CN103124794A - 引物珠粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了非极性疏水性珠粒,以及将引物可逆地结合、标准化、储存和原位递送到包括PCR在内的反应的方法。还提供了有关制备所述珠粒的说明。在适当结合缓冲液存在下,可以使用珠粒结合不含DMT的引物的粗溶液中的引物并使所述引物脱盐。在适当结合缓冲液存在下,可以使用珠粒结合含DMT引物的粗溶液中的引物并对所述引物进行纯化。珠粒可以结合含有多种粗制含DMT引物的溶液中皮摩尔量的含DMT引物。在脱三苯甲基和洗涤之后,得到的结合不含DMT的引物的珠粒可以用于PCR中。在循环变化温度时,引物从所述珠粒释放。引物结合珠粒用疏水性试剂进行涂覆或硅烷化,所述疏水性试剂确保在所述PCR反应的热循环期间逐渐释放引物。涂覆或硅烷化又增进引物的稳定性和长期储存。
Description
技术领域
本发明涉及核酸化学和分子生物学领域,并且更具体地讲,涉及有助于引物的纯化、标准化和储存以及其向扩增反应的递送和释放的试剂和方法。
背景技术
目前,酶促扩增反应,例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)被广泛使用。这一普遍性促使酶反应组装的简化,以便提高反应产物的产率和质量并且降低成本。
PCR中使用的试剂已经被冷冻干燥(U.S.5,834,254)或囊封,由此使扩增反应设置简单地为添加水、目标DNA模板和引物。举例来说,来自GE医疗集团(GE Healthcare)的“即用型RT-PCR珠粒(Ready-To-Go RT-PCR Bead)”含有除模板RNA和引物以外扩增反应所需的所有组分。
已经提出多种引物递送方式来使液体处理和交叉污染减到最少。固定在涂有抗生蛋白链菌素的表面上的标记生物素的引物(威斯汀(Westin)等人)或共价地固定于固体支撑物的引物(U.S.7,582,470)被描述用以扩增互补目标序列。美国专利7,615,193描述了用机器人将珠粒递送到PCR孔中,但未披露珠粒的类型、珠粒表面的组成以及用于制备引物结合珠粒的方法。
扩增反应混合物的组装温度通常低于产生引物杂交特异性并且引起与目标序列的扩增相竞争的引物延伸所需的温度(Chou等人,1992)。这会显著降低目标序列的扩增效率,尤其是当扩增含有较低模板拷贝数的样品时更是如此,并且这是PCR的主要缺点。在“热启动(hot-start)”扩增中,反应混合物中的一种或一种以上试剂被截留,或者以化学方式或酶促方式阻断,直到达到提供必要杂交特异性的温度。此举将在低引物杂交特异性的时间期间抑制引物延伸,并使引物二聚体的形成最少。为了将扩增限制于已知引物主要与预定目标序列杂交的温度,可以将试剂截留并在初始的高温保温步骤之后添加到反应孔中。这种最早的热启动方法尽管有效,但相当麻烦并且很快就被用例如蜡等热敏材料进行的反应组分物理分离所代替。当在变性步骤期间热敏材料熔融后,使启动扩增反应所需的所有试剂混合(U.S.5,411,876)。其它热启动方法依赖于镁的隔离作用(WO2003012066)、酶的热活化(U.S.5,773,258和U.S.5,677,152)或聚合酶特异性抗体对聚合酶的可逆抑制作用。当通过升高温度来使抗体失活时,扩增反应开始(U.S.5,338,671)。为了阻止引物延伸,已经通过形成发夹环(U.S.5,866,336)或通过用热不稳定性保护基保护3'-羟基(U.S.6,509,157;勒贝迪夫(Lebedev)等人,2008)来阻断引物。由于在达到确保引物杂交特异性的温度之前,这些引物无法支持引物延伸,故非特异性扩增减少。当前的热启动方法的缺点源自其对昂贵引物、特异性聚合酶或抗体,或者对有限的通量的依赖性。
需要获得一种可靠、简单并且经济的非手动的“热启动”PCR。
发明内容
以上和其它目的是通过使用珠粒将寡核苷酸引入反应中的方法实现。所述珠粒在珠粒表面上具有标准化、非共价结合的寡核苷酸。随后,在例如PCR等酶促反应期间,所述珠粒将这些寡核苷酸从珠粒逐渐释放。额外的初始步骤可以包括通过将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在珠粒上来纯化(例如脱盐)粗寡核苷酸溶液,从而制备所述珠粒。在此方法中,所述寡核苷酸可以为皮摩尔量的引物。
在一些实施例中,所述珠粒是具有非极性疏水性表面的多孔或无孔玻璃珠。这些珠粒可以具有非极性疏水性表面,所述表面包括选自C3到C20的线性或分支烷基链、芳基、苯甲基、萘基、菲基和三苯甲基。制备珠粒的初始步骤可以包括使玻璃珠与硅烷反应。在一些实施例中,珠粒包括非极性疏水性表面,所述疏水性表面包括表面(芳基)n-X-烷基,其中所述芳基选自由苯基、苯甲基、联苯基、萘基、三苯甲基组成的群组;X=C、O、S、SC(O)N、OC(O)N、NC(O)和N;n=1到3,n是等于或大于1的有限整数。
在一些实施例中,通过结合含有至少一种污染物的粗溶液中具有5'-疏水性部分的寡核苷酸,来纯化寡核苷酸。
