。

如上所述，根据本公开，可能有效地成像具有荧光标记的生物样品。

根据对如附图所示的实施方式的以下详细说明，本公开的上述及其他目的、特征和优点将变得显而易见。

附图说明

图1是示出根据本公开的实施方式的图像获取装置的示意图；

图2是在从载物台的侧面的方向上示出图1所示的载物台上安装的生物样品的图。

图3是示出图1所示的数据处理单元的硬件结构的框图；

图4是示出根据本实施方式获得生物样品图像的处理的功能模块图；

图5是示出由图1的图像获取装置成像的成像目标区域的图；

图6A和图6B是各自示出移动图1所示的载物台的情况下光学系统的聚焦位置的移动的示意图；

图7A和图7B是用于详细描述根据实施方式的聚焦位置的移动范围的示意图；

图8A、图8B和图8C是示出样品位点的荧光图像的示意图，这些图像在图7A和7B所示的相应分割成像范围中拍摄；

图9A、图9B和图9C是作为实施方式的实例拍摄的照片，其分别对应于图8A、图8B和图8C所示的荧光图像；

图10是示出由图4所示的分布信息计算单元处理的计算实例的流程图；

图11是示出在实施方式中从开始位置到聚焦图像的角度θ的计算处理的实例的图；

图12是示出根据实施方式的多个荧光标志的分布信息的实例的图；

图13是示出根据实施方式的多个荧光标志的分布信息的实例的另一个图；

图14是示出根据实施方式的多个荧光标志的分布信息的实例的另一个图；

图15是示出在载玻片和载物台之间捕获有灰尘等的状态的示意图；和

图16是示出图10所示的、由分布信息计算单元进行的计算处理的变形实例的流程图。

具体实施方式

在下文中，将参考附图描述本公开的实施方式。

[图像获取装置的结构]

图1是示出根据本公开的实施方式的图像获取装置100的示意图。如图1所示，本实施方式的图像获取装置100包括显微镜10和数据处理单元20。

[显微镜的结构]

显微镜10包括载物台11、光学系统12、光源13和图像传感器14。载物台11具有安装表面。生物样品SPL安装在安装表面上。生物样品SPL的实例包括组织切片、细胞、和例如染色体的生物高分子。载物台11能够相对于安装表面在水平方向（X-Y面方向）和垂直方向上（Z轴方向）上移动。

安装表面的垂直方向（Z轴方向）对应于生物样品SPL的厚度方向。安装表面的水平方向（X-Y面方向）对应于垂直于厚度方向的平面方向。

图2是示出上述载物台11上安装的生物样品SPL的图。图2从载物台11的侧面的方向上示出生物样品SPL。如图2中所示，例如，生物样品SPL在Z方向厚度为几μm到几十μm。生物样品SPL夹在载玻片SG和盖玻片CG之间，并且由预定的固定方法固定。例如，载玻片SG的厚度是大约1mm。例如，盖玻片CG的厚度是大约0.15mm到0.17mm。

用荧光染色剂将生物样品SPL染色。荧光染色剂是用来自同一光源的激发光对其照射、由此发出荧光的染色剂。例如，可以使用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚、SpAqua、SpGreen等作为荧光染色剂。

将生物样品SPL染色，使得作为生物样品SPL的目标的活组织50具有荧光标记。当用预定激发光照射荧光标记时，从荧光标记发出预定荧光。因此，在成像生物样品SPL并且生成荧光图像的情况下，作为目标的活组织50由具有预定颜色的亮点（在下文中，称为“荧光标志55”）标记。

再次参考图1，光学系统12被设置在载物台11上方。光学系统12包括物镜12A、成像透镜12B、二向色镜12C、发射滤波器12D和激发滤波器12E。例如，光源13是灯泡，例如汞灯或者LED（发光二极管）。用来自光源13的激发光照射生物样品SPL中的荧光标记。

在获取生物样品SPL的荧光图像的情况下，激发滤波器12E只是使得从光源13中发出的光中具有用于激发荧光染料的激发波长的光穿过，由此生成激发光。穿过激发滤波器12E并且进入二向色镜12C的激发光由二向色镜12C反射，并且被引导到物镜12A。物镜12A将激发光会聚到生物样品SPL上。然后，物镜12A和成像透镜12B以预定倍率放大生物样品SPL的图像，并且在图像传感器14的成像区域形成放大的图像。

