CN103110887B - 一种抑制鳗弧菌的中草药配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制鳗弧菌的中草药配方，特点是包括五味子、石榴皮、艾叶、芦荟、枯矾、儿茶、稀签草、地榆、半边莲、功劳叶、槟榔、木瓜、乌桕、灸没药、白头翁、茵陈、天南星、黄芩、穿心莲、虎杖片、使君子、蒲公英、蛇麻子、马齿苋、连翘、龙胆草、苍术、丹皮、牵牛子、公丁香、紫花地丁、威灵仙、龙葵、五倍子、黄芪、白花蛇舌草、柴胡、吴芋、乌梅、大青叶、车前草、羲术中的至少一种，其中石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：4：1：4的质量比混合而成的配方抑菌效果最佳，优点是天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉。

Description

一种抑制鳗弧菌的中草药配方

技术领域

本发明涉及一种中草药配方，尤其是涉及一种抑制鳗弧菌的中草药配方。

背景技术

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种有鞭毛的革兰氏阴性条件致病细菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或受伤时，会诱发疾病的产生。鳗弧菌能引起世界范围内的50多种海、淡水养殖鱼类及其它水产动物发病，流行广泛，温带和亚寒带都常有发生。我国的林克冰等在1999年就有关于弧菌在我国危害的报道。鳗弧菌的感染途径有多种，主要包括皮肤、鳃、侧线以及肠道等。感染后会引起全身性的组织病变，不同的鱼虾感染鳗弧菌后会有不同的症状，但主要症状是体表出血。由鳗弧菌引起的细菌性败血症是近年来在我国流行范围广，感染鱼类死亡率高，危害损失大的水产养殖鱼类急性传染性疾病，每年给水产养殖造成巨大经济损失。据报道，鳗弧菌能感染牙鲆、鲈鱼、鲑鱼、黄鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鳕鱼、大菱鲆等；它是多种对虾的致病菌，对罗氏沼虾、栉孔扇贝等虾类、贝类的免疫系统具有强烈的刺激作用，是弧菌中危害较高的菌。

目前对于鳗弧菌引起的疾病的防治手段主要是利用化学药品、抗生素或减活、灭活疫苗，其中主要以投放喂食抗生素为主要手段。但长期滥用药物或抗生素会引起水环境污染，从而导致养殖环境恶化，生态平衡失调，并且细菌还会产生耐药性，药物残留还对食用者构成潜在的威胁，而中草药无抗药性，无残留，无环境污染，不引发药源性疾病且抑菌杀菌效果明显，越来越引起人们的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染,而且可以降低生产成本的抑制鳗弧菌的中草药配方。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抑制鳗弧菌的中草药配方，包括五味子、石榴皮、艾叶、芦荟、枯矾、儿茶、稀签草、地榆、半边莲、功劳叶、槟榔、木瓜、乌桕、灸没药、白头翁、茵陈、天南星、黄芩、穿心莲、虎杖片、使君子、蒲公英、蛇麻子、马齿苋、连翘、龙胆草、苍术、丹皮、牵牛子、公丁香、紫花地丁、威灵仙、龙葵、五倍子、黄芪、白花蛇舌草、柴胡、吴芋、乌梅、大青叶、车前草、羲术中的至少一种。

该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：4：1：4的比例混合而成。该配方组成的抑菌药剂，抑菌效果最佳，其最小抑菌浓度MIC为3.906mg/mL。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种抑制鳗弧菌的中草药配方，采用中草药防治鱼病,不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染等问题,而且可以降低生产成本，具有天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉等优点，不会对人和动物造成毒副作用，并且制作工序简单，容易操作，易于实现工厂化生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