此5'-疏水性部分可以是4,4'-二甲氧基三苯甲基(4,4'-dimethoxytrityl group,DMT),并且所述污染物可以是不含DMT的核酸。珠粒上的寡核苷酸可以包括引物(例如,至少一个反向引物和一个正向引物)和/或核酸探针。所述方法还可以包括使用结合缓冲液,以及将所得到的溶液与多个经过灌注(primed)的珠粒混合,从而得到结合含DMT的寡核苷酸的珠粒。这之后可以是用洗涤缓冲液洗涤结合含DMT的寡核苷酸的珠粒,所述洗涤缓冲液能去除污染物,但不去除结合的含DMT的寡核苷酸。
将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在所述珠粒上的实例可以包括将所述珠粒暴露于含有10%到100%甲醇、乙醇、乙腈或丙酮的水溶液;随后将所述珠粒暴露于含有0.1M到1.0M浓度的单烷基乙酸铵、二烷基乙酸铵、三烷基乙酸铵的pH范围为6到9.5的溶液。
根据权利要求15所述的方法,另外包含将所述结合的含DMT的寡核苷酸的DMT基团裂解,从而得到结合不含DMT的寡核苷酸的珠粒的步骤。
附图说明
图1是显示共价结合于珠粒表面的官能团的改进的化学结构图。
图2是显示(三苯甲基巯基丙基)珠粒或(T-珠粒)的制备的改进的化学结构图。
图3是由使用已经吸移到PCR缓冲液中的引物进行的100个拷贝106-mer模板的扩增反应的离子交换HPLC得到的色谱图。
图4a和4b是由使用硅烷化的引物结合珠粒原位释放的引物进行的(a)10个拷贝和(b)100个拷贝的106-mer模板的扩增反应的离子交换HPLC得到的色谱图。
具体实施方式
本文中使用的一般术语定义如下:
“核酸”和“寡核苷酸”是指聚脱氧核糖核苷酸或聚核糖核苷酸,并且包括单链DNA和单链RNA。
“引物”是指与打算在适当扩增缓冲液中扩增的DNA模板互补的寡核苷酸。
“扩增缓冲液”是在扩增反应开始时添加引物的溶液,这些溶液尤其含有DNA聚合酶(通常为热稳定性DNA聚合酶)和四种不同的三磷酸核苷。扩增过程中使用的引物优选为单链的,并且在10到50个核苷酸的范围内。术语引物还指含有经过修饰的嘌呤或嘧啶碱基的寡核苷酸、核苷酸类似物,或共价附接于5'端的其它核酸序列。此外,引物可以用检测标记(例如荧光素、罗丹明(rhodamine)和花青)、连接基(例如烷基胺)或报告子(例如生物素)进行修饰。
“引物二聚体”是指扩增反应的非模板依赖型人工产物,例如由引物延伸得到的那些,其中另一引物用作模板。
正在研制低成本低通量的PCR机器以供没经验的医师使用(纽泽尔(Neuzil)等人),但旨在使PCR组装更廉价且更可靠的尝试很少。本文中描述的珠粒通过帮助终端用户处理其引物,满足了这一需求。除去了在组装PCR反应之前稀释、标准化和吸移引物储备液的步骤,由此降低污染风险并且减少未使用的引物溶液的浪费。引物标准化是在纯化或脱盐工艺期间进行,其中每一珠粒结合执行扩增反应所需的指定皮摩尔量的引物。举例来说,使用珠粒结合、标准化和纯化含DMT引物。含DMT引物与珠粒的结合利用了已知的含三苯甲基的纯化技术(卡申(Cashion)等人,1973)。可以通过本领域技术人员已知的用于合成寡核苷酸的任何方法来合成含DMT引物,包括固相和液相方法,只要这些寡核苷酸保留最终的疏水性部分(例如二甲氧基三苯甲基)即可。这一疏水性部分提供了使含DMT引物可逆地结合于珠粒非极性表面,同时在穿流(flow-through)和随后的洗涤步骤中除去截短的序列和合成污染物的手段。在去除DMT后,得到的不含DMT的引物仍保持结合于珠粒和稳定性,同时防止受核酸酶影响。这一点有助于装运、长期储存和现场使用。
引物结合珠粒可以直接添加到扩增反应(例如PCR)中。一个实施例涉及用于核酸目标的扩增反应的试剂盒,并且包含引物结合珠粒、扩增试剂(例如核酸聚合酶或连接酶)、三磷酸核苷和适合的缓冲液。结合有引物的珠粒提供了扩增反应之间的可再现性,并且减少了吸移错误和污染的可能。结合有引物的珠粒提供了一种经济的热启动解决方案来解决非特异性扩增的问题。在环境温度下较少引物从疏水性珠粒浸出有助于扩增反应的组装。在扩增反应的预加热和变性步骤期间,引物得以释放。通过对引物结合珠粒进行涂覆或硅烷化,进一步排除了引物的室温浸出。这又实现了引物的逐渐释放,进一步使DNA聚合酶进行的引物延伸减到最少。引物的逐渐释放是模拟极稀DNA样品的扩增,其中在数个循环后再添加引物储备物,以便通过使早期非特异性引物延伸产物的形成最少来减少误扩增。
在本发明一个实施中,通过用含有疏水性试剂的溶液涂覆引物结合珠粒,来控制引物从珠粒的逐渐释放。在本发明另一实施中,通过用含有硅烷试剂的溶液使引物结合珠粒硅烷化,来控制引物从珠粒的逐渐释放。所述涂覆或硅烷化步骤使引物稳定性和核酸酶抗性进一步增加。所述珠粒是多孔珠粒、具有无孔核心的多孔珠粒或无孔珠粒。举例来说,这些珠粒是由多孔玻璃珠制成,这些玻璃珠用带有疏水性部分的烷氧基硅烷来硅烷化并经过封端。在一个实施例中,所述疏水性部分含有芳香族基团,例如三苯甲基。引物的纯化和标准化是使用平均直径在0.1到1.5mm范围内并且优选为约0.5到1.0mm的疏水化玻璃珠进行。