当用激发光照射生物样品SPL时，染色剂发出荧光。染色剂结合到生物样品SPL的每个组织。荧光经由物镜12A穿过二向色镜12C，并且经由发射滤波器12D达到成像透镜12B。发射滤波器12D吸收由上述物镜12A放大并且已经穿过激发滤波器12E的光。只有部分彩色光穿过发射滤波器12D。如上所述，成像透镜12B放大外部光消失的彩色光的图像。成像透镜12B在图像传感器14上形成图像。

例如，能够使用CCD（电荷耦合器件）、CMOS（互补型金属氧化物半导体）图像传感器等作为图像传感器14。图像传感器14具有光电转换元件，其分别接收RGB（红色、绿色、蓝色）彩色光，并且将彩色光转换为电信号。图像传感器14是彩色成像器，其基于入射光获得彩色图像。

数据处理单元20驱动光源13。数据处理单元20通过使用图像传感器14获得生物样品SPL的荧光图像。数据处理单元20将荧光图像存储为样本数据。

[数据处理单元的结构]

图3是示出数据处理单元20的硬件结构的框图。例如，数据处理单元20由PC（个人计算机）配置。数据处理单元20将生物样品SPL的荧光图像存储为任意格式的数字图像数据，例如存储为JPEG（联合照相专家组）格式，其中该荧光图像是从图像传感器14获得的。

如图3中所示，数据处理单元20包括CPU（中央处理器）21、ROM（只读存储器）22、RAM（随机存取存储器）23、操作输入单元24、接口单元25、显示器单元26和存储器27。这些模块经由总线28彼此连接。

ROM 22是用于存储例如用于执行各种类型的处理的固件的和多个程序和数据的固定存储器。RAM 23被用作CPU 21的工作区，并且暂时存储OS（操作系统）、将执行的各种应用和将处理的各种类型的数据。

例如，存储器27是非易失存储器，例如HDD（硬盘驱动器）、闪速存储器、或者另一个固体存储器。OS、各种应用和各种类型的数据存储在存储器27中。特别地，在本实施方式中，由图像传感器14拍摄的荧光图像数据和用于处理荧光图像数据的图像处理应用程序也存储在存储器27中。

接口单元25连接到控制板，该控制板包括载物台驱动单元15、光源驱动单元16和图像传感器控制器17。载物台驱动单元15驱动显微镜10的载物台11。光源驱动单元16驱动显微镜10的光源13。图像传感器控制器17驱动显微镜10的图像传感器14。根据预定通信标准在控制板和数据处理单元20之间发出和接收信号。

CPU 21在RAM 23中展开在ROM 22或者存储器27中存储的多个程序中的对应于从操作输入单元24接收的指令的程序。CPU 21根据展开的程序任意控制显示单元26和存储器27。

操作输入单元24是操作装置，例如指示装置（例如，鼠标）、键盘、或者触摸板。

显示单元26是液晶显示器、EL（电子发光）显示器、等离子显示器、CRT（阴极射线管）显示器等等。显示单元26可以内置在数据处理单元20，或者可以外部链接到数据处理单元20。

[获取生物样品图像的处理]

在本实施方式中，在成像范围中，该范围包括对应于生物样品SPL中将成为成像目标的位点的厚度的范围，移动光学系统12的聚焦位置。在移动聚焦位置期间，图像传感器14曝光，以便获得生物样品SPL的荧光图像。基于荧光图像，计算在成像目标的厚度方向上荧光标记的分布信息。该荧光标记的分布信息对应于作为由荧光标志55标记的目标的活组织50的分布信息。

例如，基于计算出的分布信息，容易计算用于适当地成像荧光标志55的聚焦位置。因此，有效地成像具有荧光标志55的生物样品SPL，这将在后面详细描述。

在RAM 23中，数据处理单元20的CPU 21展开在ROM 22或者存储器27中存储的多个程序中的对应于从操作输入单元24接收的指令的程序。CPU 21根据展开的程序（图像获取程序）执行获得生物样品图像的处理。

图4是用于获取生物样品图像的处理的功能模块图。在图4中，载物台控制器31（移动控制器）连续地移动载物台11，以便生物样品SPL的目标位点（在下文中，也称为“采样位点”）处于成像区域中。例如，如图5所示，载物台控制器31将生物样品SPL分配给成像区域AR。注意，在图5中，待分配给成像区域AR的生物样品SPL的区域彼此不重叠。可替换地，部分区域可以与部分邻近区域重叠。

