CN103110772A - 一种抑制温和气单胞菌的中草药配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，特点是包括儿茶、五倍子、五味子、乌梅、石榴皮、枯矾、地丁、威灵仙、地榆、公丁香、黄连、鹤虱、稀莶草、艾叶、苏子、地锦草、虎杖、漏芦子、决明子、夏枯草、板蓝根、白芷、鹅不食、白芍、炙没药、厚朴、紫苑、蛇床子、野菊花、大黄、连翘、蛇舌草、覆盆子、白头翁、槟榔、吴茱萸、龙胆草、木瓜、生苍术、大青叶、鱼腥草、丹皮和乌桕中的至少一种，其中儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:4:1:2的质量比混合成的配方抑菌效果最佳，优点是天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉。

Description

一种抑制温和气单胞菌的中草药配方

技术领域

本发明涉及一种中草药配方，尤其是涉及一种抑制温和气单胞菌的中草药配方。

背景技术

温和气单胞菌作为气单胞菌属的另一个常见的致病种，广泛分布于各种淡水中，是水生生物的主要致病病原之一。它可以危害几乎所有的淡水鱼类、蛙类、鳖甚至鸟类和哺乳动物， 引起败血症、腹泻等为主要症状的疾病。温和气单胞菌对鱼类有极强的致病力，能侵入健康鱼体，使鱼体内脏出血后而快速死亡，温和气单胞菌还可以引起鲤鱼的皮肤溃烂。温和气单胞菌是我国水产养殖淡水鱼中最常见的致病菌之一，也是我国沿海地区人群中最常见的致病菌之一，由于温和气单胞菌可以通过患病鱼的消化道感染人，所以当人类食用感染温和气单胞菌后的鱼后，会出现腹泻、败血症等严重威胁人类健康的疾病。

目前对温和气单胞菌的防治主要是利用化学药品、抗生素或减活、灭活疫苗，其中主要以投放喂食抗生素为主要手段。但长期滥用药物或抗生素会引起水环境污染，从而导致养殖环境恶化，生态平衡失调，并且细菌还会产生耐药性，药物残留还对食用者构成潜在的威胁。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染,而且可以降低生产成本的抑制温和气单胞菌的中草药配方。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，包括儿茶、五倍子、五味子、乌梅、石榴皮、枯矾、地丁、威灵仙、地榆、公丁香、黄连、鹤虱、稀莶草、艾叶、苏子、地锦草、虎杖、漏芦子、决明子、夏枯草、板蓝根、白芷、鹅不食、白芍、炙没药、厚朴、紫苑、蛇床子、野菊花、大黄、连翘、蛇舌草、覆盆子、白头翁、槟榔、吴茱萸、龙胆草、木瓜、生苍术、大青叶、鱼腥草、丹皮和乌桕中的至少一种。

该中草药由以下原料和重量比组成：儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:4:1:2的比例混合。该配方组成的抑菌药剂，抑菌效果最佳，其最小抑菌浓度MIC为2.93mg/ml。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，采用中草药防治鱼病,不仅可以避免细菌耐药性、毒素积累和环境污染等问题，而且可以降低生产成本，具有天然、无毒无残留、不产生耐药性、价格低廉等优点，不会对人和动物造成毒副作用，并且制作工序简单，容易操作，易于实现工厂化生产。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

本发明一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，下述43种中草药对温和气单胞菌均具不同程度的抑菌作用。

首先，儿茶和五倍子等对温和气单胞菌的抑菌作用最强，其MIC均为6.25 mg/ml；五味子、乌梅和石榴皮等对温和气单胞菌抑制作用也很强，其MIC均为12.5mg/ml。其次，枯矾、地丁、威灵仙、地榆、公丁香和黄连等对温和气单胞菌均有较强的抑制作用，其MIC均为25mg/ml。再次，鹤虱、稀莶草、艾叶、苏子、地锦草、虎杖、漏芦子、决明子、夏枯草、板蓝根、白芷、鹅不食、白芍、炙没药、厚朴、紫苑、蛇床子、野菊花、大黄、连翘、蛇舌草、覆盆子、白头翁、槟榔、吴茱萸、龙胆草、木瓜、生苍术、大青叶、鱼腥草、丹皮和乌桕对温和气单胞菌的抑制作用稍弱，其MIC均为100mg/ml。因此，可选用上述中草药中的至少一种作为温和气单胞菌的抑制药剂，而抑菌作用强的儿茶、五倍子、五味子、乌梅和石榴皮等可作为防治温和气单胞菌的首选抑菌药物，具体见表1。