本发明一种抑制鳗弧菌的中草药配方，下述42种中草药对鳗弧菌均具不同程度的抑菌作用。

首先，五味子、石榴皮和艾叶对鳗弧菌的抑菌作用最强，最小抑菌浓度（MIC）均达到了12.5mg/mL。其次，芦荟、枯矾、儿茶、稀签草对鳗弧菌也有较强的抑菌作用，其MIC均为25mg/mL。此外，地榆、半边莲、功劳叶、槟榔、木瓜、乌桕、灸没药、白头翁、茵陈、天南星、黄芩等植物对鳗弧菌也有一定的抑菌作用，其MIC均为50mg/mL。穿心莲、虎杖片、使君子、蒲公英、蛇麻子、马齿苋、连翘、龙胆草、苍术、丹皮、牵牛子、公丁香、紫花地丁、威灵仙、龙葵、五倍子、黄芪、白花蛇舌草、柴胡、吴芋、乌梅、大青叶、车前草、羲术的23种草药对鳗弧菌的抑制作用并不很明显，其MIC均为100mg/mL。因此，可选用上述42种中草药中的至少一种作为鳗弧菌的抑制药剂（单一一种药剂或任意几种的混合药剂），具体见表1。

 表1 中草药对鳗弧菌的最小抑菌浓度MIC（mg/ml）

实施例2

本发明一种抑制鳗弧菌的中草药配方，该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：4：1：4的比例混合而成。结果表明，该配方对鳗弧菌具有显著的抑菌效果，均比单味药及其它组合的中草药复合配方的抑菌效果明显，其最小抑菌浓度MIC为3.906mg/mL。

石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：1：1：1的比例混合而成的中草药复合配方最小抑菌浓度MIC为25mg/mL，石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以4：1：4：8的比例混合而成的中草药复合配方最小抑菌浓度MIC为26.563mg/mL，均没有最佳中草药配伍的抑菌效果好。

实施例3 

中草药对鳗弧菌的体外抑菌试验

1、中草药选材及其药液制备

本研究选取的86种中草药均购自宁波市北京市同仁堂药店。86种中草药分别是：五味子、五倍子、乌梅、威灵仙、儿茶、地锦草、紫花地丁、枯矾、夏枯草、鹅不食、诃子肉、苏叶、漏芦子、决明子、木瓜、板蓝根、黄连、千里光、芦荟、公丁香、乌桕、艾叶、虎杖片、鹤虱、龙胆草、蛇莓草、功劳叶、连翘、没药、大黄、佩兰、榧子、茵陈、黄柏、吴芋、穿心莲、苏子、金银花、马齿苋、黄芪、甘草、天南星、青蒿、半边莲、白芍、石菖蒲、白芷、莱菔子、紫菀、白花蛇舌草、鱼腥草、苦参片、蒲公英、首乌、苍术、萹蓄、紫苏梗、覆盆子、百部、厚朴、蛇麻子、马鞭草、大青叶、百鲜皮、丹皮、牛蒡子、知母、贯众、乌药、郁金、白果、黄芩、牵牛子、车前草、使君子、龙葵、白头翁、重楼、北柴胡、野菊花、地榆、石榴皮、稀签草、生紫、槟榔、羲术。

将86种中草药分别进行粉碎、称重，按料液比1:10浸泡30min，用文火煎煮煮沸30min，过滤，滤渣再进行第二次水提，方法同前，合并两次滤液，将两次合并的滤液在100℃下加热浓缩至150mL，浓度为200mg/ml。其中挥发性中药要注意砂锅的盖子不能掀开，以免有效成分的散失。高温灭菌后置4℃冰箱中保存备用。使用前要先离心，然后再超净工作台上进行分装。

2、中草药对鳗弧菌最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定各药物的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)。中草药煎煮液的质量浓度为200 mg/mL，然后采用二倍稀释法稀释中草药原液，用无菌微量移液器吸取20μL活化的鳗弧菌菌液（鳗弧菌液的浓度为5.0×10⁷个/mL），接种到1mL含不同中草药浓度梯度的试管中（第1到第8管的质量浓度依次为100 mg/mL，50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL，3.13 mg/mL，1.56 mg/mL和0.78 mg/mL），另设阴性对照管与阳性对照管，阴性对照管为不添加菌液和中草药的LB培养基，阳性对照管为不添加中草药只添加菌液的LB培养基。接种后将试管置于28℃恒温培养24 h后观察结果。

最小抑菌浓度判定标准为：首先在阳性对照管生长菌呈浑浊状，而阴性对照管呈透明状的前提下，再观察其他管的浑浊情况，以判断不同质量浓度药液的抑菌作用，如管内呈浑浊，证明有细菌生长。如试管内澄清透明，证明无细菌生长。以肉眼观察不浑浊管的最小药物浓度作为该中草药对该菌株的最小抑菌菌浓度MIC。对于药液颜色深而难于判断的试管，做进一步平板涂布培养，在28℃下培养2d后，根据平板上菌体生长情况来确定试管内菌体生长情况，以液体培养24h抑制菌体生长最低浓度为该中草药最小抑菌浓度。

