CN103114116B - 生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法 - Google Patents
生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用动物软骨生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和骨钙粉的制备方法,属于生物技术领域。该方法的步骤为,将动物软骨粉碎、酶解、分离得到清液和沉淀;清液经过脱盐、脱色、脱腥、超滤分离、浓缩和喷雾干燥,分别获得硫酸软骨素、蛋白胨和胶原肽;沉淀经过洗涤、氧化脱色、干燥和粉碎得到软骨钙粉。本发明工艺的特点是连续获得蛋白胨、胶原肽、硫酸软骨素和软骨钙粉,实现了动物软骨资源的高效利用,不仅降低了生产成本,也减少了废液、废渣的产生及环境的污染,该技术可以实现产业化。本发明解决硫酸软骨素制备过程中的胶原肽及软骨钙回收,以及生产周期长且成本高等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用动物软骨生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和骨钙粉的制备方法,属于生物技术领域。
背景技术
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是由葡萄糖醛酸(GlcA)和不同硫酸化取代的N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)组成的长链生物大分子聚合物,属于糖胺聚糖类物质,广泛存在于猪、牛、羊、鳄鱼、鲨鱼等软骨组织中。具有降血脂、抗肿瘤、抗衰老、治疗关节炎及神经痛等作用,是药品、食品、化妆品、保健品等领域重要的生化原料。蛋白胨主要作为微生物的培养基,是重要的生化试剂。胶原肽易于消化吸收,具有保护胃粘膜,防止胃溃疡,促进钙吸收,防治骨质疏松,促进皮肤胶原代谢,抑制血压上升,以及降低血清中胆固醇含量等多方面的生理功能,是食品、医药领域重要的添加剂,市场需求量不断增加,应用前景广阔。
利用各种动物来源的软骨为原料,单一生产不同结构的硫酸软骨素越来越不适应当今社会发展要求,如何高效利用生物资源、降低环境污染并提高软骨的综合利用率,已经成为社会关注的热点话题。鉴于软骨中含有较高的硫酸软骨素、蛋白、胶原肽及活性钙等成分,充分利用各种活性成分并分别制成纯度较高的系列产品,可以明显提高软骨在食品、医药领域的应用价值。在动物软骨资源利用发面,天津科技大学陈宁(专利申请号:200410072346.9)以及南京工业大学杨文革等(专利申请号:201110098394.5)曾采用酶法提取硫酸软骨素,虽然解决了碱法生产硫酸软骨素易造成生产周期长、产品质量差和环境污染等弊端,但没有同时解决蛋白和胶原肽产品回收技术问题;日照众山生物科技有限公司(专利申请号:200710113240.2)虽采用酶法和超滤技术获得硫酸软骨素,但也缺乏回收蛋白和胶原肽工艺技术;浙江澳兴生物科技有限公司(专利申请号:200910154187.X)虽报导了从鲨鱼中提取鲨鱼软骨素方法,但没有综合利用鲨鱼胶原蛋白和鲨鱼骨钙;青岛大学高华等(专利申请号:200610043357.3)曾采用酶法从软骨中连续提取硫酸软骨素和蛋白,但由于采用大量乙醇沉淀工艺、造成成本高,且没有解决回收胶原肽及软骨钙技术问题;上海阿敏生物技术有限公司(专利申请号:200710040969.1)采用酶法从牛骨中联产胶原蛋白和硫酸软骨素,但没有进一步回收骨中活性钙;郭秀明和曹荣军虽采用复合酶法生产动物软骨钙粉、软骨素和胶原蛋白的技术(专利申请号:200610044758.0和201010258319.6),但采用乙醇沉淀技术,且不能将蛋白胨和胶原肽有效分离,生产周期长且成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用动物软骨生产硫酸软骨素并联产胶原肽、蛋白胨和软骨钙粉的提取制备方法,解决硫酸软骨素制备过程中的胶原肽及软骨钙回收,以及生产周期长且成本高等问题。
