CN103113304A - 一种吡唑硫脲类衍生物及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吡唑硫脲类衍生物及其制备方法与用途。本发明的优点在于，吡唑硫脲类衍生物具有抑制人源肺癌细胞（A549，H460），乳腺癌细胞（MCF-7）增殖的作用，同时抑制细胞周期调控基因CDK2/cyclin E的表达。因此本发明的吡唑硫脲类衍生物可做潜在的抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种吡唑硫脲类衍生物及其制备方法与用途。
背景技术
吡唑是一种重要的杂环化合物，广泛分布在自然界中。自从含吡唑环的安替吡啉具有镇痛消炎及退热作用被发现以来，该类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基的多方位变换而在药物领域中得到广泛应用。研究发现吡唑类化合物具有消炎、止痛、抑菌、杀菌、抗高血糖、抗癌、抗凝血剂等药理活性。近年来，许多新型吡唑类医药相继商品化，对吡唑类化合物的深入研究已成为当今药物设计合成研究的热点之一。淡市近年来的文献多次报道了其衍生物的具有除抗炎外其他方面的活性，其中最显著的是抗肿瘤活性。
硫脲类衍生物是一类用途广泛的化合物，其结构中的非对称单元是许多酶抑制剂和生物模拟肽的常见结构特征，故多数具有生物活性，在农药上应用广泛，其中许多可用作除草剂、杀虫剂和植物生长调节剂等。在医药、生物领域中也具有十分重要的地位，它除了具有广谱的抗菌性之外，对白血病、肿瘤也有很好的药效。因此，吡唑硫脲类衍生物具有很广的应用前景。
吡唑硫脲类衍生物作为医药的前景十分值得关注。对其进行深入研究具有一定的理论和实际价值，尤其是在合成系列新型吡唑硫脲类衍生物的基础上对它们的生物活性进行系统的研究具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吡唑硫脲类衍生物以及它们的制备方法与用途。
本发明的技术方案如下：
一种吡唑硫脲类衍生物，其特征是它有如下通式：
结构式中R1为H、4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个，R2为4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个。
一种制备上述的吡唑硫脲类衍生物的方法，它由下列步骤组成：
步骤1：在有机溶剂中依次加入取代苯乙酮、取代盐酸苯肼，搅拌使之溶解，再加入过量的无水乙酸钠，于50~60℃加热回流反应1~3h，其中取代苯乙酮、取代盐酸苯肼、无水乙酸钠的物质的量的比为1：1~1.25：1.25~1.5，充分反应后蒸去有机溶剂，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，合并有机层并用无机干燥剂干燥，再减压蒸除溶剂得粗品，粗品经柱层析或重结晶提纯后得固体；
步骤2：将步骤1合成的固体溶于DMF，冰浴至0~5℃，滴加POCl3至上述混合液中，恢复常温搅拌1h，至20-100℃搅拌反应5-8h，其中，步骤1合成的固体、DMF、POCl3的物质的量的比为：1：3~4：3~9，冷却至常温后，倒入冰水中，用无机碱溶液调PH至7~9，真空抽滤，并水洗若干遍，经柱层析或重结晶，再烘干后得固体；
步骤3：将步骤2合成的固体溶于丙酮，加入NaClO2和氨基磺酸混合制成的水溶液，冰浴搅拌15min，室温搅拌1-2h，其中，步骤2合成的固体、NaClO2、氨基磺酸的物质的量的比为：1：1~2：1~2，停止反应，旋干丙酮，旋干丙酮，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，转移到分液漏斗中，用10%Na2S2O3洗两次，分别分液，再用饱和食盐水洗两次，分别分液，无水NaSO4干燥，旋干，烘干后得固体；
步骤4：将步骤3合成的固体溶于SOCl2，80~90℃反应3h，旋干SOCl2，加适量CH2Cl2溶解固体，加入NH4SCN和3滴PEG-400（聚乙二醇400）至上述混合液中，常温搅拌1h，直接加入取代苯胺室温搅拌1h，其中，步骤3合成的固体、SOCl2、NH4SCN、取代苯胺的物质的量的比为：1：3~7：1~1.5：1~1.5，向反应液中加入少量的水，搅拌，静置，分层，吸除水层，旋除CH2Cl2，所得固体用乙醇重结晶提纯后即得吡唑硫脲类衍生物。
进一步地，所述方法中使用的有机溶剂均为无水乙醇。
进一步地，所述步骤1，步骤3中使用的有机萃取剂为乙酸乙酯。
进一步地，所述步骤1中，取代苯乙酮、取代盐酸苯肼和无水乙酸钠的物质的量的比最优为1：1.25：1.5。
进一步地，所述步骤1中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述加热回流反应的充分反应，所述步骤3中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述加热反应的充分反应。