此外，每当为目标的采样位点在成像的区域AR中移动时，载物台控制器31都移动载物台11。由此移动光学系统相对于采样位点的焦点。在本实施方式中，控制载物台11的移动，使得在采样位点的厚度方向上（Z轴方向，物镜12A的光轴方向）上移动焦点，并且同时在垂直于厚度方向的平面方向（X-Y面方向）上移动焦点。

作为具体实例，载物台控制器31根据下列表达式移动载物台11。

$x\left(t\right)=x_0+L\&times;\cos \left(2\mathrm{\&pi;}\frac{t}{t_{\mathrm{ex}}}\right)...\left(1\right)$

$y\left(t\right)=y_0+L\&times;\sin \left(2\mathrm{\&pi;}\frac{t}{t_{\mathrm{ex}}}\right)...\left(2\right)$

$z\left(t\right)=z_{\mathrm{start}}+(z_{\mathrm{end}}-z_{\mathrm{start}})\frac{t}{t_{\mathrm{ex}}}...\left(3\right)$

如表达式（1）和（2）中所示，载物台11沿着具有半径L的圆移动，该圆的中心在X-Y面上的坐标（x₀，y₀）。中心坐标（x₀，y₀）的位置和半径L的尺寸可以任意设定，只要能够成像该成像区域AR。

表达式（1）和（2）中的“t_ex”表示曝光时间。在进行图像传感器14的曝光时，圆周地移动载物台11。换句话说，在本实施方式中，在载物台11进行圆周移动时，图像传感器14被曝光。

如表达式（3）所示，载物台11也沿着Z轴方向移动。载物台11根据图像传感器14的曝光时间以恒速从移动开始位置z_start移动到移动终点位置z_end。

图6A和图6B各自示出在将载物台11移动的情况下光学系统的聚焦位置的移动。如图6A和6B所示，包括聚焦位置的焦平面FP沿着Z轴方向从z_start移动到z_end。伴随该移动，焦平面FP在X-Y面上围绕中心坐标（x₀，y₀）圆周移动。

图像获取单元32（曝光控制器）发出指令给图像传感器控制器17，从而在每次目标采样位点由载物台控制器31移动到成像区域AR时，使图像传感器14从载物台11的移动开始的时间点到其移动结束的时间点曝光。

当载物台11的移动结束时，图像获取单元32经由图像传感器控制器17从图像传感器14获得采样位点的图像，该图像通过在开始移动的时间点和结束移动的时间点之间实行的曝光获得。然后，图像获取单元32通过使用预定合并算法将分配给成像区域AR的采样位点的图像彼此合并，从而由此生成整个生物样品图像。

图7A和7B是用于详细描述根据本实施方式的聚焦位置的移动范围的示意图。如图7A和7B所示，在本实施方式中，设定多个分割成像范围（Zscan_1到3）。多个分割成像范围在Z轴方向分割包括至少采样位点的厚度范围T的成像范围L。在每个分割成像范围中进行如上所述的聚焦位置的移动控制。具体地，为各自的分割成像范围设定z_start（1到3）和z_end（1到3）（参看图7B）。

例如，在Z轴方向上分割成像范围的尺寸是20μm到50μm。然而，该尺寸不限制于这些数值。进一步，也不限制分割成像范围的数目。此外，也不限制至少包括采样位点的厚度范围T的成像范围L的尺寸。

在预定采样位点被分配给成像区域AR的情况下，聚焦位置在各个分割成像范围中移动。然后，为每个分割成像范围获得荧光图像。因此，对预定采样位点获得三个荧光图像。

例如，在预定采样位点被分配给成像的区域AR的情况下，可以连续获得三个荧光图像。可替换地，在一个分割成像范围中可以成像整个生物样品SPL，并且其后可以对其他分割成像范围进行成像。

图8A、图8B和图8C是示出采样位点的荧光图像的示意图，这些图像在图7A和7B所示的相应的Zscan_1到Zscan_3中获取。图9A、图9B和图9C是获取的作为本实施方式的实例的照片，其分别对应于图8A、图8B和图8C所示的荧光图像。图9A、图9B和图9C中所示的照片是荧光图像，这些图像是在半径L是15μm、Z轴方向上的移动量（z_end﹣z_start）是20μm、并且图像传感器14曝光从而获得图像的时间为1秒的条件下获得的。此外，也适当地调整诸如γ值的成像条件。

如图7A和图7B所示，Zscan_1和Zscan_3是在Z轴方向上不包括荧光标志55的范围。因此，如图8和图9所示，上述范围中获得的荧光图像的image_Zscan1和image_Zscan3中，荧光标志55的图像是非常模糊的（图8A、图8C、图9A和图9C）。

