CN103113223B

CN103113223B - 墓头回甲素、乙素及其制备方法和在抗肿瘤药物上的应用

Info

Publication number: CN103113223B
Application number: CN201310042039.5A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 王开金; 陈飞虎; 李俊; 谢雪峰; 高文超
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-01-23
Also published as: CN103113223A

Abstract

本发明涉及一类从民间中药墓头回(糙叶败酱，Patrinia？scabra)中分离得到的双异戊酰基木脂素类化合物，墓头回甲素、乙素(patrinin？A，B)及其制备方法，同时提供一种以该类化合物为活性成分的用于治疗和预防肿瘤的药物组合物，及该类化合物及其药物组合物在制备治疗和预防肿瘤的药物方面的应用。

Description

墓头回甲素、乙素及其制备方法和在抗肿瘤药物上的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一类从民间中药墓头回(糙叶败酱，Patriniascabra)中分离得到的双异戊酰基木脂素类化合物，墓头回甲素、乙素(patrininA，B)及其制备方法，同时提供一种以该类化合物为活性成分的用于治疗和预防肿瘤的药物组合物，及该类化合物及其药物组合物在制备治疗和预防肿瘤的药物方面的应用。

背景技术

癌症，亦称“恶性肿瘤”，是威胁人类健康最主要的恶性疾病之一，是目前全球人口的第一死因，最新数据统计，2007年，全球有约790万人死于各类癌症，占死亡总数的13％，有超过1200万个肿瘤病例被确诊，其中72％以上肿瘤患者和致死病例都发生在不发达国家，且呈不断上升的趋势，预计2015年，全球肿瘤致死人数将增至900万人，2030年将超过1200万人；目前，我国每年癌症发病人数约280万，死亡人数超过40万人，位列我国各类疾病致死原因之首，并呈不断上升趋势。随着社会生活节奏加快，竞争压力增大，以及人类的生活方式和环境的改变，肿瘤发病率和死亡人数正逐年增长，已成为现代社会的常见病和高发病，不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，也是困扰全球的重大社会问题，癌症的治疗和预防始终是全球范围类最为迫切的问题之一。目前，化学约物治疗是抗击肿瘤的主要手段，近年来，全球抗肿瘤药物市场呈快速增长态势，据美国FDA统计数据，全球抗癌药物市场销售总额由2004年的240亿美元，激增至2007年的396亿美元。虽然全球每年都不断有新型抗肿瘤药物问世，但至今人类仍然没有一种有效的手段战胜癌症，同时不断发现新的癌症种类，以及肿瘤抗/耐药性的产生和增强，使得对发现新型有效抗癌药物的需要显得尤为迫切。纵观全球1981至2002年期间所开发的抗癌药物，约60％直接或间接来自于天然产物，充分表明自然界是人类获取抗肿瘤药物的最重要的源泉。植物中广泛存在着具有抗肿瘤作用的活性成分，喜树碱、长春新碱和紫杉醇等的先后被发现，标志着天然抗癌药物研究所取得的重大进展，我国中药资源丰富，从传统的药用植物中筛选寻找抗癌天然活性成分或活性先导化合物是完全可行的。

民间中药“墓头回”，又名：鸡粪草(《本草原始》)，系败酱科败酱属多年生草本植物糙叶败酱(Patriniascabra)的地下根茎，具特异臭味，始载于明代《集验方》，《本草纲目》将其收为正品，因其治疗妇女崩中带下显奇效而取名“墓头回”，示其有起死回生之功效。墓头回，性味苦、酸、涩、凉；具有清热燥湿、止血止带、截虐解毒之功效，民间用于宫颈糜烂，早期宫颈癌，妇女崩中、赤白带下，疟疾等症的治疗，现代药理研究证实墓头回具有抗肿瘤、调节免疫、止血、抗菌等多种生物活性。

本发明从民间中药墓头回(糙叶败酱，P.scabra)中分离得到双异戊酰基木脂素类化合物，墓头回甲素、乙素，药理试验研究表明，该类化合物具有显著的抗肿瘤活性，经文献检索，迄今未见该类化合物在此方面活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一类从民间中药墓头回中分离得到的双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素。

本发明的另一目的是提供上述墓头回甲素、乙素的制备方法。

本发明的进一步目的是提供以墓头回甲素、乙素为活性成分的用于治疗和预防恶性肿瘤的药物组合物，及上述化合物和组合物在制备治疗和预防恶性肿瘤的药物方面的应用。

本发明提供的双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素具有如下化学结构式：

上述两个化合物均系首次从民间中药墓头回提取分离得到的新化合物，故分别命名为墓头回甲素、乙素。

为了实现本发明上述目的，本发明提供了上述双异戊酰基木脂素类化合物的制备方法，具体地，从民间中药墓头回(糙叶败酱，P.scabra)中提取、分离墓头回甲素、乙素的方法，步骤如下：