所披露的实施例提供了使扩增反应的组装进一步简化的试剂和方法。这些珠粒可逆地结合、标准化、储存和递送用于进行酶促扩增反应的引物。
可以使用非极性疏水性玻璃珠来完成纯化粗核酸,同时使每一珠粒结合标准化皮摩尔量的引物的任务。引物结合珠粒能够在扩增缓冲液中释放引物,无需抑制DNA聚合酶。此外,涂覆或硅烷化引物结合珠粒将大幅地提高结合的引物的逐渐释放,从而为热启动PCR提供一种新颖的途径。在所披露的实施例中,这些珠粒除履行纯化、标准化和储存引物的任务外,还经由逐渐地控制性释放引物来为热启动扩增反应提供途径。引物结合利用了使用5'-二甲氧基三苯甲基保护的氨基磷酸酯试剂进行的核酸合成,并且依赖于已知的含DMT的核酸与反相吸附剂的疏水性结合。引物结合珠粒提供了一种储存和保护引物的手段。生物学家终端用户可以洗脱可逆地结合于珠粒的核酸,或利用珠粒本身并将其用于扩增反应中。
在一个实施例中,将引物结合珠粒用于扩增反应中,尤其是聚合酶链反应(PCR)中以原位递送引物。在预扩增反应设置阶段期间,室温下,较少的引物在扩增缓冲液中从引物结合珠粒浸出可以防止其延伸。引物从引物结合珠粒释放优选在升高了反应温度之后发生,从而确保反应的特异性并使引物二聚体的扩增最少。因此,使用本发明的引物结合珠粒为热启动扩增提供了一种新颖途径。在本发明一个实施例中,涂覆所述引物结合珠粒使错误引发(mispriming)进一步减少或消除。在本发明另一实施例中,所述引物结合珠粒的硅烷化通过防止引物延伸在室温下发生,并且通过允许引物在扩增反应的预加热步骤和随后循环步骤的高温期间逐渐释放于溶液中,来进一步减少引物二聚体。
本发明的可用商业试剂盒含有扩增反应的任何组分,包括引物结合珠粒。其它可用的商业试剂盒含有珠粒,和在结合和脱盐步骤中或结合和纯化步骤中用以提供引物结合珠粒所需的缓冲液和试剂,以及在所得引物结合珠粒的涂覆或硅烷化中所需的试剂。本发明的以下方面,即珠粒制备、珠粒结合、引物结合珠粒的涂覆或硅烷化以及目标模板的热启动扩增反应,将予以进一步详细描述:
珠粒制备:
用于引物结合和递送的珠粒是由不溶于PCR所用试剂中的有机聚合物(聚丙烯酰胺、聚苯乙烯)或优选地无机聚合物(二氧化硅、玻璃)制成。珠粒是多孔珠粒,或具有无孔核心的多孔珠粒,或无孔珠粒。无孔珠粒的直径在0.5mm到1.5mm的范围内。优选直径是在1mm范围内,这一直径有助于珠粒的手工分配,同时提供足够的引物结合能力。优选珠粒是由多孔玻璃制成。多孔玻璃珠可以制成多种尺寸。如本文中所用,珠粒直径的范围为0.05mm到1.5mm,并且更优选为0.1到1mm。多孔意味着珠粒含有直径实质上类似的孔,其直径在介于100到4000埃的范围内。优选孔直径为约500埃。
通过用带有疏水性部分的烷氧基硅烷进行硅烷化,或用引入了与疏水性部分进一步反应的官能团(例如CO2H、NH2、OH、SH)的硅烷进行衍生化,来使玻璃珠(多孔或无孔的)疏水化。在一个实施例中,玻璃珠是由用硅烷共价修饰的可控孔径玻璃(controlled porous glass,CPG)制成的反相材料,其中所述硅烷将非极性基团引到珠粒表面上。这些硅烷可以选自包括烷基三烷氧基硅烷、二烷基二烷氧基硅烷、三烷基烷氧硅烷或烷基二(三烷氧基硅烷)的群组。烷基包括完全饱和的直链或支链烃。烷基可以是取代的或未取代的。适合的烷基取代基包括取代或未取代的芳香族基团、卤代低碳数烷基(例如三氟甲基)、-O-(烷基或芳基)、-S-(烷基或芳基)、N-(烷基或芳基)、-NC(O)-(烷基或芳基)。
在一个实例中,如图1中所示,用单芳基、二芳基和三芳基使本发明的珠粒官能化,其中X=烷基;Y=O、S、N;并且Z=烷基、芳基,并且R1、R2和R3独立地表示氢、烷基、芳基烷基、环烷基,或芳基,例如苯基、萘基、喹啉基,或者其它含氮、硫和/或氧的杂环;或具有例如卤基、硝基、烷氧基、低碳数烷基和芳基等取代基的芳基。在一个实例中,玻璃珠是由用硅烷修饰的CPG制成,所述硅烷用非极性疏水性部分进一步衍生化,例如巯基烷基硅烷或氨基烷基硅烷。在一个实例中,制备出(芳基)n甲基巯基烷基官能化的多孔玻璃珠。这些多孔玻璃珠与(巯基烷基)三烷氧基硅烷反应,其中烷氧基是甲氧基或乙氧基等。得到的(巯基烷基)珠粒与卤代甲基(芳基)n反应,以提供[(芳基)n甲基巯基烷基]珠粒,其中(i)n=1到3,n为等于或大于1的有限整数,并且ii)卤代基是氯代、溴代或碘代基团。所述[(芳基)n甲基巯基烷基]珠粒进一步用氯代三烷基硅烷、二烷基二烷氧基硅烷或三烷基硅烷基咪唑封端。或者,使用(芳基)n甲基巯基烷基-(三烷氧基)硅烷。三苯甲基的载量在1到150μmol/g的范围内,并且优选在5到50μmol/g的范围内。如本文中所用,术语烷基是指具有1到10个碳的直链(例如丙基)、支链或环状烷基,并且术语烷氧基是指甲氧基、乙氧基、丙氧基等。优选遵循公开的程序(海克尔(Heckel)等人,1998;巴德利(Badley)等人,1989),用可商购的(巯基丙基)三甲氧基硅烷将珠粒硅烷化,得到(巯基丙基)珠粒。这些(巯基丙基)珠粒用卤代甲基(芳基)n烷基化,得到[(芳基)n甲基巯基丙基]珠粒。卤代甲基(芳基)n的实例选自以下群组:苯甲基氯、1-氯代甲基萘、2-溴代甲基萘、氯代甲基联苯、二苯基甲基氯、三苯基甲基氯(三苯甲基氯)等。优选三苯甲基氯在三乙胺存在下与(巯基丙基)珠粒在二氯甲烷中反应,得到(三苯甲基巯基丙基)珠粒(T-珠粒,图2)。残留的游离硅烷醇基通过与二烷基二烷氧基硅烷(例如二甲基二甲氧基硅烷或三烷基硅烷基咪唑,或氯代三烷基硅烷与吡啶的混合物等)反应来封端。优选使用三甲基硅烷基咪唑。当与含DMT的引物或不含DMT的引物在适当结合缓冲液存在下一起保温时,得到的封端的T-珠粒可以可逆地结合皮摩尔量的引物。
