CN103130807A - 桑黄菌中环二肽c9的分离技术 - Google Patents
桑黄菌中环二肽c9的分离技术 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinus igniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）中环二肽C9的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇梯度洗脱，再次正相硅胶层析，接下来是HPLC检测，然后进行常压反相制备，再次进行HPLC检测，最后1D-HNMR检测，即得环二肽C9，即（3R，8aS）-六氢-3-甲基吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4-二酮。
Description
技术领域
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术
桑黄（Phellinus），子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。
目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类：一是只有分子筛作用的凝胶柱层析， 常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌（火木层孔菌Phellinus igniarius(L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌 phellinus linteus (Berk et Curt) Teng 、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌 Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz）中环二肽C9的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇梯度洗脱，再次正相硅胶层析，接下来是HPLC检测，然后进行常压反相制备，再次进行HPLC检测，最后1D-HNMR检测，即得环二肽C9，即（3R，8aS） - 六氢-3 - 甲基吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。此化合物目前已报道是一种呈味物质。
本发明的技术方案如下：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；
(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
分离环二肽C9的方法：
桑黄菌粗提物→正相硅胶层析→甲醇梯度洗脱→正相硅胶层析→HPLC检测→常压反相制备→HPLC检测→1D-HNMR→环二肽C9。
具体方法为：
(1)制备桑黄粗提物；
(2)将上述步骤（1）所得的桑黄粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；
(3)收集上述步骤（2）中最后一次的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；
(4)将步骤（3）得到的产物进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；
(5)使用HPLC检测收集步骤（4）的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(6)将步骤（5）得到的产物进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇与水；
(7)HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C9。
本发明由桑黄菌中环二肽C9的分离技术的显著优势：本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的环二肽C9。技术路线成熟明确，高效精确。
附图说明
图1为环二肽C9的结构式；
图2为环二肽C9的一维核磁共振H谱。
具体实施方式
实例1：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1% 葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1% 酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1% 磷酸二氢钾 0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25℃温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25℃，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55%；
(5)对步骤(4)所得提取液在70℃条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
称取粗提物125g与等体积的100目正相硅胶混匀，硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高1m，直径15cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=60:1（只有两种洗脱剂，与后面洗脱次数不符）分别洗脱3，4,4个柱体积。将最后一次的洗脱液适当合并减压蒸干，以甲醇溶解，进行甲醇凝胶层析。收集洗脱液，适当合并减压蒸干，与等体积100目硅胶拌样，使用200目正相硅胶装柱，再次进行甲醇正相层析。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，进行HPLC检测，0min：100%水，10min：100%甲醇，出峰时间为5.79min。。进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇水溶液。收集洗脱液，减压蒸干，HPLC检测，0min：100%水，10min：100%甲醇，出峰时间为5.80min。，出峰时间为5.90，适当合并，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7.37 (s, 1H), 4.15 – 4.07 (m, 1H), 4.04 (dd, J = 7.1, 4.1 Hz, 1H), 3.65 (dt, J = 11.8, 8.3 Hz, 1H), 3.59 – 3.49 (m, 1H), 2.45 – 2.32 (m, 1H), 2.15 – 2.01 (m, 2H), 2.01 – 1.84 (m, 2H), 1.49 (d, J = 7.2 Hz, 3H).证明是（3R，8aS） - 六氢-3 - 甲基吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。
实例2：
桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 3% 葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5% 酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5% 磷酸二氢钾 0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30℃温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30℃，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70%；
(5)对步骤(4)所得提取液在55℃条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
称取粗提物300g与等体积的100目正相硅胶混匀，硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高1.2m，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=200:1,100:1，50:1，分别洗脱4,3,,5,5个柱体积。将最后一次的洗脱液适当合并减压蒸干，以甲醇溶解，进行甲醇凝胶层析。收集洗脱液，适当合并减压蒸干，与等体积100目硅胶拌样，使用200目正相硅胶装柱，再次进行甲醇正相层析，洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，进行HPLC检测，0min：100%水，10min：100%甲醇，出峰时间为5.76min。进行常压反相层析，洗脱剂为40%甲醇水溶液。收集洗脱液，减压蒸干，HPLC检测，0min：100%水，10min：100%甲醇，出峰时间为5.76min。，适当合并，进行1D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7.37 (s, 1H), 4.15 – 4.07 (m, 1H), 4.04 (dd, J = 7.1, 4.1 Hz, 1H), 3.65 (dt, J = 11.8, 8.3 Hz, 1H), 3.59 – 3.49 (m, 1H), 2.45 – 2.32 (m, 1H), 2.15 – 2.01 (m, 2H), 2.01 – 1.84 (m, 2H), 1.49 (d, J = 7.2 Hz, 3H).证明是（3R，8aS） - 六氢-3 - 甲基吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。
Claims (11)
1.桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其步骤顺序如下：
(1)制备桑黄粗提物；
(2)将上述步骤（1）所得的桑黄粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；
(3)收集上述步骤（2）中最后一次的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；
(4)将步骤（3）得到的产物进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；
(5)使用HPLC检测收集步骤（4）的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(6)将步骤（5）得到的产物进行常压反相层析，洗脱剂为甲醇与水；
(7)HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C9。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得：
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：
玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%
(2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；
(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；
(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于所述的环二肽C9为（3R，8aS） - 六氢-3 - 甲基吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4 - 二酮。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱剂为甲醇。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目，洗脱剂为氯仿与甲醇。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(5)中所述的HPLC条件为0min：100%水，10min：100%甲醇。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的反相材料为C-18或者C-8，使用常压反相制备。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的洗脱剂为甲醇：水=35%-85%。
10.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的反相层析次数为2-3次。
11.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C9的分离方法，其特征在于，步骤(7)所述的HPLC出锋时间为5.45-6.25min。
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