本发明的吡唑硫脲类衍生物具有抑制人源肺癌细胞（A549，H460），乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖的作用，同时抑制细胞周期调控基因CDK2/cyclin E的表达。因此本发明的吡唑硫脲类衍生物可做潜在的抗肿瘤药物。
具体实施方式
本发明公开了一种新型吡唑硫脲类衍生物以及它们的制备方法与用途，其中，吡唑硫脲类衍生物，其特征是它有如下通式：
结构式中R1为H、4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个，R2为4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个。
一种制备上述的吡唑硫脲类衍生物的方法，它由下列步骤组成：
步骤1：在有机溶剂中依次加入取代苯乙酮、取代盐酸苯肼，搅拌使之溶解，再加入过量的无水乙酸钠，于50~60℃加热回流反应1~3h，其中取代苯乙酮、取代盐酸苯肼、无水乙酸钠的物质的量的比为1：1~1.25：1.25~1.5，充分反应后蒸去有机溶剂，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，合并有机层并用无机干燥剂干燥，再减压蒸除溶剂得粗品，粗品经柱层析或重结晶提纯后得固体；
步骤2：将步骤1合成的固体溶于DMF，冰浴至0~5℃，滴加POCl3至上述混合液中，恢复常温搅拌1h，至20-100℃搅拌反应5-8h，其中，步骤1合成的固体、DMF、POCl3的物质的量的比为：1：3~4：3~9，冷却至常温后，倒入冰水中，用无机碱溶液调PH至7~9，真空抽滤，并水洗若干遍，经柱层析或重结晶，再烘干后得固体；
步骤3：将步骤2合成的固体溶于丙酮，加入NaClO2和氨基磺酸混合制成的水溶液，冰浴搅拌15min，室温搅拌1-2h，其中，步骤2合成的固体、NaClO2、氨基磺酸的物质的量的比为：1：1~2：1~2，停止反应，旋干丙酮，旋干丙酮，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，转移到分液漏斗中，用10%Na2S2O3洗两次，分别分液，再用饱和食盐水洗两次，分别分液，无水NaSO4干燥，旋干，烘干后得固体；
步骤4：将步骤3合成的固体溶于SOCl2，80~90℃反应3h，旋干SOCl2，加适量CH2Cl2溶解固体，加入NH4SCN和3滴PEG-400（聚乙二醇400）至上述混合液中，常温搅拌1h，直接加入取代苯胺室温搅拌1h，其中，步骤3合成的固体、SOCl2、NH4SCN、取代苯胺的物质的量的比为：1：3~7：1~1.5：1~1.5，向反应液中加入少量的水，搅拌，静置，分层，吸除水层，旋除CH2Cl2，所得固体用乙醇重结晶提纯后即得吡唑硫脲类衍生物。
进一步地，所述方法中使用的有机溶剂均为无水乙醇。
进一步地，所述步骤1，步骤3中使用的有机萃取剂为乙酸乙酯。
进一步地，所述步骤1中，取代苯乙酮、取代盐酸苯肼和无水乙酸钠的物质的量的比最优为1：1.25：1.5。
进一步地，所述步骤1中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述加热回流反应的充分反应，所述步骤3中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述加热反应的充分反应。
实施例一：N-对甲苯基-1,3-二苯基-4-吡唑甲酰硫脲（化合物1）的制备
于250ml单口圆底烧瓶中加入苯乙酮（20mmol）、盐酸苯肼（25mmol）、无水乙酸钠（30mmol）和100ml乙醇，磁力搅拌，50-60℃反应3h（TLC检测反应进行程度）。反应完毕后将反应液旋干，加入水洗涤，用乙酸乙酯萃取（3×100mL），合并有机层并用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏得固体1。将合成的固体1（10mmol）溶于DMF（30mmol），冰浴至0-5℃，滴加POCl3（60mmol）至上述混合液中，恢复常温搅拌1h，至60℃搅拌反应8h，冷却至常温后，倒入冰水中，用40%氢氧化钠溶液调PH至7-9，真空抽滤，并水洗3遍，乙醇重结晶，烘干后得固体2，取1mmol所得固体2溶于丙酮（10ml），加入NaClO2（1.5mmol）和氨基磺酸（1.5mmol）混合制成的水溶液，冰浴搅拌15min，室温搅拌1-2h，旋干丙酮，旋干丙酮，加10ml水，用乙酸乙酯萃取（3×10ml），转移到分液漏斗中，用10%Na2S2O3（20ml）洗两次，分别分液，再用饱和食盐水洗两次，分别分液，无水NaSO4干燥，旋干，烘干后得固体3；取1mmol所得固体3溶于SOCl2（7mmol），80~90℃反应3h，旋干SOCl2，加10mlCH2Cl2溶解固体，加入NH4SCN（1.5mmol）和3滴PEG-400（聚乙二醇400）至上述混合液中，常温搅拌1h，直接加入对甲基苯胺（1.2mmol）室温搅拌1h，向反应液中加入少量的水，搅拌，静置，分层，吸除水层，旋除CH2Cl2，所得固体用无水乙醇重结晶得到纯净的化合物1。