CN103110886B - 一种抑制链球菌的中草药配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制链球菌的中草药配方，特点是包括石榴皮、儿茶、五味子、木瓜、乌梅、地榆、覆盆子、诃子肉、天南星、决明子、枯矾、鹤虱、虎仗片、紫花地丁、大黄、没药、甘草、连翘、龙胆草、鱼腥草、艾叶、苦参片、榧子、白芷、白芍、黄连、公丁香、蛇麻子、白头翁、苍术、黄岑、威灵仙、郁金和黄柏中的至少一种，其中石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比1:1:2:2的比例混合而成的配方抑菌效果最佳，优点是天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉。

Description

一种抑制链球菌的中草药配方

技术领域

本发明涉及一种中草药配方，尤其是涉及一种抑制链球菌的中草药配方。

背景技术

目前鱼类链球菌病已经成为一种世界性疾病，它给世界水产养殖业造成巨大的经济损失。链球菌属中的无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus iniae）是引起鱼病的主要致病菌。据估计，全球每年单因海豚链球菌病造成的鱼类经济损失已超过1.5亿美元，链球菌已成为全球性主要鱼类致病菌之一。链球菌可感染多种海、淡水养殖鱼类 (如日本鲆、鳗、虹鳟、罗非鱼、管篮子鱼、鰤鱼、牙鲆、平鮋、竹关鱼、红鳍东方纯、鲷、银鲑、单角革魨、褐篮子鱼、大菱鲆、银鲑等)，同时还可在不同种鱼类之间交叉传播，还可因操作不慎随伤口感染人类。因此，链球菌引起的鱼类疾病，不仅对渔业生产造成危害，而且对食品安全和人类健康也构成威胁，应引起足够重视。

链球菌所引起的鱼病症状，因不同的种的鱼类有所差异，如银大麻哈鱼为例，其外部主要症状为体色发黑，眼球突出，腹部膨胀，肛门扩张，鳃退色。有时鳍基部出血，内部主要症状为肝退色，肾肿大，脾多肿大，肠多充满白色粘液或黄色积水。链球菌与弧菌混合感染症，除上述症状外，外表还有一处或多处隆起或溃疡，体表和内脏严重出血。链球菌病对牙鲆危害极大，在1991年日本，链球菌病所引起的牙鲆损失量达278吨，损失金额达6亿日元；而在2004年我国广东省阳西县华南研究所罗非鱼养殖场，发生链球菌危害的达到40%的养殖面积，有些池塘的罗非鱼3-5天死亡率高达50%，2007年广州地区也有不少地方发生此病，其中花都区、白云区、番禺区一些养殖户损失非常惨重。

目前对该链球菌的防治主要是利用化学药品、抗生素或减活、灭活疫苗，其中主要以投放喂食抗生素为主要手段。但长期滥用药物或抗生素会引起水环境污染，从而导致养殖环境恶化，生态平衡失调，并且细菌还会产生耐药性，药物残留还对食用者构成潜在的威胁。而中草药无抗药性，无残留，无环境污染，不引发药源性疾病且抑菌杀菌效果明显，越来越引起人们的关注。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染,而且可以降低生产成本的抑制链球菌的中草药配方。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抑制链球菌的中草药配方，包括石榴皮、儿茶、五味子、木瓜、乌梅、地榆、覆盆子、诃子肉、天南星、决明子、枯矾、鹤虱、虎仗片、紫花地丁、大黄、没药、甘草、连翘、龙胆草、鱼腥草、艾叶、苦参片、榧子、白芷、白芍、黄连、公丁香、蛇麻子、白头翁、苍术、黄岑、威灵仙、郁金和黄柏中的至少一种。

该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比1:1:2:2的比例混合而成。该配方组成的抑菌药剂，抑菌效果最佳，其最小抑菌浓度MIC为2.34mg/ml。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种抑制链球菌的中草药配方，采用中草药防治鱼病,不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染等问题,而且可以降低生产成本，具有天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉等优点，不会对人和动物造成毒副作用，并且制作工序简单，容易操作，易于实现工厂化生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

