CN103110941A - 一种新型免疫佐剂及快速免疫方案 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型免疫佐剂及利用该佐剂在单抗制备中快速免疫动物的方法，提供了一种应用于动物免疫的水溶性佐剂及相应的快速免疫方案，利用组合佐剂和相应的动物免疫方案，可以快速引起动物免疫应答反应，免疫周期28天即可完成，较传统免疫周期缩短二分之一。

Description

一种新型免疫佐剂及快速免疫方案
技术领域
本发明涉及一种新型免疫佐剂及免疫方案，提供了一种应用于单克隆抗体制备的水溶性佐剂及应用这种佐剂进行快速免疫的方法。该方法利用组合佐剂和新颖的的动物免疫方案，可以快速引起小鼠免疫应答反应，这个免疫周期28天即可完成。 
背景技术
抗原、免疫佐剂与动物免疫
抗原是能够刺激动物机体产生免疫应答的外源性物质。免疫佐剂，本身不具抗原性，但同抗原一起刺激机体后，能增强免疫效果。免疫佐剂的生物学作用包括：(1)改变抗原的物理性状，减缓抗原物质的释放，延长抗原的作用时间；(2)增加抗原表面积，利于巨噬细胞的吞噬；(3)能够刺激巨噬细胞对抗原的处理；(4)促进淋巴细胞间的连接，增强辅助性T淋巴细胞的作用；(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体；(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度。
用抗原对动物（通常是小鼠）进行免疫是单克隆抗体制备过程的第一步，也是至关重要的一步。动物对抗原免疫应答反应是否良好，能否产生滴度高，特异性好的抗体直接决定了后期筛选单克隆杂交瘤细胞株的难度和所获抗体的有效性。而免疫佐剂和免疫方案是动物能否产生良好免疫应答反应的重要因素。免疫佐剂按其水溶性可分为水溶性佐剂和油性佐剂：油性佐剂，如常用的弗氏佐剂、植物油等，在免疫之前需经过乳化形成油包水的状态才能进行免疫；水溶性佐剂，不需要繁琐的乳化过程，直接与抗原混合后注射动物即可。 
免疫方法
弗氏佐剂是目前最常用的动物免疫佐剂，已有多种品牌的商品供应，其主要成分为石蜡油和羊毛脂等油脂类。免疫过程中弗氏佐剂与抗原水溶液等体积混合后通过乳化制备成油包水的状态，在注射入机体后将抗原持续缓慢释放，刺激机体免疫应答的发生。应用弗氏佐剂的传统免疫方案通常需要通过初次免疫及加强免疫，共计55天的时间才能获得充分免疫应答。在此过程中免疫原需要较长时间才能被动物体内的免疫系统捕获、加工、提呈，刺激特定的淋巴细胞分类增殖，产生抗体。当免疫原的稳定性较差时（如某些易降解蛋白、人工合成抗原和一些经载体偶联的小分子半抗原等），易受到体内pH、酶、金属离子等因素的影响而被降解，失去其抗原性，造成最终免疫效果不佳。一个良好的免疫方案可缩短上述免疫应答过程，使稳定性低的蛋白和小分子物质被分解的可能性降低，人工抗原受机体影响减少，进而产生特异性抗体的机会增加。本发明所涉及的免疫方案，应用了常规的弗氏完全佐剂（油性佐剂）和一种新颖的水溶性佐剂（以下简称Quick-Ab佐剂）。其基本原理是：应用弗氏完全佐剂进行初次免疫后，再用Quick-Ab佐剂在短时间内进行多次免疫刺激，增强机体免疫应答效果，加快浆细胞生产抗体能力，获得更高滴度、更高亲合力的抗体。整个免疫周期仅为28天，免疫周期与传统免疫周期相比整整缩短一半的时间。
发明内容
本发明的目的是以弗氏完全佐剂乳化后的抗原注射到动物体内引起初次免疫应答后，再将QuickAb水溶性佐剂和抗原直接注射到动物脾脏，通过在短时间内连续多次刺激动物免疫系统，更快获得高效价、高亲和力的抗体。 
本发明是通过以下技术方案实现的。 
与弗氏完全佐剂相配合，使用Quick-Ab新型免疫佐剂，以新的免疫程序对动物实施免疫，免疫动物能快速产生特异性免疫应答。具体步骤如下： 
1. 初次免疫：将一定剂量的抗原（蛋白、偶联载体的小分子）与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合(250微升/只)，抗原体积不足部分用50mM的PBS代替，经过乳化，常规背部多点皮下注射免疫动物；
2. 加强免疫：按初次免疫一半的抗原量与Quick-Ab佐剂体积比1:1混合，将混合物经皮穿刺直接注入脾脏进行免疫；分别在初次免疫后的第14天、第17天、第21天免疫3次；
3. 抗血清检测：第28天动物采血检测效价。
附图说明
附图1  地高辛结构式 
附图2  LPS结构示意图
表1 抗地高辛小鼠血清效价检测结果。本发明方法与传统方法比较，血清中抗地高辛抗体的效价足足提高了30倍。
表2抗脂多糖小鼠血清效价检测结果。本发明方法与传统方法比较，血清中抗脂多糖抗体的效价平均提高了5倍。 
Figure 2012103790915100002DEST_PATH_IMAGE002
具体实施方式
以下借助实例进一步举例描述本发明。本领域技术人员可以理解到，这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。 
实施例1. Quick-Ab水溶性佐剂的制备
以1L佐剂配制为例，首先称取8克氯化钠、0.2克氯化钾、1.48克硼酸钠和0.22克硼酸，溶于800ml蒸馏水中，然后用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，在1.0×108Pa高压下蒸气灭菌至少20分钟，保存于室温或4℃冰箱中。