3、抑菌实验结果

各中草药对鳗弧菌的体外抑菌作用，结果如表1所示，86种中草药中有42种中草药对鳗弧菌具不同程度的抑菌作用。首先，五味子、石榴皮和艾叶对鳗弧菌的抑菌作用最强，MIC均达到了12.5mg/mL。其次，芦荟、枯矾、儿茶、稀签草对鳗弧菌也有较强的抑菌作用，其MIC均为25mg/mL。此外，地榆、半边莲、功劳叶、槟榔、木瓜、乌桕、灸没药、白头翁、茵陈、天南星、黄芩等植物对鳗弧菌也有一定的抑菌作用，其MIC均为50mg/mL。穿心莲、虎杖片、使君子、蒲公英、蛇麻子、马齿苋、连翘、龙胆草、苍术、丹皮、牵牛子、公丁香、紫花地丁、威灵仙、龙葵、五倍子、黄芪、白花蛇舌草、柴胡、吴芋、乌梅、大青叶、车前草、羲术等23种草药对鳗弧菌的抑制作用并不很明显，其MIC均为100mg/mL。地肤子、鹤虱、苏叶、地锦草、贯众瓣、蛇莓草、漏芦子、决明子、苦参片、黄柏、千里光、萹蓄、紫苏梗、青蒿、佩兰、夏枯草、石菖蒲、板蓝根、榧子、首乌、白芷、白果、莱菔子、诃子肉、苏子、郁金、鹅不食、白芍、百部、厚朴、生紫、野菊花、大黄、知母、百鲜皮、甘草、金银花、马鞭草、覆盆子、乌药、牛蒡子、重楼、黄连、鱼腥草等的44种中草药在试验浓度下对鳗弧菌无抑菌作用。

 实施例4

抑菌效果最优的中草药配方设计

从实施例1的42种中草药中选取来源丰富、价格便宜且对鳗弧菌抑菌效果最显著的四种最常用的中草药，即石榴皮、艾叶、五味子和芦荟，用其进行正交试验，根据正交试验方法设计出不同的中草药配方，再采用上述方法测试不同中草药配方对鳗弧菌的抑菌效果。

为了研究不同中草药配伍对鳗弧菌的最小抑菌浓度，本研究选用四因素四水平L₁₆(4⁵)的正交试验设计方法。正交试验中四个因素（如表2所示）分别是石榴皮、艾叶、五味子和芦荟，四个水平分别是6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25mg/ml和50mg/ml。以正交试验的16种配方（如表3所示）为母液，通过上述实施例3所述二倍稀释法测定鳗弧菌的最小抑菌浓度，分析各因素对鳗弧菌的最小抑菌浓度的差异显著性。最后通过正交试验结果找到各因素的最佳浓度配比，并测定最佳中草药配比对鳗弧菌的最小抑菌浓度，验证正交试验分析得到的结果。

表2  正交试验因素水平表

表3 中草药对鳗弧菌抑菌作用正交试验结果

直观分析表3可看出，四个因素的极差从大到小依次为R_C＞R_A＞R_B＞R_D，极差相差越大，说明对鳗弧菌的抑菌作用越强，四个因素对鳗弧菌的抑菌作用的影响由大到小依次为五味子＞石榴皮＞艾叶＞芦荟。并且从平均值上看，均值越小说明抑菌作用越强，因此得出最优水平为A₂B₄C₂D₄，说明对鳗弧菌抑菌作用最强的中草药复方药剂配方是由石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：4：1：4的比例混合而成的。以最优配方配制复合药剂进行验证实验，实验结果表明，其MIC为3.906mg/mL。即石榴皮、艾叶、五味子和芦荟按质量比1：4：1：4的比例混合可作为鳗弧菌抑菌药物的首选配伍组合。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种抑制鳗弧菌的中草药组合物，其特征在于：该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、艾叶、五味子和芦荟以1：4：1：4的比例混合而成。