为了实现上述目的,本发明的技术方案是:
一种生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,将动物软骨粉碎、酶解、分离得到清液和沉淀(骨渣);清液经过脱盐、脱色、脱腥、超滤分离、浓缩和喷雾干燥,分别获得硫酸软骨素、蛋白胨和胶原肽;沉淀经过洗涤、氧化脱色、干燥和粉碎得到软骨钙粉。具体工艺步骤如下:
(1)将动物软骨进行粉碎,粒度为20-60目,加入纯化水和氯化钠搅拌均匀,并升温到75-95℃预处理0.5-2小时;
(2)将步骤(1)中料液冷却,利用氢氧化钠将其调节pH值6.5-9.0,用复合蛋白酶进行酶解,酶解温度为48-55℃,酶解时间为4-12h;
其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶(胶原酶)混合而成,各自的含量范围分别占动物软骨干重的0.5%-1.0%、0.5%-1.0%和1.0-2.0%;
(3)将步骤(2)中的料液pH值调至4.0-6.5,在80-90℃加热将酶灭活30-60分钟;
(4)将步骤(3)中的料液分离,分别获得清液和沉淀(骨渣);
(5)将步骤(4)中的清液进行超滤分离,得到超滤内液和超滤外液,超滤外液为含有胶原肽的水溶液,超滤内液为含有硫酸软骨素和蛋白胨的水溶液,超滤外液经纳滤脱盐浓缩后,再经精制和喷雾干燥,得到胶原肽;
(6)向步骤(5)中超滤内液加入食品级酒精,至酒精最终体积浓度为60-80%,静置2-6小时得到沉淀,得到沉淀和上清液,沉淀经氧化(H2O2)脱色后,无水乙醇脱水,经减压干燥得到硫酸软骨素;上清液经浓缩后,喷雾干燥得到蛋白胨。
在步骤(1)中,动物软骨重量与加入纯化水的体积比例是1:3-8(W/V),加入氯化钠的量为动物软骨重量的1%-3%(W/W)。
在步骤(2)中,复合蛋白酶的加酶量为动物软骨干重的0.3-3%(W/W)。
在步骤(3)中,所述的料液在灭酶前,需要调整pH值至4.0-6.5。
在步骤(4)中,所述的料液分离为离心分离或过滤分离。
在步骤(4)中,所述的沉淀(骨渣)经过纯水洗涤、氧化脱色(H2O2)、干燥和粉碎,获得软骨钙粉。
在步骤(5)中,所述的超滤分离为超滤膜分离或树脂分离,超滤膜分离所用膜截留分子量为10kD-30kD。
在步骤(5)中,所述的精制,是指通过纳滤脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥获得不同分子量胶原肽。
在步骤(6)中,所述的上清液中含有酒精和蛋白胨,经过减压浓缩蒸馏,回收酒精后,残余物经喷雾干燥得到蛋白胨。
本发明的优点在于:
1、本发明通过采用生物酶解并结合纳滤、超滤和喷雾干燥等先进产业化技术,可以连续分离获得软骨素、蛋白胨、胶原肽及软骨钙,该联产工艺比单产工艺设备利用率高,节约能源和辅料,显著降低生产成本。
2、本发明利用生物酶法制备系列生物产品,条件温和,能耗低,产品纯度高、质量稳定可靠。
3、本发明生产出的硫酸软骨素各项指标均符合最新国家标准、美国标准和欧洲标准,硫酸软骨素含量高达98%以上。
4、本发明制备的胶原肽的分子量为300-3000道尔顿,容易被人体吸收利用。
5、本发明实现了软骨资源的高效综合利用,极大地减少废水排放和环境污染问题。
6、本发明从动物软骨中连续大量获得硫酸软骨素、蛋白胨、胶原肽和骨软骨钙粉,可以进行吨级规模的产业化生产运行,技术可靠、产品质量稳定,实现了动物骨类资源的高效利用。经过专利检索,目前国内外还没有该类工艺技术应用于工业化生产。
附图说明
图1为本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素的红外光谱图;
图2为本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素二糖组成分析HPLC谱图;
图3为本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素醋酸纤维素膜电泳图;