步骤1)-提取：

墓头回(糙叶败酱，P.scabra)地下根茎，粉碎后，乙醇提取，浓缩后所得粗浸膏加水混悬后，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得萃取液浓缩后，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。

步骤2)-分离：

①步骤1)所得乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，以氯仿/乙酸乙酯(30∶0-30∶20，体积比，v/v)进行梯度洗脱。其中30∶10(v/v)的洗脱组分，再经石油醚/乙酸乙酯(20∶0-20∶20，v/v)梯度洗脱，依次得到5个洗脱组分(Frs.1-5)。

②将步骤2)①中Frs.2组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以水/甲醇(10∶0-0∶10，v/v)梯度洗脱，其中，水/甲醇(5∶5，v/v)的洗脱组分，再经ODS柱层析，以水/甲醇(2∶8，v/v)洗脱，得到墓头回甲素。

③将步骤2)①中Frs.3组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以水/甲醇(10∶0-0∶10，v/v)梯度洗脱，其中，水/甲醇(4∶6，v/v)的洗脱组分，再经ODS柱层析，以水/甲醇(3∶7，v/v)洗脱，得到墓头回乙素。

同时，本发明还提供了以所述两种化合物为活性成分的药物组合物，其含有所述两种化合物或其中之一，及可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体、和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射(静注和肌注)两种形式给药，使用量可根据给药途径，患者年龄、体重、所患疾病类型和病程严重程度等具体变化情况使用，对于成人而言，给药量每天1-100mg比较合适。

口服给药可用其固体或液体制剂，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、溶液、糖浆、滴丸等剂型。

注射给药可用其固体或液体制剂，如粉针剂、溶液注射剂。

本发明的化合物在用于药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1％～99％，优选为0.5％～90％的本发明化合物，其余为药物学上可以接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

附图说明

图1：本发明化合物墓头回甲素、乙素的化学结构式

图2：墓头回甲素、乙素及对阳性照药顺铂对宫颈癌(Hela)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

图3：墓头回甲素、乙素及阳性对照药顺铂对宫颈癌(KB)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

图4：墓头回甲素、乙素及阳性对照药顺铂对卵巢癌(HO-8910-PM)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

图5：墓头回甲素、乙素及阳性对照药顺铂对乳腺癌(SK-BR-3)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

图6：墓头回甲素、乙素及阳性对照药顺铂对胃癌(MNK-45)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

图7：墓头回甲素、乙素及阳性对照药顺铂对白血病(HL-60)细胞的增值抑制剂量-效应曲线。

具体实施方式

下面的结合具体实施例进一步详细地说明本发明的实质性内容，但并不以任何形式限制本发明。

实施例1：

墓头回甲素、乙素的制备：

仪器与试剂：JASCODIP-370型数字旋光仪；FTS-135型红外光谱仪(KBr压片)；VGAutoSpec-3000型质谱仪；BrukerAM-400型核磁共振仪，TMS为内标，J为Hz、δ为ppm。硅胶(100目和200-300目，青岛海洋化工厂)；反相硅胶ODS(30-50μm，FujiSilysiaChemicalCo.Ltd.)；凝胶SephadexLH-20(75-100μm，PharmaciaFineChemicalCo.Ltd.)；所用试剂为重蒸工业级或分析纯，10％硫酸-乙醇溶液加热显色。

制备方法：(1)提取：自然风干的墓头回(糙叶败酱，P.scabra)地下根茎18公斤，粉碎过40目筛，加入90％乙醇60升室温提取，每次24小时，中间每隔6小时搅拌1次，共提取4次，合并提取液减压浓缩至无醇味，得粗浸膏1350g，将所得粗浸膏混悬于4000毫升水中，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别萃取4次，萃取液减压浓缩后，分别得石油醚萃取物487g、乙酸乙酯萃取物245g和正丁醇萃取物252g。