无孔玻璃珠的制备包含以下步骤:
(a)使用机械方式、激光切除或化学方式增加珠粒的比表面。化学方式包括用HF的水溶液蚀刻玻璃表面,随后用氢氧化钠水溶液处理。所述玻璃珠优选为碱石灰珠粒,
(b)用带有疏水性部分L的硅烷使所述珠粒硅烷化。优选所述硅烷具有例如式(Y)4-n(L)n硅烷,其中(i)Y=烷氧基、卤基;(ii)n在1到3的范围内,n是有限整数;并且(iii)L=烷基-、芳基-或(芳基X)烷基-,其中芳基是例如苯基、苯甲基、联苯基、菲基或三苯甲基等基团,并且X=N、NC(O)、NC(S)、O或S;和(c)使用(三烷基)咪唑硅烷或二烷基二烷氧基硅烷将残留的表面硅烷醇基封端。
珠粒引物结合:
使用氨基磷酸5'-二甲氧基三苯甲基酯合成的核酸是呈其5'未保护形式(不含DMT的引物)或呈其5'-DMT保护形式(含DMT引物)(U.S.4,725,677)。在从固体支撑物裂解和脱保护后,通常使引物脱盐或纯化。脱盐或纯化操作是使用本文中所述的非极性疏水性珠粒进行的。
在从固体支撑物裂解和引物脱保护后,将反向引物与正向引物的粗溶液以大致等摩尔比例混合。将得到的引物溶液干燥,或优选用适当的结合缓冲液稀释。用结合缓冲液稀释除去了在进行引物结合步骤之前蒸发引物溶液的步骤。不能用结合缓冲液稀释引物溶液导致在珠粒表面处引物的结合较弱。在一个实施例中,可以使用本发明的珠粒同时进行粗引物溶液的脱盐和标准化,以得到引物结合珠粒。在另一实施例中,可以使用本发明的珠粒同时进行含DMT引物的粗溶液的纯化和标准化,以得到含DMT的结合珠粒。标准化的工艺描述了每一珠粒非共价结合10到50皮摩尔的每一引物,并且其中所述多个珠粒中的每一珠粒结合大致等量的引物。珠粒之间的相同结合使扩增反应之间具有较高可再现性。引物结合能力中所涉及的一些因素是结合缓冲液的离子强度、所述引物溶液与珠粒之间的接触时间,以及引物溶液中的引物浓度。
在一个实施例中,含DMT引物的纯化和标准化结合是使用T-珠粒进行的。含DMT引物通过其5'-二甲氧基三苯甲基进行可逆地结合,而截短的序列、盐和痕量的有机杂质未保留。截短的序列是指在引物合成期间未伸长并且随后封端的寡核苷酸。如果提供由含DMT的正向和反向引物组成的粗溶液,那么T-珠粒在包含以下步骤的工艺中纯化、结合并标准化引物对或多个引物对:
(a)用适当的结合缓冲液稀释粗溶液。结合缓冲液是由含有高浓度盐(例如氯化铵、乙酸铵、氯化钠、溴化钠、碘化钠)和0到10%二甲基甲酰胺或二甲亚砜的水溶液构成。举例来说,结合缓冲液的浓度高于约4到5M Na离子,通常pH在6.5到8的范围内。用所述结合缓冲液分别以1:1或1:2比率稀释粗引物溶液。
(b)将多个珠粒添加到(a)中制备的引物溶液中,并且将这些珠粒保温足够时间段,直到达到了每一引物的标准化结合;和
(c)用白蛋白酸脱除结合DMT的引物的三苯甲基,得到相应的结合不含DMT的引物的珠粒。这些结合不含DMT的引物的珠粒称为引物结合珠粒。DMT基团是使用1%到5%二氯乙酸(dichloroacetic acid,DCA)或三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)或三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的水溶液裂解。引物结合珠粒经历洗涤、排干和干燥。在室温下,引物结合可以在数分钟到数小时内发生。对于短序列(例如10到50个核苷酸)来说,时间相关性条件与序列无关,而是随装载温度、引物浓度和结合缓冲液的离子强度而变。举例来说,以下程序产生纯化的引物结合珠粒:(i)用乙醇灌注T-珠粒;(ii)用0.1M三乙基乙酸铵(triethylammonium acetate,TEAA;pH7.0)洗涤。(iii)用30%的NaCl水溶液稀释粗引物混合物,并将得到的混合物装载到多个经过灌注的珠粒上;(iv)用0.1M TEAA(pH7.0)洗涤。(v)用2.5%的二氯乙酸水溶液脱除结合含DMT引物的珠粒的三苯甲基;(vi)用0.1M TEAA(pH9.0)洗涤。
在一个实施例中,使用本发明的珠粒对不含DMT的引物进行的脱盐和标准化结合是在包含以下步骤的工艺中发生:(i)用结合缓冲液稀释不含DMT的引物的粗溶液,和(ii)添加多个珠粒并使所述珠粒与(i)中制备的溶液接触足够长的时间段,直到达到每一珠粒的最佳装载容量。随后对所得到的珠粒进行排干、洗涤和干燥。可用于引物脱盐和标准化的一种结合缓冲液组合物具有超过约5M钠离子,pH在5.5到8的范围内。在发生了结合后,彻底地洗涤这些珠粒以去除盐、有机污染物和未结合的寡核苷酸。