另一方面，在Zscan_2中获得的荧光图像image_Zscan2中，在接近于荧光标志55的位置的范围中移动聚焦位置。因此，如图8B和图9B所示，在获得的image_Zscan2中，伴随聚焦位置的移动的荧光标志55的轨迹被成像。

分布信息计算单元33基于由图像获取单元32生成的生物样品SPL的荧光图像计算采样位点的厚度方向上荧光标志55的分布信息。在本实施方式中，基于在图8和图9所示的相应的Zscan_1、Zscan_2和Zscan_3中获得的多个荧光图像，计算分布信息。

图10是示出由分布信息计算单元33进行的计算处理实例的流程图。在本实施方式中，对在Zscan_1、Zscan_2和Zscan_3中获得的多个荧光图像进行频率分析（步骤101）。由此，计算各个荧光图像（image_Zscan1、2、3）的空间频率。

将各荧光图像的最大频率分量相互比较，并且选择最大频率分量最高的荧光图像（步骤102）。如图8和图9所示，image_Zscan1和image_Zscan3包括荧光标志55的模糊图像。另一方面，image_Zscan2具有荧光标志55的轨迹的图像。因此，在步骤102中，image_Zscan2被选为最大频率分量最高的荧光图像。

分析最大频率分量最高的image_Zscan2中荧光标志55的轨迹的图像（步骤103）。具体地，在本实施方式中，分析image_Zscan2中荧光标志55的形状。

分布信息计算单元33检测荧光标志55（在下文中，也称作“目标标志”并且也被描述为荧光标志55a），荧光标志55标记由图像获取单元32生成的image_Zscan2的目标活组织50。

例如，在分布信息计算单元33中，目标标志的颜色（在下文中，称为“目标标志颜色”）和标记细胞核的荧光标志55的颜色（在下文中，荧光标志55被称为“核标志”，并且荧光标志55的颜色被称为“核标志颜色”）被设定为设置信息。

此外，在使用标记目标基因的荧光标志55（在下文中称为“目标标志”并且被描述为荧光标志55b）的情况下，设定正常细胞核中目标基因的数目。进一步地，在此情况下，也设定标记目标基因的荧光标志的颜色（在下文中，称为“目标标志颜色”）。

基于将用于荧光染色的探针的制造商和诸如荧光标志类型的使用条件，清楚定义这些设定信息项目。例如，具体地，在使用Abbott Laboratories的HER-2DNA探针试剂盒的情形下，HER-2基因的目标标志颜色被设定为“红色”，并且核标志颜色被设定为“蓝色”。此外，在此情形下，染色体上邻近HER-2基因的基因被设定为目标基因，并且该目标基因的目标标志颜色被设定为“绿色”。

分布信息计算单元33检测具有设定的标记颜色并且亮度大于阈值的荧光标志55，由此检测荧光标志55的形状（面积）、荧光标志55的数目等。然后，分布信息计算单元33分析荧光标志55的形状，由此计算多个荧光标志55的分布信息。

图8B示出作为例子的两个荧光标志55a和55b。如上所述，在移动光学系统12的聚焦位置期间，图像传感器14被曝光，使得生成image_Zscan2。由于聚焦位置在载物台11的平面方向X-Y面上圆周移动，所以荧光标志55a和55b沿着圆O移动。具体地讲，荧光标志55a和55b的轨迹各自描述了从聚焦的移动开始位置z_start开始到其移动结束位置z_end的半圆（这里，示出在曝光时间中聚焦位置在半圆上移动的情形）。

光学系统12的聚焦位置也在Z轴方向上在Zscan_2的范围中向上移动。在移动期间，各个荧光标55a和55b在一个聚焦位置最准确地对焦。在最准确地对焦的状态下，荧光标志55a和55b的图像各自都具有最小的面积和最高的亮度。具有最小面积的图像会被描述为对焦图像（in-focusimage）60。

在本实施方式中，计算从开始位置z_start到对焦图像60形成的角度θ，以便基于该角度θ计算在采样位点的厚度方向上荧光标志55的分布信息。

例如，在图8B所示的荧光标志55b中，在描绘半圆的荧光标志55b的轨迹的中间位置存在对焦图像60。该角度θ大约90度。在此情形下，当聚焦位置移动到Zscan_2的中间时，荧光标志55b最准确地对焦。由此，发现荧光标志55b位于Zscan_2的中间。