图4为本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素多角激光散射仪分子量分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将100kg鲨鱼软骨(包括鲨翅骨、鲨脊椎骨和鲨头骨)粉碎,粒度为20目,加入500kg纯化水,加入氯化钠3kg,升温到90℃,保持0.5小时,降温至51℃,利用氢氧化钠将其pH调整至8.5,然后加入3kg的复合蛋白酶(其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶混合而成,各自的含量分别为软骨干重的0.5%、0.5%和1%),在51℃下搅拌酶解8h,利用盐酸将料液调整至pH=4.5,升温到90℃灭酶30min,过滤分离后得到骨渣和清液,骨渣经纯水洗涤、氧化脱色(H2O2)、干燥和粉碎后得到软骨钙粉。清液经20kD超滤膜分离,获得胶原肽溶液和粗硫酸软骨素溶液。胶原肽溶液经过纳滤(截留分子量300Da)脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥,获得无腥味的胶原肽(分子量1.2-2.8kD)。粗软骨素溶液加入食品级酒精至酒精最终体积浓度为70%,静置2-4小时得到沉淀,经无水乙醇沉淀得到硫酸软骨素粗品,该粗品经过进一步氧化(H2O2)脱色后,无水乙醇脱水,减压干燥获得精品鲨鱼硫酸软骨素(分子量25-65kD)。将上述体积浓度为70%的酒精沉淀后上清液进行减压浓缩回收酒精,残余物经过喷雾干燥得到鲨鱼蛋白胨。
实施例2
将100kg牛软骨(包括牛鼻骨和牛喉管)粉碎,粒度为60目,加入500kg纯化水,加入氯化钠1kg,升温到80℃,保持1小时,降温至48℃,利用氢氧化钠将其pH调整至8.5,然后加入2kg的复合蛋白酶(其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶混合而成,各自的含量为软骨干重的0.5%,0.5%和1.0%),在48℃下搅拌酶解6h,利用盐酸将料液pH调整至6.0,升温到90℃灭酶40min,过滤分离后得到骨渣和清液,骨渣经纯水洗涤、氧化脱色(H2O2)、干燥和粉碎后得到高骨钙粉。清液经10kD超滤膜分离,获得胶原肽溶液和粗硫酸软骨素溶液。胶原肽溶液经过纳滤(截留分子量300Da)脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥,获得牛胶原肽(分子量1.8-7.2kD)。粗软骨素溶液加入食品级酒精至酒精最终体积浓度为70%,静置3-5小时得到沉淀,经无水乙醇沉淀得到硫酸软骨素粗品,该粗品经过进一步氧化(H2O2)脱色后,无水乙醇脱水,减压干燥获得牛硫酸软骨素(分子量15-35kD)。将上述体积浓度为70%的酒精沉淀后上清液进行减压浓缩回收酒精,残余物经过喷雾干燥得到牛蛋白胨。
实施例3
将100kg鲨鱼软骨(包括鲨翅骨、鲨脊椎骨和鲨头骨)粉碎,粒度为40目,加入600kg纯化水,加入氯化钠2kg,升温到95℃,保持0.5小时,降温至55℃,利用氢氧化钠将其pH调整至7.5,然后加入2.5kg的复合蛋白酶(其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶混合而成,各自的含量分别为软骨干重的1.0%,0.5%和1.5%),在55℃下搅拌酶解4h,利用盐酸将料液调整至pH=5.0,升温到80℃灭酶60min,过滤分离后得到骨渣和清液,骨渣经纯水洗涤、氧化脱色(H2O2)、干燥和粉碎后得到软骨钙粉。清液经20kD超滤膜分离,获得胶原肽溶液和粗硫酸软骨素溶液。胶原肽溶液经过纳滤(截留分子量300Da)脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥,获得无腥味的胶原肽(分子量0.7-2.2kD)。粗软骨素溶液加入食品级酒精至酒精最终体积浓度为60%,静置2-4小时得到沉淀,经无水乙醇沉淀得到硫酸软骨素粗品,该粗品经过进一步氧化(H2O2)脱色后,无水乙醇脱水,减压干燥获得精品鲨鱼硫酸软骨素(分子量37-65kD)。将上述体积浓度为60%的酒精沉淀后上清液进行减压浓缩回收酒精,残余物经过喷雾干燥得到鲨鱼蛋白胨。