将引物结合珠粒干燥,随后在4℃到室温范围内的温度下储存,经过数月的时间,未检测到引物降解。同一批次的引物结合珠粒结合并递送相似量的引物,由此确保能随时间可再现地执行多个PCR反应。这样为使用相同引物进行大量PCR反应的诊断试剂盒提供一条便利的途径。引物结合珠粒排除了吸移错误的可能并且使污染减少,由此产生较低重复比率和较少的试剂浪费。引物结合珠粒可以按原样使用以将引物递送到扩增反应中,或者可以经历进一步涂覆或硅烷化。
在扩增反应期间的引物递送(释放)
在本发明一个实施例中,扩增反应是聚合酶链反应(PCR),其中至少一个引物并且优选两个引物通过引物结合珠粒原位递送。其它基于引物的核酸扩增方法可以得益于携带标准化引物的珠粒,包括(但不限于)连接酶链反应(Ligase Chain Reaction)(巴兰尼(Barany),1991)。引物结合珠粒可与使用10到100μL反应体积的标准热循环器相容。珠粒通常占据较小体积,在总PCR反应体积中不到2μl。举例来说,直径1.5mm的无孔碱石灰珠粒占据不到1.5μl的体积。
当在PCR循环中首次升高温度时,引物从珠粒释放,由此通过减少室温错误引发而为热启动PCR提供一种新颖途径。然而,当在扩增缓冲液中于室温下放置较长时间段时,引物缓慢地从其引物结合珠粒浸出。为了进一步减少非特异性扩增,本发明可以与减少非特异性扩增的其它方法(例如通过阻止引物结合于珠粒)一起使用。所用特定方法不是本发明的关键部分。
在一个实施例中,将携带两种标准化引物(反向和正向)的珠粒转移到含有DNA聚合酶、目标DNA和PCR缓冲液的PCR管中。使反应混合物经历变性、退火和伸长的多个循环,引起目标DNA的指数扩增。在另一实施例中,将各自携带一种引物的两个珠粒转移到含有DNA聚合酶和PCR缓冲液的PCR管中。使反应混合物经历变性、退火和伸长的多个循环,引起目标DNA的指数扩增。在又一实施例中,将携带多种标准化引物(反向和正向)的珠粒转移到在PCR缓冲液中含有DNA聚合酶和多个DNA目标的PCR管中。使反应混合物经历变性、退火和伸长的多个循环,引起所述多个DNA目标的指数扩增。
用引物结合珠粒进行的扩增反应可以通过测量反应混合物中双链DNA总量的增加来进行监测,并且依赖于当结合到双链DNA时溴化乙锭和其它DNA结合标记所呈现的荧光的增加。所测量的荧光取决于存在的双链DNA的总量,并且得益于由引物结合珠粒所提供的较少非特异性扩增。
引物结合珠粒的涂覆或硅烷化
引物结合珠粒在室温下以及在保温步骤期间将其结合的引物逐渐地释放到溶液中。由于这些引物在从珠粒释放之前不能延伸,故进一步防止引物在室温下浸出将确保较高的扩增反应特异性。
在本发明一个实施例中,通过使引物结合珠粒与含有疏水性部分的硅烷的溶液反应,来使引物结合珠粒硅烷化。优选所述硅烷是溶解在例如甲苯等有机溶剂中的三烷基烷氧基硅烷或二烷基烷氧基硅烷或三烷基硅烷基咪唑,其中烷基包括完全饱和的直链或支链烃。优选使用三甲基硅烷基咪唑(TMS)或二甲基二甲氧基硅烷(DMS)。硅烷化步骤抑制引物在室温下浸入扩增缓冲液中。这样又使非特异性产物减到最少,并且引起灵敏度较高的扩增反应。在另一实施例中,通过将引物结合珠粒与含有疏水性部分的聚烷基硅氧烷的溶液一起保温来涂覆引物结合珠粒。优选所述聚烷基硅氧烷是溶解于例如甲苯等有机溶剂中的聚二甲基硅氧烷。
在一个优选实施例中,本发明提供一种使用经过涂覆或硅烷化的引物结合珠粒扩增目标核酸的方法。用PCR扩增不到1000个拷贝的模板是很具挑战性的,并且受到非特异性扩增产物的合成的阻碍,这些非特异性扩增产物消耗引物储备物并降低扩增子的产率。与使用吸移到PCR缓冲液中的引物进行的扩增反应相比较,经过涂覆的引物结合珠粒或硅烷化的引物结合珠粒的使用使非特异性扩增产物、特别是引物二聚体减到最少。值得注意的是,在扩增过程早期引物二聚体的形成会损害聚合酶链反应的特异性。由涂覆或硅烷化步骤所提供的引物的逐渐可控释放在第一个扩增循环期间产生较低浓度的引物,并且促使引物结合于目标核酸而不是彼此结合。这样允许更有效地使用DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷和其它反应组分来扩增目标核酸,并使引物二聚体延伸最少。
对引物结合珠粒进行涂覆或硅烷化将进一步增加引物的稳定性和核酸酶抗性。本领域的技术人员遵循本文中提供的指导,可以常规地从所描述的化合物类别中凭经验选出具有所需稳定性的涂层。本发明的经过涂覆或硅烷化的引物结合珠粒特别适用于动力学PCR,因为它们不仅减少所形成的引物二聚体的量,而且还延迟可检测量的引物二聚体的形成。珠粒可用于推导PCR反应,尤其是引物未经过良好设计和/或反应条件并非最佳的那些。延迟引物二聚体形成直到目标序列显著增加之后为止,能够不必监测目标序列的扩增,并且使引物二聚体引起的干扰减到最少。
本发明将通过参照实例进一步详细地描述,这些实例各自是对本发明实施例的说明,并且不限制本发明的范围。
实例