表1 中草药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度MIC（mg/ml）

 实施例2

本发明一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，该中草药由以下原料和重量比组成：儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:4:1:2的比例混合。结果表明，该配方对温和气单胞菌具有显著的抑菌效果，均比单味药及其它组合的中草药复合配方的抑菌效果明显，其最小抑菌浓度MIC为2.93mg/ml。

儿茶、五倍子、五味子和乌梅以1:1:1:1的比例混合的中草药复合配方的最小抑菌浓度MIC为12.5mg/ml，儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:2:1:8的比例混合的中草药复合配方的最小抑菌浓度MIC为20.31mg/ml，均没有最佳配方的抑菌效果好。

  实施例3

中草药对温和气单胞菌的体外抑菌试验

1、中草药选材及其药液制备

本研究选取的86种中草药均购自宁波市北京同仁堂药店。这86种中草药分别是：地榆、石榴皮、枯矾、地肤子、鹤虱、稀签草、半边莲、艾叶、苏子、穿心莲、地锦草、贯众、虎杖片、蛇莓草、使君子、漏芦子、决明子、苦参片、黄柏、功劳叶、千里光、蒲公英、萹蓄、紫苏梗、青蒿、紫花地丁、佩兰、茵陈、夏枯草、石菖蒲、板蓝根、榧子、（生）首乌、白芷、白果、莱菔子、诃子肉、苏子、威灵仙、郁金、鹅不食、白芍、百部、炙没药、龙葵、厚朴、紫苑、儿茶、天南星、五倍子、黄芪、蛇床子、野菊花、大黄（生军）、知母、白鲜皮、甘草、马齿苋、金银花、连翘、马鞭草、白花蛇舌草、（北）柴胡、五味子、覆盆子、白头翁、槟榔、乌药、吴芋、龙胆草、木瓜、（生）苍术、黄芩、芦荟、乌梅、大青叶、鱼腥草、丹皮、牵牛子、牛蒡子、车前草、重楼、公丁香、黄连、（生）莪术、乌桕。

将86种中草药分别进行粉碎、称重，按料液比1:10浸泡30min，用文火煎煮煮沸30min，过滤，滤渣再进行第二次水提，方法同前，合并两次滤液，将两次合并的滤液在100℃下加热浓缩至150mL，浓度为200mg/ml。其中挥发性中药要注意砂锅的盖子不能掀开，以免有效成分的散失。高温灭菌后置4℃冰箱中保存备用。使用前要先离心，然后再超净工作台上进行分装。

2、中草药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法测定各药物的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)。中草药煎煮液的质量浓度为200 mg/mL，然后采用二倍稀释法稀释中草药原液，用无菌微量移液器吸取20μL活化的温和气单胞菌菌液（菌液浓度为5.0×10⁷个/ml），接种到1mL含不同中草药浓度梯度的试管中（第1到第8管的质量浓度依次为100 mg/mL，50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL，3.13 mg/mL，1.56 mg/mL和0.78 mg/mL），第9管在培养基中加菌液而不加中草药药液为阳性对照，第10管在培养基中加中草药药液而不加菌液为阴性对照。接种后将试管置于28℃恒温培养24 h后观察结果。

最小抑菌浓度判定标准为：首先在阳性对照管生长菌呈浑浊状，而阴性对照管呈透明状的前提下，再观察其他管的浑浊情况，以判断不同质量浓度药液的抑菌作用，如管内呈浑浊，证明有细菌生长。如试管内澄清透明，证明无细菌生长。以肉眼观察不浑浊管的最小药物浓度作为该中草药对该菌株的最小抑菌菌浓度MIC。对于药液颜色深而难于判断的试管，做进一步平板涂布培养，在28℃下培养2d后，根据平板上菌体生长情况来确定试管内菌体生长情况，以液体培养24h抑制菌体生长最低浓度为最小抑菌浓度。