产率85%,Mp:175-177℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.28(s,3H),7.12(d,J=8.40Hz,2H),7.34(t,J=7.22Hz,1H),7.43-7.55(m,7H),7.66(dd,J1=2.1Hz,J2=1.2Hz,2H),7.72(d,J=8.1Hz,2H),8.55(s,1H),8.67(s,1H),12.28(s,1H).MS(ESI):412.14(C24H20N4OS,[M+H]+).Anal.Calcd forC24H19N4OS:C,69.88,H,4.89,N,13.58Found:C,69.80,H,4.85,N,13.68%.
实施例二：N-对甲氧苯基-1,3-二苯基-4-吡唑甲酰硫脲（化合物2）的制备
制备方法同实施例一。以对甲氧基苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率83%,Mp:177-179℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.30(s,3H),7.27-7.35(m,6H),7.45(t,J=8.22Hz,2H),7.51-7.58(m,4H),7.70(d,J=8.07Hz,2H),8.53(s,1H),8.71(s,1H),12.43(s,1H).MS(ESI):428.13(C24H20N4O2S,[M+H]+).Anal.Calcd for C24H19N4O2S:C,67.27;H,4.70;N,13.07Found:C,67.13;H,4.53;N,13.37%.
实施例三：N-对氟苯基-1,3-二苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物3)的制备
制备方法同实施例一。以对氟苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率70%,Mp:137-139℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):6.96(t,J=8.43Hz,2H),7.07(t,J=8.43Hz,2H),7.34-7.79(m,10H),8.62(s,1H),8.78(s,1H),12.39(s,1H).MS(ESI):416.11(C23H17FN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C23H16FN4OS:C,66.33,H,4.11,N,13.45Found:C,66.31,H,4.01,N,13.65%.
实施例四：N-对氯苯基-1,3-二苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物4)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率77%,Mp:184-186℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.33(t,J=8.22Hz,2H),7.43(t,J=7.5Hz,2H),7.50-7.80(m,10H),8.63(s,1H),8.74(s,1H),12.49(s,1H).MS(ESI):432.08(C23H17ClN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C23H16ClN4OS:C,63.81;H,3.96;N,12.94Found:C,63.51;H,3.91;N,12.99%.
实施例五：N-对甲苯基-1-苯基-3-对甲苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物5)的制备
制备方法同实施例一。以4-甲基苯乙酮代替例一中的苯乙酮。得到白色晶体状目标化合物。
产率89%,Mp:182-184℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.35(s,3H),2.45(s,3H),7.19(d,J=8.25Hz,2H),7.37-7.53(m,7H),7.61(d,J=8.04Hz,2H),7.78(d,J=8.22Hz,2H),8.61(s,1H),8.80(s,1H),12.37(s,1H).MS(ESI):426.15(C25H22N4OS,[M+H]+).Anal.Calcd forC25H21N4OS:C,70.40;H,5.20;N,13.14Found:C,70.06;H,5.34;N%.