以下实例中进一步描述珠粒的制备、皮摩尔量引物的结合和纯化、引物结合珠粒的涂覆或硅烷化以及这些珠粒在扩增反应中的应用。根据以上教导内容,有可能对珠粒制备、珠粒涂覆和PCR应用进行许多修改和变更。预期以下实例是不详尽的,或不打算将本发明局限于所披露的精确形式。这些实例用于说明本发明并且不应视为对本发明的限制。
材料与方法
在Dr Oligo合成仪(拜力公司(Biolytic Lab Performance))上,使用5'-DMT保护的核苷酸氨基磷酸氰基乙酯合成模板和引物。核酸合成完成后,将最终的5'-DMT基团留在原处或脱保护,得到不含DMT的引物。使用丁胺:H2O(1:3,30μL,15min)使引物从其固体支撑物裂解,随后使用氢氧化铵(450μL,2小时,75℃)脱保护。使用样品(50μL)测量光学密度并计算寡核苷酸浓度(pmol/μl)。利用离子交换HPLC(IEx-HPLC)分析反向和正向引物,定量并以等摩尔比例混合。
为了说明珠粒特性,选择TaqPol聚合酶,已知这种聚合酶可以扩增在较低预扩增温度期间发生的非特异性杂交反应。用吸移到溶液中或结合于珠粒的引物起始扩增反应。在不进一步加工的情况下,通过IEx-HPLC,使用在线UV检测器(海伍德(Hayward)等人,1996)分析PCR产物。HPLC系统包含1090HP、设置在55℃的柱式加热炉、设置在260nm的可变波长UV检测器。使用Dionex柱“BioLC DNAPac PA-100”进行分析。注射体积为25μL。所述柱以缓冲液A(0.1M TEAA,20%ACN,pH6.5)平衡并以缓冲液B梯度(2.5M NH4Cl,10%乙腈,pH6.5)洗脱。以下为用于分析引物和PCR反应的梯度表。
实例1:多孔T-珠粒的制备
将数千个多孔玻璃珠(1mm平均尺寸,孔径)放入二氯甲烷(DCM,2mL)中。将含3-巯基丙基三甲氧基硅烷(10mg)的DCM(1mL)缓慢添加到珠粒中。小心地振荡这些珠粒4天,得到(巯基丙基硅烷基)珠粒。添加含三乙胺(25μL)和三苯甲基氯(75mg)的DCM(1mL),并在室温下小心地振荡珠粒2天。添加三甲基硅烷基咪唑(50μL)并振荡反应混合物过夜。过滤T-珠粒(三苯甲基珠粒),依序用丙酮、甲醇、水随后丙酮洗涤,并干燥。
实例2:引物结合于T-珠粒
使用以下溶液制备低聚物结合溶液(Oligo Binding Solution,OBS):(a)含DMT引物溶液,通过将脱保护的正向引物的溶液与脱保护的反向引物的溶液以等摩尔比例混合来制备。使用NH4OH-DMF(15:5)溶液将混合引物从其初始浓度稀释到其工作浓度。引物的工作浓度为每微升9pmol的各引物。(b)结合缓冲液,通过将30%NaCl溶解于水中来制备。
通过将1体积的含DMT引物溶液与1体积的结合缓冲液混合来制备OBS。最终OBS浓度如下:7.5%NH4OH、2.5%DMF、15%NaCl和4.5pmol的各引物/μl。
在结合步骤之前,用乙醇(10μl/珠粒)灌注T-珠粒,排干,随后用三乙基乙酸铵溶液[TEAA0.1M,pH7;10μl/珠粒]洗涤,并排干。将20个经过灌注的T-珠粒与150μL的OBS一起振荡30分钟。用TEAA(0.1M,pH7,10μl/珠粒)洗涤所得到的含DMT引物的珠粒两次,并排干。用2.5%的三氯乙酸水溶液(10μl/珠粒)去除DMT。将这些珠粒振荡60秒,随后排干。用TEAA(0.1M,pH7,10μl/珠粒)洗涤所得到的引物结合珠粒两次,并排干。干燥引物结合珠粒,随后用于PCR反应中。可以分别如实例3和4中所述进一步对其进行硅烷化或涂覆。
通过注射已知量的引物并针对所得到的引物HPLC峰积分面积作图,来制定引物标准曲线校准。通过IEx-HPLC,在用40%的乙腈水溶液洗脱引物之后,定量引物与T-珠粒的结合。
实例3:引物结合珠粒的硅烷化
使引物结合珠粒与5%三甲基硅烷基咪唑(TMS)的甲苯溶液(10μl/珠粒)反应24小时。反应期后,通过过滤去除TMS的甲苯溶液,并使珠粒在室温下干燥。
实例4:引物结合珠粒的涂覆
用5%聚二甲基硅氧烷的甲苯溶液(10μl/珠粒)涂覆引物结合珠粒,保持20分钟。反应期后,通过过滤去除聚二甲基硅氧烷的甲苯溶液,并使珠粒在室温下干燥。
实例5:比较性错误引发研究
通过使用在3'端含有大量G和C的引物FW21和RV22来强调珠粒在热启动扩增反应中所起的作用。这些引物被设计成确保甚至在适合地严格扩增条件下仍能通过6个3'末端GC配对的形成而引起错误引发。事实上,在手工热启动实验中在92℃下添加两种引物不会除去错误引发。反向和正向引物以及107-mer模板的核苷酸序列如下,以3'到5'方向定向:FW21(SEQ ID NO:1):CGGCGGGGTTCCGTGTCGAAC;RV22(SEQ IDNO:2):CCGCCGGAC GAGACATAGCACG;107-mer模板(SEQ ID NO:3):