本发明一种抑制链球菌的中草药配方，下述34种中草药对链球菌均具不同程度的抑菌作用。

首先石榴皮、儿茶和五味子对链球菌的体外抑菌作用最强，最小抑菌浓度（MIC）均达到了6.25mg/ml；其次是乌梅和木瓜对链球菌的抑菌作用较强，最小抑菌浓度（MIC）达到了12.5mg/ml，地榆对链球菌也具有一定的抑菌作用，MIC为25mg/ml；覆盆子、诃子肉、天南星和决明子对链球菌的体外抑菌作用较弱，MIC为50mg/ml；枯矾、鹤虱、虎仗片、紫花地丁、大黄、没药、甘草、连翘、龙胆草、鱼腥草、艾叶、苦参片、榧子、白芷、白芍、黄连、公丁香、蛇麻子、白头翁、苍术、黄岑、威灵仙、郁金和黄柏对链球菌的体外抑菌作用的MIC为100mg/ml。因此，可选用上述34种中草药中的至少一种作为链球菌的抑制药剂（单一一种药剂或任意几种的混合药剂），具体见表1，

  表1 中草药对链球菌的最小抑菌浓度MIC（mg/ml）

实施例2

本发明一种抑制链球菌的中草药配方，该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比1:1:2:2的比例混合而成。结果表明，该配方对链球菌具有显著的抑菌效果，均比单味药及其它组合的中草药复合配方的抑菌效果明显，其最小抑菌浓度MIC为2.34mg/ml。而石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比1:1:1:1的比例混合而成的中草药复合配方的最小抑菌浓度MIC为6.25mg/ml，石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比8:2:4:1的比例混合而成的中草药复合配方的最小抑菌浓度MIC为11.42mg/ml，均没有最佳配方的抑菌效果好。

 实施例3

中草药对链球菌的体外抑菌试验

1、中草药选材及其药液制备

本研究选取的86种中草药均购自宁波市北京同仁堂药店。五味子、五倍子、乌梅、威灵仙、儿茶、地锦草、紫花地丁、枯矾、夏枯草、鹅不食、诃子肉、苏叶、漏芦子、决明子、木瓜、板蓝根、黄连、千里光、芦荟、公丁香、乌桕、艾叶、虎杖片、鹤虱、龙胆草、蛇莓草、功劳叶、连翘、没药、大黄、佩兰、榧子、茵陈、黄柏、吴芋、穿心莲、苏子、金银花、马齿苋、黄芪、甘草、天南星、青蒿、半边莲、白芍、石菖蒲、白芷、莱菔子、紫菀、白花蛇舌草、鱼腥草、苦参片、蒲公英、首乌、苍术、萹蓄、紫苏梗、覆盆子、百部、厚朴、蛇麻子、马鞭草、大青叶、百鲜皮、丹皮、牛蒡子、知母、贯众、乌药、郁金、白果、黄芩、牵牛子、车前草、使君子、龙葵、白头翁、重楼、北柴胡、野菊花、地榆、石榴皮、稀签草、生紫、槟榔、羲术。

将86种中草药分别进行粉碎、称重，按料液比1:10浸泡30min，用文火煎煮，煮沸30min，过滤，滤渣再进行第二次水提，方法同前，合并两次滤液，将两次合并的滤液在100℃下加热浓缩至150ml，浓度为200mg/ml。其中挥发性中药要注意砂锅的盖子不能掀开，以免有效成分的散失。高温灭菌后置4℃冰箱中保存备用。使用前要先离心，然后再超净工作台上进行分装。

 2、中草药对链球菌最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定各药物的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)。中草药煎煮液的质量浓度为200 mg/mL，然后采用二倍稀释法稀释中草药原液，用无菌微量移液器吸取20μL活化的链球菌菌液（菌液浓度为5.0×10⁷个/ml），接种到1mL含不同中草药浓度梯度的试管中（第1到第8管的质量浓度依次为100 mg/mL，50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL，3.13 mg/mL，1.56 mg/mL和0.78 mg/mL），另设阴性对照管与阳性对照管， 阴性对照管为不添加菌液和中草药的LB培养基，阳性对照管为不添加中草药只添加菌液的LB培养基，接种后将试管置于28℃恒温培养24 h后观察结果。