实施例2. 使用本发明制备抗地高辛（Digoxin）小鼠单克隆抗体
附图1所示为地高辛的分子结构。地高辛为有机小分子半抗原，必须与分子量较大的蛋白载体进行偶联后方可获得充分的免疫原性，成为适用的抗原。但偶联产物稳定性较差，易受环境因素干扰而降解。制备地高辛抗体时，首先采用高碘酸钠法将地高辛偶联于匙孔血蓝蛋白以制备抗原。再使用传统方法及本发明方法，分别免疫同一批次Balb/C老鼠，每组免疫5只。免疫剂量初次免疫为80ug/只，加强免疫时40ug/只，待免疫结束后检测抗血清进行对比。
使用传统的弗氏佐剂进行免疫，初次免疫时将抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化充分之后对Balb/C小鼠进行皮下多点注射。加强免疫时（初免之后21天）将抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化充分后对初次免疫的小鼠进行皮下多点免疫；在第55天对抗血清效价进行检测。 
使用本发明方法，初次免疫与传统免疫方法相同。加强免疫时改用水溶性佐剂Quick-Ab，分别在初次免疫后的第14天、第17天、第20天做脾脏直接注射，在第28天对抗血清效价进行检测，第30天进行融合前加强免疫，3——5天后取小鼠脾脏进行细胞融合，进入单克隆抗体筛选程序。在本发明中，抗原通过初次免疫应答后，有一定的免疫记忆。而加强免疫时，采用水溶性佐剂注射脾脏，抗原直接到达作用部位，避免了与体液的过多接触，减少动物体液物质对抗原稳定性的不良影响，有利于动物免疫系统产生免疫应答。 
与传统弗氏佐剂免疫方案相比，通过本发明方法免疫小鼠，获得的小鼠血清抗地高辛抗体的效价提高了30倍（表1所示），为制备抗地高辛单克隆抗体奠定了非常有利的条件。 
实施例3. 使用本发明制备抗脂多糖（LPS）小鼠抗体
附图2所示为脂多糖的分子结构。脂多糖是脂质和多糖的复合物，为革兰氏阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分，由多糖链、核心多糖和脂质A三部分组成。脂多糖注射动物后其免疫应答反应较快，较短时间内即可引起免疫应答反应，同时体内产生的抗体在第7-14左右即到达最高点，如果两次免疫之间间隔时间较长时，每次免疫机体反应均为初次免疫应答，所产生抗体主要以IgM类抗体。
使用传统方法及本发明方法，分别免疫同一批次Balb/C小鼠，每组免疫5只。免疫剂量初次免疫为80ug/只，加强免疫时40ug/只，待免疫结束后检测抗血清进行对比。 
使用传统的弗氏佐剂进行免疫，初次免疫时将抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化充分之后对Balb/C小鼠进行皮下多点注射。加强免疫时（初免之后21天）将抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，乳化充分后对初次免疫的小鼠进行皮下多点免疫。在第55天对抗血清效价进行检测。由于机体对脂多糖的免疫应答反应较快，故2次免疫之间周期较长时，每次免疫机体反应均为初次免疫应答，很难得到较特异IgG亚类的抗体。 
使用本发明方法，初次免疫与传统免疫相同。加强免疫时改用水溶性佐剂Quick-Ab，分别在初次免疫后的第14天、第17天、第20天做脾脏直接注射，在第28天对抗血清效价进行检测，第30天进行融合前加强免疫，3——5天后取小鼠脾脏进行细胞融合，进入单克隆抗体筛选程序。利用本发明方法，抗原初次免疫与加强免疫间隔较短，加强免疫时采用水溶性佐剂注射脾脏，抗原直接到达作用部位，减少脂多糖的潜伏期，有利于浆细胞产生抗脂多糖的抗体。 
与传统弗氏佐剂相比，通过本发明方法免疫小鼠，获得的小鼠血清抗脂多糖IgG亚类抗体的效价提高了5倍（表2所示），为获得IgG亚类抗体提供了必要的前提条件。 
通过上述三个实施例可见，本发明所涉及的水溶性佐剂与免疫方案与传统免疫方案相比显著地缩短了单克隆抗体制备过程中动物免疫所需的时间。免疫效果亦好于常规方法，特别适用于针对半抗原、糖蛋白等常规免疫方法难以取得满意效果的单克隆抗体制备。  

Claims (10)

1.一种利用新型免疫佐剂（Quick-Ab）及利用该佐剂缩短单克隆抗体制备周期的快速免疫方案。
2.其免疫周期为小于或等于28天。
3.包括实现上述目标的具体方法：抗原与弗氏完全佐剂混合，经过乳化，初次免疫动物；抗原与Quick-Ab佐剂混合，加强免疫三次。
4.根据权利要求1的方法，其中可作为抗原的物质包括但不限于蛋白、偶联载体的小分子。
5.按权利要求1的方法，其中初次免疫动物的方法包括但不限于背部皮下多点免疫。
6.按权利要求1的方法，其中抗原与Quick-Ab佐剂混合体积比为包括但不限于1:1。
7.按权利要求1的方法，其中与Quick-Ab佐剂混合的抗原量为包括但不限于初次免疫的抗原量的二分之一。
8.按权利要求1的方法，其中再次免疫方法包括但不限于脾脏直接免疫。
9.按权利要求1的方法，其中再次免疫次数包括但不限于3次。
10.按权利要求1的方法，其中再次免疫的时间点分别为包括但不限于初次免疫的第14天、第17天、第21天。
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