实施例4
将100kg牛软骨(包括牛鼻骨和牛喉管)粉碎,粒度为20目,加入400kg纯化水,加入氯化钠2kg,升温到75℃,保持2小时,降温至50℃,利用氢氧化钠将其pH调整至9.0,然后加入2kg的复合蛋白酶(其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶混合而成,各自的含量分别为软骨干重的0.5%,1%和1%),在48℃下搅拌酶解12h,利用盐酸将料液pH调整至5.5,升温到85℃灭酶30min,过滤分离后得到骨渣和清液,骨渣经纯水洗涤、氧化脱色(H2O2)、干燥和粉碎后得到高骨钙粉。清液经10kD超滤膜分离,获得胶原肽溶液和粗硫酸软骨素溶液。胶原肽溶液经过纳滤(截留分子量300Da)脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥,获得牛胶原肽(分子量0.6-13kD)。粗软骨素溶液加入食品级酒精至酒精最终体积浓度为80%,静置3-5小时得到沉淀,经无水乙醇沉淀得到硫酸软骨素粗品,该粗品经过进一步氧化(H2O2)脱色后,无水乙醇脱水,减压干燥获得牛硫酸软骨素(分子量12-35kD)。将上述体积浓度为80%的酒精沉淀后上清液进行减压浓缩回收酒精,残余物经过喷雾干燥得到牛蛋白胨。
上述仅为本发明的具体实施例,但本发明的设计构思并不局限于此,凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
从图1可看出,在3506cm-1处为多糖类物质O-H伸缩振动,2908cm-1处为糖环C-H键的伸缩振动;1652cm-1为葡萄糖醛酸中C=O伸缩振动,1563cm-1为氨基半乳糖中N-H弯曲振动,1414cm-1和1375cm-1处为羧基C-O伸缩振动和羟基O-H变角振动峰,1067cm-1和1131cm-1为糖环内醚C-O-C伸缩振动峰;1256cm-1处为硫酸酯基中S=O伸缩振动峰,823cm-1为糖分子中乙酰氨基半乳糖C6位羟基被硫酸基取代C6-O-S伸缩振动峰,表明该多糖是硫酸软骨素C。
从图2可知,硫酸软骨素经过软骨素酶ABC(EC4.2.2.4)完全降解后,经HPLC分析(色谱柱Agilent XDB-C18柱),产物主要含有3个组分,经过与标准品比较证明,21.92min为不饱和葡萄糖醛酸(ΔUA)与6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc6S)组成的二糖(ΔUA-GalNAc6S,即△Di-6S);23.22min为不饱和葡萄糖醛酸与4-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc4S)组成的二糖(ΔUA-GalNAc4S,即△Di-4S);29.97min为不饱和2-硫酸葡萄糖糖醛酸(ΔUA2S)与6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc6S)组成的二糖(ΔUA2S-GalNAc6S,即△Di-2S6S)。△Di-2S6S是鲨鱼硫酸软骨素中特有的二糖成分,硫酸软骨素C中△Di-6S含量较高,而硫酸软骨素A中△Di-4S含量较高,通过计算它们之间的比例,可以确定原料来源。
图3为本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素C与其他来源制备的结构不同的硫酸软骨素(CSD为鲨鱼头骨纯化的硫酸软骨素D;CSA为从猪软骨制备的硫酸软骨素A;CSC为Sigma公司鲨鱼硫酸软骨素C标准品;HP为猪内肠肝素;CSB为猪皮中制备的硫酸软骨素B)电泳分析结果。从图3中可以看出,本发明制备的硫酸软骨素(Shark)纯度高,且电泳迁移率和Sigma公司产品一直,表明为鲨鱼硫酸软骨素C。
从图4可以看出,本发明制备的鲨鱼硫酸软骨素纯度较高,经过多角激光散射仪分析,其绝对峰位分子量为5.2万道尔顿,其分布范围是3.7-6.5万道尔顿。