在另一个荧光标志55a中，在从描绘半圆的荧光标志55a的轨迹的中间位置到接近于结束位置z_end的位置存在对焦图像60。角度θ是大约135度。在此情形下，当聚焦位置超过Zscan_2的中间从而移动到上部时，荧光标志55a最准确地对焦。由此，发现荧光标志55a位于Zscan_2的上侧。

随着从开始位置z_start到对焦图像60的角度θ变得越小，荧光标志55位于越接近开始位置z_start的位置。具体地，荧光标志55位于生物样品SPL内更接近载物台11的一侧上。

另一方面，随着角度θ变得越大，荧光标志55位于更靠近结束位置z_end的位置。具体地，荧光标志55位于在生物样品SPL内远离载物台11的一侧上。

图11是示出计算在本实施方式中从开始位置z_start到对焦图像60的角度θ的处理的实例的图。

通过修边处理从拍摄的图像70剪裁所要分析的荧光标志55的图像（步骤201）。将该修边图像75与理论图像进行匹配处理。

如图11所示，在本实施方式中，理论图像的文件保存在存储器27等中。在这个文件中，存储多个理论图像80。多个理论图像80与从0度到359度的角度相关联。在本实施方式中，与理论图像80相关联的角度的大小是理论图像80的标识号码。

可以适当地设定波长、数值孔径、放大倍数、像素间距等，用于创建理论图像80。此外，可以适当地设定哪个角度被设定为0度，以每多少度准备理论图像等。例如，以每1度准备理论图像80的情形下，创建359个理论图像80。

计算那些理论图像80与修边图像75之间的相关系数（步骤202）。然后，计算具有最高相关系数的理论图像80的标识号码（参看图11的图形）。对所拍摄的图像70的多个荧光标志55的每个，计算具有最高相关系数的理论图像80的标识号码。生成与多个荧光标志55相关联的标识号码的列表，并且将该列表存储在存储器27等中（步骤203）。

基于已经计算出的对应于相应荧光标志55的理论图像80的标识号码（角度），适当地计算从开始位置z_start到对焦图像60的上述角度θ。例如，可以准备使得该角度θ与作为标识号码的角度一致的理论图像80。可替换地，可以基于作为标识号码的角度确定荧光标志55的形状，然后可以重新计算从开始位置z_start到对焦图像60的角度θ。应该注意，计算从开始位置z_start到对焦图像60的角度θ的方法不限制于图11中所示的方法，并且可以使用其他方法。

基于多个荧光标志55的所计算出的从开始位置z_start到对焦图像60的角度θ，计算在采样位点的厚度方向上荧光标志55的分布信息（步骤104）。具体地，在本实施方式中，为各个荧光标志55计算在Z轴方向上的位置信息。由此，计算出多个荧光标志55的分布信息。

图12、图13和图14是各自示出多个荧光标志55的分布信息的实例的图形。以此方式，荧光标志55的分布信息能够被生成作为直方图形式的数据。在这些图中，横轴表示在Z轴方向上的位置，并且纵轴表示荧光标志55的数目。

在本实施方式中，横轴由物镜的聚焦深度（焦点深度）F的一半尺寸（F/2）分段，使得计数在各自范围中包括的荧光标志55的数目。横轴的分辨度（resolution）不限制于F/2，并且只要适当地设定为小于聚焦深度的值。此外，可以设定大于聚焦深度的值。

具体地，光学系统12的聚焦位置被设定在横轴的某个范围内，获得包括在该范围中的荧光标志55的对焦图像。包括在其他范围中的荧光标志55以更模糊的方式成像，因为这些荧光标志55位于距离聚焦位置较远。

基于荧光标志55的这种分布信息，成像生物样品SPL。可参考荧光标志55的分布信息，这允许匹配将实行的成像模式或成像目的有效、高精度地成像。

例如，假设，在生物样品SPL中存在的多个荧光标志55中，获取具有一定数量的焦点对准的荧光标志55的荧光图像。在此情形下，如图12所示，判定用被设定在位置A的聚焦位置成像一次即可，所述位置A被包括在包含最大数目荧光标志55的范围中。因此，能够获得高精确度荧光图像。

为了定量观察生物样品SPL中包括的荧光标志的总数、其类型等等，在此情形下，基于分布信息计算荧光标志55所在的整个范围B，然后对其进行扫描，由此获得全部荧光标志55被成像的荧光图像。