实施例六：N-对甲氧苯基-1-苯基-3-对甲苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物6)的制备
制备方法同实施例一。以4-甲基苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对甲氧苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率84%,Mp:181-183℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.45(s,3H),3.81(s,3H),6.91(q,J=6.96Hz,2H),7.37-7.59(m,7H),7.61(d,J=8.04Hz,2H),7.80(d,J=8.07Hz,2H),8.61(s,1H),8.80(s,1H),12.29(s,1H).MS(ESI):442.15(C25H22N4O2S,[M+H]+).Anal.Calcd for C25H21N4O2S:C,67.85;H,5.01;N,12.66Found:C,67.63;H,5.08;N,12.56%.
实施例七：N-对氟苯基-1-苯基-3-对甲苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物7)的制备
制备方法同实施例一。以4-甲基苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对氟苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率79%,Mp:172-174℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.47(s,3H),7.09(t,J=8.58Hz,2H),7.39-7.65(m,9H),7.80(d,J=8.07Hz,2H),8.62(s,1H),8.80(s,1H),12.42(s,1H).MS(ESI):430.13(C24H19FN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd forC24H18FN4OS:C,66.96;H,4.45;N,13.01Found:C,66.61;H,4.60;N,13.06%.
实施例八：N-对氯苯基-1-苯基-3-对甲苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物8)的制备
制备方法同实施例一。以4-甲基苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对氯苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率75%,Mp:181-183℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.46(s,3H),6.91(d,J=8.94Hz,2H),7.38-7.80(m,11H),8.62(s,1H),8.77(s,1H),12.28(s,1H).MS(ESI):446.10(C24H19ClN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18ClN4OS:C,64.49;H,4.28;N,12.54Found:C,64.35;H,4.29;N,12.44%.
实施例九：N-对甲苯基-1-苯基-3-对氯苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物9)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮代替例一中的苯乙酮。得到白色晶体状目标化合物。产率82%,Mp:182-184℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.35(s,3H),7.20(d,J=8.22Hz,2H),7.39-7.72(m,9H),7.76(t,J=8.04Hz,2H),8.59(s,1H),8.78(s,1H),12.30(s,1H).MS(ESI):446.10(C24H19ClN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18ClN4OS:C,64.49;H,4.28;N,12.54Found:C,64.35;H,4.29;N,12.44%.
实施例十：N-对甲氧苯基-1-苯基-3-对氯苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物10)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对甲氧苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率77%,Mp:203-204℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.80(s,3H),6.87(d,J=8.97Hz,2H),7.27-7.79(m,11H),8.55(s,1H),8.77(s,1H),12.33(s,1H).MS(ESI):462.09(C24H19ClN4O2S,[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18ClN4O2S:C,62.27;H,4.14;N,12.10Found:C,62.15;H,4.20;N,12.22%.
实施例十一：N-对氟苯基-1-苯基-3-对氯苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物11)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对氟苯胺代替例一中对甲苯胺。
得到白色晶体状目标化合物。产率70%,Mp:169-171℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.10(t,J=8.94Hz,2H),7.44-7.80(m,11H),8.60(s,1H),8.76(s,1H),12.35(s,1H).MS(ESI):450.07(C23H16ClFN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C23H15ClFN4OS:C,61.26;H,3.58;N,12.43Found:C,61.11;H,3.43;N,12.48%.
实施例十二：N-对氯苯基-1-苯基-3-对氯苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物12)的制备
制备方法同实施例一。以对氯苯乙酮代替例一中的苯乙酮，对氯苯胺代替例一中对甲苯胺。
得到白色晶体状目标化合物。产率77%,Mp:201-203℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.36-7.73(m,11H),7.79(d,J=8.04Hz,2H),8.59(s,1H),8.74(s,1H),12.44(s,1H).MS(ESI):466.04(C23H16Cl2N4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C23H15Cl2N4OS:C,59.11;H,3.45;N,11.99Found:C,59.07;H,3.41;N,11.89%.