CAAGCTGTGCCTTGGGGCGGCTTGGGGCATGGACATTGAGAATTTGGATCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGACCTCGACAGGCGGCCTGCTCTGTATCGTGC。使用含引物的溶液或引物结合珠粒进行所述107-mer模板的扩增。扩增是在含有以下试剂的50μl反应体积中进行:拷贝数在107到1010个拷贝范围内的107-mer模板DNA;0.2μM各引物(10pmol);200μM各dATP、dCTP和dGTP;600μM的dTTP;MnOAc(25mM,5μL);1个单位的TaqPol DNA聚合酶。在用引物结合珠粒执行反应的情况下,添加2μl水代替含引物的溶液来达到50μL的反应体积。
反应循环包含在95℃下预加热5分钟,随后包含变性(94℃,30秒)、退火(69℃,30秒)、延伸(72℃,30秒)30个循环。最后一个循环之后在72℃下再保持7分钟以确保完全延伸。
通过离子交换HPLC分析PCR产物(扩增子,引物二聚体)和引物。使用含引物的溶液进行的PCR与使用引物结合珠粒进行的PCR的比较结果提供于表1中,并且以PCR产物的积分峰报导。这些数据表明,引物结合珠粒使引物二聚体的形成显著减少。当通过延迟引物二聚体的形成进行无模板反应时,也观察到引物结合珠粒相比含引物溶液的有益作用。
表1:与使用吸移到溶液中的引物进行的扩增相比,引物结合珠粒的使用减少了非特异性扩增产物,并使扩增子产率增加(通过对其HPLC峰面积进行积分来测量)。
实例6:使用硅烷化引物结合珠粒进行的热启动扩增
反向引物(SEQ ID NO:4)、正向引物(SEQ ID NO:5)和106-mer模板(正向序列:SEQ ID NO:6)的核苷酸序列如下,以3'到5'方向定向:(SEQ ID NO:4):CCCGATACAGAGCAGAGGCG;(SEQ ID NO:5):CAAGCTGTGCCTTGGGTGGC;(SEQ ID NO:6);CAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGAGAATTTGGATCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGG。3'末端序列被设计成具有连续4个或4个以下3'末端G或C碱基以便使错误引发最少。使用含引物的溶液,或使用携带反向和正向引物的三甲基硅烷基咪唑硅烷化的T-珠粒在以下PCR条件下进行10个和100个拷贝的106-mer模板的扩增:在94℃下进行的一个初始变性循环,3分钟;在95℃下变性20秒,在62℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒,共30个循环。当将引物吸移到溶液中时,100个拷贝的模板的扩增产生引物二聚体(将8.6分钟标识为其HPLC峰)和扩增子(在9.5分钟时的峰)。在6.4分钟时仍没有引物(参看图3)。当使用硅烷化的引物结合珠粒时,在100个拷贝的模板处没有观察到引物二聚体峰(参看图4a)。同样,用同一批次的硅烷化的引物结合珠粒扩增10个拷贝的模板产生扩增子(在9.4分钟时的峰);没有观察到引物二聚体峰(参看图4b)。所观察的残留引物为在6.4分钟时洗脱的峰。
实例7:引物从硅烷化的引物结合珠粒逐渐释放的证明
分别如实例3和4中所述,用5%的三甲基硅烷基咪唑的甲苯溶液(TMS)或5%的二甲基二甲氧基硅烷的甲苯溶液(DMS)使(Seq ID4和5)引物结合珠粒硅烷化。将(DMS)或(TMS)引物结合珠粒放入PCR缓冲液(50μL)。在每一步骤后,通过离子交换HPLC分析PCR缓冲液,丢弃并用50μL新PCR缓冲液更换。步骤1:室温下,15分钟。步骤2:预加热步骤后;94℃,5分钟。步骤3:在执行三个PCR循环后。步骤4:再执行三个PCR循环后。步骤5:再执行五个PCR循环后。步骤6:通过与40%乙腈/1%叔丁基胺的水溶液一起在94℃下加热15分钟来洗脱残留的经结合引物。通过在每一步骤后对离子交换峰面积进行积分,来定量PCR缓冲液中引物的释放。每一步骤的释放以总引物释放的百分比报导于表2中。
表2:用DMS或TMS硅烷化的引物结合珠粒经历超过10个PCR循环时引物逐渐释放的证明
疏水化的玻璃珠有助于粗引物溶液的纯化和标准化。它们通过需要最少试剂制备和操作人员参与来简化核酸扩增技术。当在PCR循环中温度首次升高时,引物从珠粒释放,由此通过减少室温错误引发而为热启动PCR提供一种新颖途径。通过对引物结合珠粒进行涂覆或硅烷化,来进一步控制溶液中引物的逐渐释放。无引物二聚体的扩增表明,结合后硅烷化步骤防止引物在所用反应条件下的室温浸出,并且使引物的逐渐释放能在多个PCR循环中发生。
Claims (26)
1.一种方法,包含:
a)提供具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒;和
b)在酶促反应期间将所述寡核苷酸从所述珠粒逐渐释放。
2.根据权利要求1所述的方法,包括通过将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在所述珠粒上来纯化粗寡核苷酸溶液,从而制备所述珠粒的初始步骤。