例如，聚焦位置从开始点移动到整个范围B的结束点的期间，可以将图像传感器14曝光，使得获得一个荧光图像。可替换地，如图13所示，聚焦位置可以在扩展范围C中移动，扩展范围C包括整个范围B和整个范围B两侧上的预定边缘M。由此，位于整个范围B的中间的荧光标志55和位于端部的荧光标志55以模糊的方式大体上类似地成像。换句话说，荧光标志55总体上以大体上相同的尺寸和亮度成像，使得能够改进测量荧光标志55的精度。

存在这样的成像模式：对一个采样位点在Z轴方向上不同的聚焦位置获得多个荧光图像，该模式被称作Z栈（Z-stack）。即使在实行Z栈的情形中，也可以适当地使用分布信息。例如，当参照图13中所示的整个范围B时，定义将对其实行Z栈的范围。进一步，参考图形，适当设定不同聚焦位置之间的间隔、获得的图像的数目等。例如，可以基于通过分段横轴获得的范围执行Z栈。以此方式，参考分布信息，获得高精度荧光图像。

如图14所示，可能获得这样的图形，其中荧光标志55的分布具有两个峰值。换句话说，存在这样的情形，例如其中荧光标志55集中在两个不同位置的附近。在这种情形中，如果在一定数量的荧光标志55焦点对准的条件下，在中间位置成像一次，那么成像可能失败。

当参考分布信息时，各自的峰值中包括的位置D和位置E被计算为聚焦位置。聚焦位置被设定到这些位置D和E，并且执行两次成像，结果获得高精确荧光图像，而不会出现成像失败。

图4所示的数据记录单元34合并已经由图像获取单元32生成的各采样位点的生物样品图像，由此生成一个生物样品图像。然后，数据记录单元34将生物样品图像以预定压缩形式（例如JPEG（联合照相专家组）格式）编码样品数据，从而将数据存储在数据存储器35中。此处理可以在由分布信息计算单元33进行的分布信息计算之前执行。

进一步，数据记录单元34接收由分布信息计算单元33计算的分布信息，并且将该分部信息数据在与采样数据相关联地存储在数据存储器35。

此外，例如，数据存储器35可以存储由分布信息计算单元33得到的荧光标志55的测量结果数据（荧光标志的区域、数目、类型等），并且可以存储这样的信息，例如被提取生物样品SPL的人的名字、该人的性别、该人的年龄以及提取的日期与时间。

如上所述，在根据本实施方式的图像获取装置100中，光学系统12的聚焦位置在至少包括采样位点的厚度范围T的成像范围L中移动。在移动期间，图像传感器14曝光，以便获得生物样品SPL的荧光图像。然后，基于生物样品SPL的荧光图像，计算在采样位点的厚度方向（Z轴方向）上荧光标志55的分布信息。因此，例如，容易计算与成像模式或成像目匹配的、用于适当成像荧光标志55的聚焦位置。因此，有效地成像具有荧光标志55的生物样品SPL。

例如，设想这样的方法，该方法以小于聚焦深度的间隔变化聚焦位置，为每个变化实行成像，并且分析所拍摄的图像从而检索聚焦位置。在该方法中，必须拍摄大量图像并且使用大容量存储器用于存储对应于所拍摄图像的图像数据。此外，为了计算聚焦位置，必须参考多个图像数据项目，因为这涉及大量工时所以效率低。

具体地，在NA被设定为0.8的情形中，聚焦深度为大约1μm。然后，为了搜索聚焦位置，以例如1μm变化聚焦位置的同时获得多个图像。分析该图像，以搜索聚焦位置。在此情形中，当在超过50μm的范围进行测量时，同时以1μm变化聚焦位置，必须拍摄50个或更多图像并且存储这些图像。在使用具有14bit和24Mpixs的成像器的情形中，在tif系统中一个图像的文件具有大约100MB的容量。因此，在处理50个或更多图像的情形中，将使用容量大约5GB或者更大的内存，这使得该过程复杂。

在本实施方式中，如图7中所示，Zscan_1、Zscan_2和Zscan_3被设定为三个分割图像范围。以此方式，设定大于聚焦深度的范围，并且通过较小次数的成像计算分布信息。因此，用数目大大减少的图像搜索聚焦位置。

在图7中，设定图像范围L（Zscan_1和3），范围L包括不存在生物样品SPL的范围。例如，如图15所示，在载玻片SG和载物台11之间可能捕获灰尘90，例如头发（具有例如大约20μm到50μm的尺寸）。在这种情况下，例如如果只考虑载玻片SG的厚度来设定成像范围L，那么可能丢失聚焦位置。因此，通过适当设定成像范围L，其中范围L包括不存在生物样品SPL的范围，高精确地计算该荧光标志55的分布信息。如上所述，用较少数目的图像检索聚焦位置，从而成像范围L可被设定为大的范围。