实施例十三：N-对甲苯基-1-苯基-3-对氟苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物13)的制备
制备方法同实施例一。以4-氟苯乙酮代替例一中的苯乙酮。得到白色晶体状目标化合物。产率81%,Mp:200-202℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.37(s,3H),7.22(d,J=8.22Hz,2H),7.30-7.55(m,7H),7.73-7.80(m,4H),8.60(s,1H),8.71(s,1H),12.32(s,1H).MS(ESI):430.13(C24H19FN4OS,[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18FN4OS:C,66.96;H,4.45;N,13.01Found:C,66.65;H,4.51;N,13.1%.
实施例十四：N-对甲氧苯基-1-苯基-3-对氟苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物14)的制备
制备方法同实施例一。以4-氟苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对甲氧苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率75%，Mp:196-198℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.83(s3H),6.93(d,J=8.97Hz,2H),7.30-7.80(m,11H),8.61(s,1H),8.79(s,1H),12.26(s,1H).MS(ESI):446.12(C24H19FN4O2S[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18FN4O2S:C,64.56;H,4.29;N,12.55Found:C,64.71;H,4.34;N,12.61%.
实施例十五：N-对氟苯基-1-苯基-3-对氟苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物15)的制备
制备方法同实施例一。以4-氟苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对氟苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率70%，Mp:185-187℃,1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.10(t,J=8.65Hz,2H),7.28-7.81(m,11H),8.61(s,1H),8.74(s,1H),12.36(s,1H).MS(ESI):434.10(C23H16F2N4OS[M+H]+).Anal.Calcd for C23H15F2N4OS:C,63.58;H,3.71;N,12.90Found:C,63.80;H,3.69;N,12.92%.
实施例十六：N-对氯苯基-1-苯基-3-对氟苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物16)的制备
制备方法同实施例一。以4-氟苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对氯苯胺代替例一中对甲苯胺。
得到白色晶体状目标化合物。产率71%，Mp:184-185℃,1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):7.28-7.57(m,6H),7.66(d,J=8.79Hz,2H),7.73-7.80(m,5H),8.61(s,1H),8.70(s,1H),12.46(s,1H).MS(ESI):450.07(C23H16ClFN4OS[M+H]+).Anal.Calcd for C23H15ClFN4OS:C,61.26;H,3.58;N,12.43Found:C,61.41;H,3.53;N,12.53%.
实施例十七：N-对甲苯基-1-苯基-3-对甲氧苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物17)的制备
制备方法同实施例一。以对甲氧基苯乙酮代替例一中的苯乙酮。得到白色晶体状目标化合物。产率83%,Mp:178-180℃,1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):2.36(s,3H),3.99(s,3H),7.11(d,J=8.61Hz,2H),7.21(d J=8.4Hz,2H),7.38-7.69(m,7H),7.80(d,J=7.5Hz,2H),8.61(s1H),8.84(s1H),12.39(s1H).MS(ESI):442.15(C25H22N4O2S[M+H]+).Anal.Calcd forC25H21N4O2S:C,67.85;H,5.01;N,12.66Found:C,67.60;H,5.16;N,12.68%.
实施例十八：N-对甲氧苯基-1-苯基-3-对甲氧苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物18)的制备
制备方法同实施例一。以对甲氧基苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对甲氧基苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率75%，Mp:170-172℃,1HNMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.75(s,3H),3.91(s,3H),6.87(q,J=9.0Hz2H),7.09(t,J=7.68Hz,2H),7.38-7.71(m,7H),7.79(d,J=8.04Hz,2H),8.62(s,1H),8.90(s,1H),12.31(s,1H).MS(ESI):458.14(C25H22N4O3S[M+H]+).Anal.Calcd for C25H21N4O3S:C,65.48;H,4.84;N,12.22Found:C,65.25;H,4.87;N,12.27%.