(2)分离：乙酸乙酯萃取物245g，甲醇溶解，吸附于250g硅胶(100目)，室温挥发至干，碾碎过筛，用3.0kg硅胶(200-300目)进行柱层析，以氯仿/乙酸乙酯(30∶0，30∶5，30∶10，30∶15，30∶20，v/v)进行梯度洗脱。其中氯仿/乙酸乙酯(30∶10v/v)的洗脱组分，再经石油醚/乙酸乙酯(20∶0，20∶5，20∶10，20∶15，20∶20，v/v)梯度洗脱，每流份500ml，经薄层层析检测，10％硫酸-乙醇加热显色，根据显色斑点合并相同流份，减压浓缩后，依次得到5个洗脱组分(Frs.1-5)；其中Frs.2组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以水/甲醇(10∶0-0∶10，v/v)梯度洗脱，其中，水/甲醇(5∶5，v/v)的洗脱组分，再经ODS柱层析，以水/甲醇(2∶8，v/v)洗脱，得到墓头回甲素纯品(1380mg)；Frs.3组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以水/甲醇(10∶0-0∶10，v/v)梯度洗脱，其中，水/甲醇(4∶6，v/v)的洗脱组分，再经ODS柱层析，以水/甲醇(3∶7，v/v)洗脱，得到墓头回乙素纯品(960mg)。

墓头回甲素：无色油状物，易溶于氯仿、丙酮、乙醇；旋光(c，0.19，CHCl₃)；UVλ_maxMeOH(nm)(logε)：238(4.08)；IR(KBr)v_maxcm^-13463，2931，1734，1660，1615.1585，1334，1295，972，835，701；高分辨质谱显示其分子式为C₃₂H₄₄O₁₁{HRESIMS：m/z627.2777[M+Na]⁺(calcd.627.2781forC₃₂H₄₄O₁₁Na)}；¹H与¹³C核磁数据见表1。同时，通过二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)等二维核磁共振相关谱确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的结构。

墓头回乙素：无色油状物，易溶于氯仿、丙酮、乙醇；旋光(c，0.13，CHCl₃)；UVλ_maxMeOH(nm)(logε)：228(4.10)，271(4.22)；IR(KBr)v_maxcm^-13439，2931，1733，1670，1615，1583，1334，1295，973，835，706；高分辨质谱显示其分子式为C₃₁H₄₂O₁₁{HRESIMS：m/z613.2620[M+Na]⁺(calcd.613.2625forC₃₂H₄₄O₁₁Na)}；¹H与¹³C核磁数据见表2。同时，通过二维H-H相关谱(DQF-COSY)、H-C相关谱(HMQC)、H-C远程相关谱(HMBC)等二维核磁共振相关谱确定了所有碳原子和氢原子的信号归属及该化合物的结构。

表1墓头回甲素¹H和¹³C核磁共振波谱数据(inCDCl₃，JinHzandδinppm)

表2墓头回乙素¹H和¹³C核磁共振波谱数据(inCDCl₃，JinHzandδinppm)

实施例2：

按实施例1制得墓头回甲素，按其与赋形剂重量比1∶1的比例，加入赋形剂，制粒压片。

实施例3：

按实施例1制得墓头回乙素，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。

实施例4：

按实施例1制得墓头回甲素，按其与赋形剂重量比1∶2的比例，加入赋形剂，制粒压片。

实施例5：

按实施例1制得墓头回甲素，按其与赋形剂重量比1∶3的比例，加入赋形剂，制粒压片。

实施例6：

片剂：

实施例7：

胶囊剂：

墓头回乙素100mg

淀粉100mg

硬脂酸镁适量

制备方法：将墓头回乙素与相关辅料，在适当容器中混合均匀，过筛，得到的混合物装入硬明胶胶囊。

实施例8：

安瓿剂：

墓头回甲素50mg

制备方法：按实施例1制得墓头回甲素，溶解于2ml丙二醇中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中，制成安瓿剂。

实施例9：

按实施例1制得墓头回乙素，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例10.

滴丸：墓头回甲素1g

聚乙二醇60009g

制备方法：按取处方量的墓头回甲素，加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入到聚乙二醇熔融液中(60℃水浴保温)，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60℃水浴保温30分钟，待气泡除尽，将上述混匀熔融液转入贮液桶内，80-85℃条件下，控制滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，待冷凝完全，收集滴丸，沥尽和用滤纸除去滴丸上的冷凝液，放置于硅胶干燥器中或自然干燥即可。

实施例11：

为了更好地理解本发明的实质，下面用本发明的化合物与药用载体或赋形剂组成的药物的药理活性结果来说明墓头回甲素、乙素在治疗和预防肿瘤的药物方面的应用，但并不以此来限制本发明。

墓头回甲素、乙素体外抗肿瘤活性试验：

MTT法细胞活性检测原理：

MTT全称为3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide是一种黄色染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，并结晶沉淀在细胞内，而死细胞无此功能，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，甲臜的含量可以用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此，可根据光密度OD值间接反映活细胞数量。