在自动检索和调节聚焦位置的情形下，可能发生下列错误：成像器上的灰尘和成像器的缺陷可能被错误地识别为载玻片SG上的荧光亮点，并且不同的聚焦位置被确定为对焦位置。

在本实施方式中，在图10的步骤101和102中，计算image_Zscan1、image_Zscan2和image_Zscan3的各自的空间频率，并且选择最大频率最高的图像。通过分析和比较频率分量，选择包括荧光标志55的对焦图像60的图像（image_Zscan2），而不受来自成像器（图像传感器14）上的粉尘、成像器的缺陷等的任何影响。

<变形实例>

本公开的实施方式不限制于如上所述的实施方式，并且可以进行各种改进。

图16是示出图10所示的由分布信息计算单元33进行的计算处理的变形实例的流程图。在这个变形实例中，计算image_Zscan1、image_Zscan2和image_Zscan3的每个的亮度（步骤301)。然后，选择具有最大亮度的荧光图像（步骤302)，并且对荧光图像进行分析荧光标志的处理（步骤303）。用这样的方式，基于在多个分割图像范围的每个中拍摄的荧光图像的亮度，可以选择是计算分布信息的处理的目标的荧光图像。因此，抑制了大量计算。

在如上所述的实施方式中，如图7所示，设定分割成像范围L的多个分割成像范围，并且为每个分割成像范围获取荧光图像。然而，载物台可以在整个成像范围L内移动，以便在一次成像中生成荧光图像。然后，根据荧光图像，可以计算荧光标志55的分布信息。

例如，可以对尺寸大约100μm的成像范围L进行一次成像。因此，可实现计算量的减少、处理速度的提高等。例如，可以基于成像范围L的尺寸和图像传感器14的精度确定是否设定分割成像范围。

在上文的描述中，根据成像模式或者成像目的，适当地使用分布信息。相反，可以基于分布信息选择最佳的成像模式或者成像目的。例如，可以进行以下的确定处理：在多个荧光标志55集中在聚焦深度的范围中的情形中，选择用固定焦距位置一次成像，并且在多个荧光标志55分散的情形中，选择Z栈成像。在此情形下，例如数据处理单元20用作成像模式确定单元。

此外，在荧光标志55中，可以只将目标标志（红色）或者目标标志（绿色）设定为用于分布信息计算的目标。例如该设定可以由用户的操作而输入。

此外，不可以为荧光图像中成像的全部荧光标志55计算位置信息。具体地，荧光标志55可以被稀疏地选择，并且基于其位置信息，可以计算分布信息。

注意，在上述实施方式的显微镜10的结构中，物镜12A可以是目镜透镜。

进一步地，上述提到的实施方式中，移动载物台从而移动聚焦位置。可替换地，可以移动光学系统12的物镜12A。

在上面提到的实施方式中，数据处理单元20包括数据存储器35，并且生物样品图像、荧光标志55的分布信息等等被记录在数据存储器35中。可替换地，这些可以记录在外部存储器中。

显微镜10可以不通过总线传输路径而是通过有线或无线传输媒体连接到数据处理单元20，例如通过局域网、因特网、或者数字卫星广播连接。

注意，本公开可以采取下列结构。

（1）一种图像获取装置，包括：

光源，被配置为用激发光照射具有荧光标记的生物样品，该激发光激发荧光标记；

光学系统，包括物镜，该物镜被配置为放大生物样品的成像目标；

图像传感器，被配置为形成由物镜放大的成像目标的图像；

移动控制器，被配置为在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，该范围至少包括对应于成像目标的厚度的范围；和

数据处理单元，被配置为在图像范围中移动聚焦位置的同时使图像传感器暴露于光，并获得生物样品的荧光图像，由此根据荧光图像计算在成像目标的厚度方向上荧光标记的分布信息。