实施例十九：N-对氟苯基-1-苯基-3-对甲氧苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物19)的制备
制备方法同实施例一。以对甲氧基苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对氟苯胺代替例一中对甲苯胺。得到黄色晶体状目标化合物。产率70%，Mp:162-163℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.90(s,3H),7.00(t,J=8.84Hz,2H),7.11(d,J=8.92Hz,2H),7.30-7.70(m,7H),7.78(d,J=7.89Hz,2H),8.61(s,1H),8.83(s,1H),12.41(s,1H).MS(ESI):446.12(C24H19FN4O2S[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18FN4O2S:C,64.56;H,4.29;N,12.55Found:C,64.32;H,4.33;N,12.61%.
实施例二十：N-对氯苯基-1-苯基-3-对甲氧苯基-4-吡唑甲酰硫脲(化合物20)的制备
制备方法同实施例一。以对甲氧基苯乙酮代替例一中的苯乙酮,对氯苯胺代替例一中对甲苯胺。得到白色晶体状目标化合物。产率85%，Mp:193-194℃;1H NMR(300MHz,CDCl3,δppm):3.90(s,3H),7.11(d,J=6.75Hz,2H),7.35-7.44(m,3H),7.54(t,J=7.32Hz,2H),7.66(d,J=8.76Hz,4H),7.81(d,J=7.5Hz,2H),8.61(s,1H),8.81(s,1H),12.52(s1H).MS(ESI):462.09(C24H19ClN4O2S[M+H]+).Anal.Calcd for C24H18ClN4O2S:C,62.27;H,4.14;N,12.10Found:C,62.41;H,4.03;N,12.25%.
实施例二十一：吡唑硫脲类衍生物对肿瘤抑制活性的研究
采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定计算吡唑苯胺类化合物对人源肺癌细胞（A549，H460），乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖的作用，细胞周期调控基因CDK2/cyclin E的半数抑制浓度（IC50）。
（1）培养液（每升）的配制：①悬浮细胞：RPMI-1640培养粉一袋（10.4g），新生牛血清100ml，青霉素溶液（20万U/ml）0.5ml，链霉素溶液（20万U/ml）0.5ml，加三蒸水溶解后，用5.6%的NaHCO3溶液调pH值至7.2-7.4，最后定容至1000ml。过滤灭菌。②贴壁细胞：同上，再加入NaHCO32.00g,HEPES2.38g。
（2）D-Hanks缓冲液（每升）的配制：NaCl8.00g,KCl0.40g,Na2HPO4·12H2O0.06g,KH2PO40.06g,NaHCO30.35g。高压灭菌。
（3）胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks缓冲液配成浓度为0.5%胰蛋白酶液。过滤除菌。
（4）实验药液的配制：将测试样品用少量的三蒸水溶解配成储备液，一般按实验最高浓度的10倍配制储备液。根据化合物溶解性不同，可用三蒸水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解。加药后的每孔细胞悬液中DMSO的终浓度一般不超过0.05%-0.1%。储备液保存于-20°C冰箱中备用。
（5）细胞的培养：为贴壁生长细胞，常规培养于RPMI-1640培养液内（含10%小牛血清、100U/ml链霉素），置37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔3-4天传代一次。传代时先弃去原培养液，再用D-Hanks缓冲液洗涤；然后用0.5%胰蛋白酶消化30秒左右，加入少量新鲜培养液终止消化；吹打，使贴壁细胞从培养瓶壁上脱落下来；移取适量至新鲜培养瓶中，再补充新鲜培养液至原体积（培养液体积约为培养瓶容量的1/10）。
（6）细胞孵育：取对数生长期的上述肿瘤细胞，调细胞悬液浓度为2×104个ml-1。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μl，置37°C，5%CO2培养箱中培养24h。24h后，分别按设计加入药液。
（7）加药：将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设6个平行孔。实验分为药物试验组（分别加入不同浓度的测试药）、阳性对照组（加Olomoucine）、阴性对照组（只加培养液和细胞，不加测试药）和空白组（只加培养液，不加细胞和测试药）。将加药后的96孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h。按照测试样品的方法测定。