供试样品：本发明化合物墓头回甲素、乙素，精确称量，二甲基亚砜(DMSO)溶解配置成10mg/ml母液，避光保存备用；阳性对照药为顺铂(cisplatin)。

供试肿瘤细胞株系：宫颈癌细胞(Hela)、宫颈癌细胞(KB)、卵巢癌细胞(HO-8910PM)、乳腺癌细胞(SK-BR-3)、胃癌细胞(MNK-45)、白血病细胞(HL-60)。

实验方法：

1.接种细胞：收集对数生长期的供试细胞，用含10％的胎牛血清培养液(DMEM或RMP1640)，配成单细胞悬液，以每孔10000-20000个细胞接种到96孔板中，每孔100μl，贴壁细胞提前12h接种，37℃、5％CO₂条件下培养48小时。

2.加入待测化合物溶液(固定浓度40μM初筛，在该浓度对肿瘤细胞生长抑制在50％附近，设置5个浓度进入梯度复筛)，每孔终体积200μl，每个处理均设5个重复孔。

3.显色：培养24小时后，每孔加MTT20μl。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液100μl以避免细胞丢失，每孔加20％酸化SDS100μl，37℃过夜孵育，使用臜结晶物充分溶解。

4.比色：选择A570nm波长，酶标仪测定各孔吸光值，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制细胞生长曲线，计算供试化合物对肿瘤细胞的IC₅₀值。

实验结果：

表3墓头回甲素、乙素对供试肿瘤细胞株半数生长抑制浓度(IC₅₀，μM)

实验结论：

双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素对上述包括人宫颈癌细胞(Hela)、宫颈癌细胞(KB)、卵巢癌细胞(HO-8910PM)、乳腺癌细胞(SK-BR-3)、胃癌细胞(MNK-45)、白血病细胞(HL-60)等肿瘤细胞的增值生长的半数抑制浓度(IC₅₀)在0.7-7.6μM之间，尤其对几种常见妇科肿瘤表现出显著的抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有下述突出优点：

1.迄今为止，在现有技术中尚无本发明所述的双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素作为有效成分在抗肿瘤方面的报道，该类化合物是我们从我国民间妇科用药中筛选发现的新成分，从传统药用植物中发现药用活性成分是当前国内外新药研制非常活跃的领域。本发明所述墓头回甲素、乙素及其药物组合物作为制备治疗和预防肿瘤的研究，取得了令人兴奋的结果。

2.体外抗肿瘤试验结果表明，本发明双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素具有较为显著的抗肿瘤活性，对于多数肿瘤细胞株系，其细胞毒活性明显高于阳性对照药顺铂，尤其对几种常见妇科肿瘤表现出显著的抑制作用，预示着该类化合极有可能在妇科肿瘤的治疗和预防方面有良好的药用前景。

3.本发明涉及的双异戊酰基木脂素类化合物来源于传统中草药，原料来源丰富，制备工艺简单，成本低廉，并可制成各种剂型，有望为治疗和预防常见妇科肿瘤提供一种新实用药物和手段。

Claims

1.一类结构式如下的双异戊酰基木脂素类化合物，墓头回甲素、乙素，

2.如权利要求1所述的双异戊酰基木脂素类化合物墓头回甲素、乙素的制备方法，取墓头回药材，粉碎过40目筛，90％乙醇室温提取24小时，提取4次，合并提取液，浓缩后得粗浸膏，粗浸膏加水混悬后，依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液浓缩后分别得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物；取乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，以30∶0-30∶20的氯仿/乙酸乙酯梯度洗脱，其中氯仿/乙酸乙酯30∶10的洗脱组分浓缩后，再经硅胶柱，20∶0-20∶20的石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，依次得到5个洗脱组分Frs.1-Frs.5；其中Frs.2组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以体积比10∶0-0∶10的水/甲醇系统梯度洗脱，收集水/甲醇5∶5的洗脱组分，洗脱液浓缩后，再经ODS柱层析，以水/甲醇2∶8洗脱纯化，即得墓头回甲素；其中Frs.3组分，经SephadexLH-20凝胶柱层析，以10∶0-0∶10水/甲醇系统梯度洗脱，收集水/甲醇4∶6的洗脱组分，洗脱液浓缩后，再经ODS柱层析，以水/甲醇3∶7洗脱纯化，即得墓头回乙素。

3.一种药物组合物，含权利要求1所述的化合物和/或其药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的化合物墓头回甲、乙素在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。