（2）根据（1）的图像获取装置，其中，

移动控制器被配置为在成像目标的厚度方向上移动聚焦位置，并且在垂直于厚度方向的平面方向上移动聚焦位置。

（3）根据（1）或者（2）的图像获取装置，其中

数据处理单元被配置为根据荧光图像的荧光标记的形状计算分布信息。

（4）根据（1）到（3）的任何一个的图像获取装置，其中

移动控制器被配置为在多个分割成像范围的每个中移动光学系统的聚焦位置，分割成像范围在成像目标的厚度方向上分割成像范围，和

数据处理单元被配置为根据在多个分割成像范围中获得的多个荧光图像计算分布信息。

（5）根据（4）的图像获取装置，其中

数据处理单元被配置为计算多个荧光图像中的每个的频率分量，并且根据最大频率分量最高的荧光图像计算分布信息。

（6）根据（4）的图像获取装置，其中

数据处理单元被配置为计算多个荧光图像中的每个的亮度，并且根据具有最大亮度的荧光图像计算分布信息。

（7）根据（1）到（6）的任何一个的图像获取装置，进一步包括成像模式确定单元，其被配置为根据计算出的分布信息为生物样品确定成像模式。

本公开含有的主题涉及在2011年11月29日提交到日本专利局的日本在先专利申请JP 2011-260271中所公开的主题，其全部内容通过引用结合于此。

本领域技术人员应该理解，在权利要求及其等同方案的范围内根据设计要求及其他因素，可以进行不同的变形、组合、子组合和变更。

Claims (10)

1.一种图像获取装置，包括：

光源，被配置为用激发光照射具有荧光标记的生物样品，所述激发光激发所述荧光标记；

光学系统，包括物镜，所述物镜被配置为放大所述生物样品的成像目标；

图像传感器，被配置为形成由所述物镜放大的所述成像目标的图像；

移动控制器，被配置为在成像范围中移动所述光学系统的聚焦位置，所述成像范围至少包括对应于所述成像目标的厚度的范围；和

数据处理单元，被配置为在所述图像范围中移动所述聚焦位置的同时使所述图像传感器曝光，并获得所述生物样品的荧光图像，由此基于所述荧光图像计算在成像目标的厚度方向上所述荧光标记的分布信息。

2.根据权利要求1所述的图像获取装置，其中，

所述移动控制器被配置为在所述成像目标的厚度方向上移动所述聚焦位置，并且在垂直于所述厚度方向的平面方向上移动所述聚焦位置。

3.根据权利要求1所述的图像获取装置，其中，

所述数据处理单元被配置为基于所述荧光图像的荧光标记的形状计算所述分布信息。

4.根据权利要求1所述的图像获取装置，其中，

所述移动控制器被配置为在多个分割成像范围的每个中移动所述光学系统的聚焦位置，所述分割成像范围在所述成像目标的厚度方向上分割所述成像范围，和

所述数据处理单元被配置为基于在所述多个分割成像范围中获得的多个荧光图像计算所述分布信息。

5.根据权利要求4所述的图像获取装置，其中，

所述数据处理单元被配置为计算所述多个荧光图像中的每个的频率分量，并且基于最大频率分量最高的荧光图像计算所述分布信息。

6.根据权利要求4所述的图像获取装置，其中，

所述数据处理单元被配置为计算所述多个荧光图像中的每个的亮度，并且基于具有最大亮度的荧光图像计算所述分布信息。

7.根据权利要求1所述的图像获取装置，还包括成像模式确定单元，所述成像模式确定单元被配置为基于所计算出的分布信息确定用于所述生物样品的成像模式。

8.根据权利要求1所述的图像获取装置，所述生物样品为组织切片、细胞或生物高分子。

9.一种图像获取方法，包括：

用激发光照射具有荧光标记的生物样品，所述激发光激发所述荧光标记；

在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，所述成像范围至少包括对应于所述生物样品的成像目标的厚度的范围，所述光学系统包括被配置为放大所述成像目标的物镜；

在所述成像范围中移动聚焦位置的同时使图像传感器曝光，所述图像传感器被配置为形成由所述物镜放大的成像目标的图像，并且获得所述生物样品的荧光图像；和

基于所获得的荧光图像，计算在所述成像目标的厚度方向上所述荧光标记的分布信息。

10.一种图像获取程序，使得计算机执行：

用来自光源的激发光照射具有荧光标记的生物样品，所述激发光激发所述荧光标记；

在成像范围中移动光学系统的聚焦位置，所述成像范围至少包括对应于所述生物样品的成像目标的厚度的范围，所述光学系统包括被配置为放大所述成像目标的物镜；

在所述成像范围中移动聚焦位置的同时使图像传感器曝光，所述图像传感器被配置为形成由所述物镜放大的成像目标的图像，并且获得所述生物样品的荧光图像；和

基于所获得的荧光图像，计算在所述成像目标的厚度方向上所述荧光标记的分布信息。

Images