最小抑菌浓度判定标准为：首先在阳性对照管生长菌呈浑浊状，而阴性对照管呈透明状的前提下，再观察其他管的浑浊情况，以判断不同质量浓度药液的抑菌作用，如管内呈浑浊，证明有细菌生长。如试管内澄清透明，证明无细菌生长。以肉眼观察不浑浊管的最小药物浓度作为该药对该菌株的最小抑菌菌浓度MIC。对于药液颜色深而难于判断的试管，做进一步平板涂布培养，在28℃下培养2d后，根据平板上菌体生长情况来确定试管内菌体生长情况，以液体培养24h抑制菌体生长最低浓度为最小抑菌浓度。

3、抑菌实验结果

各中草药对链球菌的体外抑菌作用，结果如表1所示，86种中草药中有34种中草药对链球菌具不同程度的抑菌作用。首先石榴皮、儿茶和五味子对链球菌的体外抑菌作用最强，最小抑菌浓度（MIC）均达到了6.25mg/ml；其次是乌梅和木瓜对链球菌的抑菌作用较强，最小抑菌浓度（MIC）达到了12.5mg/ml，地榆对链球菌也具有一定的抑菌作用，MIC为25mg/ml；覆盆子，诃子肉，天南星和决明子对链球菌的体外抑菌作用较弱，MIC为50mg/ml；枯矾、鹤虱、虎仗片、紫花地丁、大黄、没药、甘草、连翘、龙胆草、鱼腥草、苏叶、艾叶、苦参片、榧子、白芷、白芍、黄连、公丁香、蛇麻子、白头翁、苍术、黄岑、威灵仙、郁金和黄柏对链球菌的体外抑菌作用最弱，MIC为100mg/ml。其它52种中草药对链球菌没有抑菌作用。

 实施例4

抑菌效果最优的中草药配方设计

从实施例1的34种中草药中选取来源丰富、价格便宜且对链球菌抑菌效果最显著的四种药，即石榴皮、儿茶、五味子和乌梅，用其进行正交试验，根据正交试验方法设计出不同的中草药配方，再采用上述方法测试不同中草药配方对链球菌的抑菌效果。

为了研究不同中草药配伍对链球菌的最小抑菌浓度，本研究选用四因素四水平L₁₆(4⁵)的正交试验设计方法。正交试验中四个因素（表2）分别是石榴皮、儿茶、五味子和乌梅，四个水平分别是6.25mg/ml，12.5 mg/ml，25mg/ml和 50mg/ml。以正交试验的16种配方（表3）为母液，测定其对链球菌的最小抑菌浓度MIC，分析各因素对链球菌的最小抑菌浓度的差异显著性。最后通过正交试验结果找到各因素的最佳浓度配比，并测定最佳中草药配伍对链球菌的最小抑菌浓度，验证正交试验分析得到的结果。

表2 正交试验因素水平表

 

表3 中草药配伍对链球菌抑菌作用正交试验结果

直观分析表3可看出，该四味中草药中，极差R值由大到小依次为石榴皮、五味子、乌梅、儿茶，极差相差越大，说明对链球菌的抑菌作用的影响越强，四个因素对链球菌的抑菌作用的影响由大到小依次石榴皮、五味子、乌梅、儿茶。

虽然石榴皮的R值最大，但是另三种中草药的R值非常接近。并且从平均值上看，均值越小说明抑菌作用越强，通过均值比较可以推断出石榴皮的第一个水平、儿茶的第一个水平、五味子的第二个水平和乌梅的第二个水平组成的配伍，按照质量比1:1:2:2的比例混合时，为抑制链球菌的最佳中草药配方的。经试验验证后，该配方对链球菌的最低抑菌浓度（MIC）为2.34mg/ml。即石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按浓度比1:1:2:2的比例混合可作为链球菌抑菌药物的首选配伍组合。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种抑制链球菌的中草药组合物，其特征在于该中草药由以下原料和重量比组成：石榴皮、儿茶、五味子和乌梅按重量比1:1:2:2的比例混合而成。