（8）存活细胞的测定：在培养了48h后的96孔板中，每孔加MTT200μl（用200μl PBS配成0.5mg/ml的MTT）。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加150μl DMSO30min后利用自动酶标仪在570nm波长处检测各孔的光密度（OD值）。
（9）抑制率的计算：细胞生长的抑制率按照下列公式计算：
生长抑制率=(1－存活率)×100%=[1－(OD实验－OD空白)/(OD对照－OD空白)]×100%
(OD实验表示测试药物组的平均光密度，OD对照表示阴性对照组的平均光密度，OD空白表示空白组的平均光密度)
半数抑制浓度（IC50）定义为当50%的肿瘤细胞存活时的药物浓度。根据测定的光密度（OD值），制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的药物浓度。
表1.化合物1-20对癌细胞增值的抑制作用。
表1
Claims (8)
1.一种吡唑硫脲类衍生物，其特征在于，其通式为：
结构式中R1为H、4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个，R2为4-CH3、4-OCH3、4-F、4-Cl中的任意一个。
2.一种制备如权利要求1所述的吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，步骤包括：
步骤1：在有机溶剂中依次加入取代苯乙酮、取代盐酸苯肼，搅拌使之溶解，再加入过量的无水乙酸钠，于50~60℃加热回流反应1~3h，其中取代苯乙酮、取代盐酸苯肼、无水乙酸钠的物质的量的比为1：1~1.25：1.25~1.5，充分反应后蒸去有机溶剂，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，合并有机层并用无机干燥剂干燥，再减压蒸除溶剂得粗品，粗品经柱层析或重结晶提纯后得固体；
步骤2：将步骤1合成的固体溶于DMF，冰浴至0~5℃，滴加POCl3至上述混合液中，恢复常温搅拌1h，至20~100℃搅拌反应5~8h，其中，步骤1合成的固体、DMF、POCl3的物质的量的比为：1：3~4：3~9，冷却至常温后，倒入冰水中，用无机碱溶液调PH至7~9，真空抽滤，并水洗若干遍，经柱层析或重结晶，再烘干后得固体；
步骤3：将步骤2合成的固体溶于丙酮，加入NaClO2和氨基磺酸混合制成的水溶液，冰浴搅拌15min，室温搅拌1-2h，其中，步骤2合成的固体、NaClO2、氨基磺酸的物质的量的比为：1：1~2：1~2，停止反应，旋干丙酮，加适量水，用有机萃取剂萃取若干次，转移到分液漏斗中，用10%Na2S2O3洗两次，分别分液，再用饱和食盐水洗两次，分别分液，无水NaSO4干燥，旋干，烘干后得固体；
步骤4：将步骤3合成的固体溶于SOCl2，80~90℃反应3h，旋干SOCl2，加适量CH2Cl2溶解固体，加入NH4SCN和3滴PEG-400（聚乙二醇400）至上述混合液中，常温搅拌1h，直接加入取代苯胺室温搅拌1h，其中，步骤3合成的固体、SOCl2、NH4SCN、取代苯胺的物质的量的比为：1：3~7：1~1.5：1~1.5，向反应液中加入少量的水，搅拌，静置，分层，吸除水层，旋除CH2Cl2，所得固体用乙醇重结晶提纯后即得吡唑硫脲类衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，所述所述步骤1中使用的有机溶剂为无水乙醇。
4.根据权利要求2所述的制备吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，所述步骤1中使用的有机萃取剂为乙酸乙酯。
5.根据权利要求2所述的制备吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，所述步骤3中使用的有机萃取剂为乙酸乙酯。
6.根据权利要求2所述的制备吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，所述步骤1中，取代苯乙酮、取代盐酸苯肼和无水乙酸钠的物质的量的比最优为1：1.25：1.5。
7.根据权利要求2所述的制备吡唑硫脲类衍生物的方法，其特征在于，所述步骤1中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述加热回流反应的充分反应，所述步骤3中，以TLC跟踪反应直至至少一种原料很少或消失，为所述反应的充分反应。
8.根据权利要求1所述的吡唑硫脲类衍生物，其特征在于，所述的吡唑硫脲类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| WO2019166616A1 (en) * | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Université de Lausanne | Pyrazole derivatives as nhibitors of the wnt signalling pathway |
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2013
- 2013-02-01 CN CN2013100415240A patent/CN103113304A/zh active Pending
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