3.根据权利要求2所述的方法,其中纯化包括使粗寡核苷酸溶液脱盐和捕获标准化量的寡核苷酸。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸由皮摩尔量的引物组成。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的无孔玻璃制成。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的多孔玻璃制成。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述珠粒是由具有非极性疏水性表面的多孔或无孔玻璃制成,所述疏水性表面包括选自C3到C20的线性或分支烷基链、芳基、苯甲基、萘基、菲基和三苯甲基。
8.根据权利要求1所述的方法,另外包括通过使玻璃珠与硅烷反应来制备所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒的初始步骤,其中所述硅烷包括选自由以下各项组成的群组的至少一种:三烷基(烷氧基)硅烷、二烷基(二烷氧基)硅烷、芳基(烷基)(二烷氧基)硅烷、芳基(三烷氧基)硅烷、二芳基(二烷氧基)硅烷、三芳基(烷氧基)硅烷、氟代烷基烷氧基硅烷和烷基二(三烷氧基硅烷)。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述珠粒包括非极性疏水性表面,所述疏水性表面包括表面(芳基)n-X-烷基,其中所述芳基选自由苯基、苯甲基、联苯基、萘基、三苯甲基组成的群组;X=C、O、S、SC(O)N、OC(O)N、NC(O)和N;并且n=1到3,n是等于或大于1的有限整数。
10.根据权利要求2所述的方法,其中纯化粗寡核苷酸溶液包括结合含有至少一种污染物的所述粗溶液中具有5'-疏水性部分的寡核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述5'-疏水性部分是4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)并且所述污染物是不含DMT的核酸。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸包括至少一个反向引物和一个正向引物。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述标准化、非共价结合的寡核苷酸另外包括至少一个核酸探针。
14.根据权利要求10所述的方法,另外包括在将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在所述珠粒上之后
i)将所述珠粒暴露于含有10%到100%甲醇、乙醇、乙腈或丙酮的水溶液;和
ii)随后,将所述珠粒暴露于含有0.1M到1.0M浓度的单烷基乙酸铵、二烷基乙酸铵、三烷基乙酸铵的pH范围为6到9.5的溶液。
15.根据权利要求10所述的方法,另外包含用结合缓冲液稀释所述粗溶液,并将所得到的溶液与多个经过灌注的珠粒混合,从而得到结合含DMT的寡核苷酸的珠粒。
16.根据权利要求15所述的方法,另外包括用洗涤缓冲液洗涤所述结合含DMT的寡核苷酸的珠粒,所述洗涤缓冲液去除污染物,但不去除结合的含DMT的寡核苷酸。
17.根据权利要求15所述的方法,另外包含将所述结合的含DMT的寡核苷酸的DMT基团裂解,从而得到结合不含DMT的寡核苷酸的珠粒的步骤。
18.根据权利要求15所述的方法,其中将每体积2:1到1:2体积的所述结合缓冲液添加到所述粗溶液中。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒包括具有非共价结合的不含DMT的寡核苷酸的珠粒,并且所述方法另外包括用聚烷基硅氧烷溶液涂覆所述珠粒以得到经过涂覆的寡核苷酸结合珠粒。
20.根据权利要求1所述的方法,其中所述具有标准化、非共价结合的寡核苷酸的珠粒包括具有非共价结合的不含DMT的寡核苷酸的珠粒,并且所述方法另外包括处理所述珠粒以得到硅烷化的寡核苷酸结合珠粒。
21.根据权利要求1所述的方法,其中所述珠粒包含平均直径为约0.5到1.5mm的无孔玻璃珠。
23.一种热启动PCR的方法,包含:
a)提供在珠粒表面上具有标准化、非共价键接的引物的珠粒;和
b)在温度循环变化期间,逐渐释放所述引物,其中所述珠粒用涂层涂覆,所述涂层抑制随后施加的较高温度。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述珠粒具有皮摩尔量的引物。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述珠粒是具有非极性疏水性表面的玻璃。
26.一种珠粒,包括:
具有非共价结合的引物的涂层;和
用于在温度循环变化期间将所述引物从所述珠粒逐渐释放的装置。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130529 |