本发明制备的鲨鱼胶原肽氨基酸组成和相对比例见表1。从表1数据可知,本发明的鲨鱼软骨来源的胶原肽中甘氨酸含量最高(20.12%),丙氨酸次之(14.19%),且脯氨酸含量达11.5%,表明其为胶原物质。
表1鲨鱼胶原肽氨基酸组成分析结果
实施例结果表明,本发明将动物软骨粉碎、酶解、分离得到清液和沉淀,清液经过脱盐、脱色、脱腥、超滤分离、浓缩和喷雾干燥,获得硫酸软骨素、蛋白胨和胶原肽,沉淀经过洗涤、氧化脱色、干燥和粉碎得到软骨钙粉。该发明工艺的特点是连续获得蛋白胨、胶原肽、硫酸软骨素和软骨钙粉,实现了动物软骨资源的高效利用,不仅降低了生产成本,也减少了废液、废渣的产生及环境的污染,该技术可以实现产业化。
Claims (6)
1.一种生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于,将动物软骨:鲨鱼软骨或牛软骨粉碎、酶解、分离得到清液和沉淀;清液经过脱盐、脱色、脱腥、超滤分离、浓缩和喷雾干燥,分别获得硫酸软骨素、蛋白胨和胶原肽;沉淀经过洗涤、氧化脱色、干燥和粉碎得到软骨钙粉;具体工艺步骤如下:
(1) 将动物软骨进行粉碎,加入纯化水和氯化钠搅拌均匀,并升温到75-95℃预处理0.5-2小时;
在步骤(1)中,动物软骨重量与加入纯化水的体积比例是1:3-8,加入氯化钠的量为动物软骨重量的1% - 3%;
(2) 将步骤(1)中料液冷却,利用氢氧化钠将其调节pH值6.5-9.0,用复合蛋白酶进行酶解,酶解温度为48-55℃,酶解时间为4-12 h;
其中,复合蛋白酶为胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和胶原蛋白水解酶混合而成,各自的含量范围分别占动物软骨干重的0.5%-1.0%、0.5%-1.0%和1.0-2.0%;
在步骤(2)中,复合蛋白酶的加酶量为动物软骨干重的0.3-3%;
(3) 将步骤(2)中的料液pH值调至4.0-6.5,在80-90℃加热将酶灭活30-60分钟;
(4) 将步骤(3)中的料液分离,分别获得清液和沉淀;
在步骤(4)中,所述的沉淀经过纯水洗涤、氧化脱色、干燥和粉碎,获得软骨钙粉;
(5) 将步骤(4)中的清液进行超滤分离,得到超滤内液和超滤外液,超滤外液为含有胶原肽的水溶液,超滤内液为含有硫酸软骨素和蛋白胨的水溶液,超滤外液经纳滤脱盐浓缩后,再经精制和喷雾干燥,得到胶原肽;
在步骤(5)中,所述的精制,是指通过纳滤脱盐后,采用活性炭脱色、离子交换树脂除腥,超滤分离浓缩后喷雾干燥获得不同分子量胶原肽;
(6) 向步骤(5)中超滤内液加入食品级酒精,至酒精最终体积浓度为60-80%,静置2-6小时得到沉淀,得到沉淀和上清液,沉淀经氧化脱色后,无水乙醇脱水,经减压干燥得到硫酸软骨素;上清液经浓缩后,喷雾干燥得到蛋白胨。
2.根据权利要求1所述生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于:在步骤(3)中,所述的料液在灭酶前,用盐酸调整pH值至4.0-6.5。
3.根据权利要求1所述生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于:在步骤(4)中,所述的料液分离为离心分离或过滤分离。
4.根据权利要求1所述生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于:在步骤(5)中,所述将步骤(4)中的清液进行的超滤分离为超滤膜分离,超滤膜分离所用膜截留分子量为10kD -30kD。
5.根据权利要求1所述生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于:在步骤(6)中,所述的上清液中含有酒精和蛋白胨,经过减压浓缩蒸馏,回收酒精后,残余物经喷雾干燥得到蛋白胨。
6.根据权利要求1所述生产硫酸软骨素并联产蛋白胨、胶原肽和软骨钙粉的方法,其特征在于:动物软骨进行粉碎的粒度为20-60目。
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