3、抑菌实验结果

各中草药对温和气单胞菌的体外抑菌作用，结果表明如表1所示，86种中草药中有43种中草药对温和气单胞菌具不同程度的抑菌作用。首先，儿茶和五倍子等对温和气单胞菌的抑菌作用最强，其MIC均为6.25 mg/ml；五味子、乌梅和石榴皮等对温和气单胞菌抑制作用也很强，其MIC均为12.5mg/ml。其次，枯矾、地丁、威灵仙、地榆、公丁香和黄连等对温和气单胞菌均有较强的抑制作用，其MIC均为25mg/ml。再次，鹤虱、稀莶草、艾叶、苏子、地锦草、虎杖、漏芦子、决明子、夏枯草、板蓝根、白芷、鹅不食、白芍、炙没药、厚朴、紫苑、蛇床子、野菊花、大黄、连翘、蛇舌草、覆盆子、白头翁、槟榔、吴茱萸、龙胆草、木瓜、生苍术、大青叶、鱼腥草、丹皮和乌桕艾对温和气单胞菌的抑制作用不是很明显，其MIC均为100mg/ml。而地肤子、半边莲、穿心莲、贯众、使君子、苦参片、功劳叶、千里光、蒲公英、紫苏梗、佩兰、茵陈、石菖蒲、生首乌、白芷、白果、莱菔子、柯子肉、苏子、郁金、百部、龙葵、天南星、黄芪、知母、白鲜皮、甘草、马齿苋、金银花、北柴胡、乌药、芦荟、牵牛子、牛蒡子、车前草和生莪术等其他中草药在试验浓度下对温和气单胞菌无抑菌作用。即儿茶、五倍子、五味子、乌梅和石榴皮等可作为防治温和气单胞菌的首选抑菌药物。

  实施例4

抑菌效果最优的中草药配方设计

从实施例1的43种中草药中选取来源丰富、价格便宜且对温和气单胞菌抑菌效果最显著的四种最常用的中草药，即儿茶、五倍子、五味子和乌梅，用其进行正交试验。

为了研究不同中草药配伍对温和气单胞菌的最小抑菌浓度，本研究选用四因素四水平L₁₆(4⁵)的正交试验设计方法。正交试验中四个因素（表2）分别是儿茶、五倍子、五味子和乌梅，四个水平分别是3.125 mg/ml、6.25 mg/ml、12.5 mg/ml和25mg/ml。以正交试验的16种配方（表3）为母液，采用上述实施例3的方法测定其对温和气单胞菌的最小抑菌浓度，分析各因素对温和气单胞菌的最小抑菌浓度的差异显著性。通过正交试验结果找到各因素的最佳浓度配比，并测定最佳中草药配伍对温和气单胞菌的最小抑菌浓度，验证正交试验分析得到的结果。

表2 正交试验因素水平表

表3 中草药配伍对温和气单胞菌抑菌作用的正交试验结果

 直观分析表3可以看出，四个因素的极差从大到小依次为R_C>R_D>R_B>R_A，极差相差越大，说明对温和气单胞菌的抑菌作用的影响越强，即五味子的影响作用最明显，乌梅的影响作用较明显，五倍子的影响作用较弱，儿茶的影响作用最差。从平均值上看，均值越小说明抑菌作用越强，即因素A的第三水平，因素B的第四水平，因素C的第二水平，因素D的第三水平最好，最优的联合用药组合为A₃B₄C₂D₃，即儿茶、五倍子、五味子和乌梅的浓度分别为12.5mg/m、25 mg/ml、6.25 mg/ml 和12.5mg/ml混合起来组成的中药配伍对温和气单胞菌具有最强的抑菌作用。对A₃B₄C₂D₃ (儿茶、五倍子、五味子和乌梅的浓度分别为12.5mg/ml、25mg/ml、6.25mg/ml 和12.5mg/ml)进行验证，验证结果表明，A₃B₄C₂D₃配伍用药的最小抑菌浓度为2.93mg/ml。即儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:4:1:2的质量比混合可作为温和气单胞菌抑菌药物的首选配伍组合。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，其特征在于：包括儿茶、五倍子、五味子、乌梅、石榴皮、枯矾、地丁、威灵仙、地榆、公丁香、黄连、鹤虱、稀莶草、艾叶、苏子、地锦草、虎杖、漏芦子、决明子、夏枯草、板蓝根、白芷、鹅不食、白芍、炙没药、厚朴、紫苑、蛇床子、野菊花、大黄、连翘、蛇舌草、覆盆子、白头翁、槟榔、吴茱萸、龙胆草、木瓜、生苍术、大青叶、鱼腥草、丹皮和乌桕中的至少一种。

2.根据权利要求1中的一种抑制温和气单胞菌的中草药配方，其特征在于：该中草药由以下原料和重量比组成：儿茶、五倍子、五味子和乌梅以2:4:1:2的比例混合。