CN103109812B - 三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用 - Google Patents
三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供三裂蟛蜞菊（Wedelia trilobata）中的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。试验结果证明，此类化合物可以诱导烟草自身产生系统获得性抗性（SAR），显著抑制TMV对寄主的初侵染，从而减少病毒进入寄主细胞并进一步复制和增值的机会，起到对寄主保护的作用；对TMV侵染的抑制率优于市售抗病毒农药“宁南霉素”。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及三裂蟛蜞菊（Wedelia trilobata）中的倍半萜内酯作为防控烟草花叶病的制剂，在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
背景技术
植物病毒是仅次于真菌和细菌的一类植物病害，危害大且很难防治，有“植物癌症”之称。烟草花叶病毒病是烤烟生产的主要病害之一。三裂蟛蜞菊（Wedelia trilobata）是中国南方的一种入侵植物，具有超强的繁殖能力，能够通过化感作用抑制其它植物的生长而发展成单优种群。民间主要用来治疗蛇伤、鱼伤、腹泻、肾结石和感冒等疾病，其主要成分倍半萜内酯具有抗癌和抗肝毒性等作用。迄今，未有三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯作为防控烟草花叶病的制剂，在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
下列结构式所示的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用，
所述的应用，其中倍半萜内酯为从三裂蟛蜞菊中提取的倍半萜内酯。
所述的应用，其中倍半萜内酯化合物由下述方法获得：将三裂蟛蜞菊干燥全草经95%甲醇回流提取3次，得到的浸膏在水中溶解后分别用石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇四部分；将氯仿部分用硅胶100-200目，石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析分离，得到5个部分，其中石油醚/乙酸乙酯6:4部分经硅胶和Sephadex LH-20凝胶进行分离后得到化合物1，2，5和6；其中石油醚/乙酸乙酯1:1部分经相同分离过程得到化合物3和4；将石油醚部分用硅胶100-200目，石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析分离，得到5个部分，其中石油醚/乙酸乙酯6:4部分经硅胶，Sephadex LH-20凝胶和高效液相色谱进行分离后得到化合物7和8。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99%，优选为0.5-90%的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型，如液体制剂（注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等）、固体制剂（片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等）、喷剂、气雾剂等。
附图说明
图1 接种3天后施药叶中病毒CP的积累；
图2 接种7天后新生叶中病毒CP的积累；
图3 不同浓度下化合物1对烟叶中PAL酶活性的促进作用。
具体实施方式：
下面用本发明的实际例子来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
化合物提取和分离：
三裂蟛蜞菊（Wedelia trilobata）干燥全草经95%甲醇回流提取3次（4h，4h，3h），得到的浸膏（11.3%）在水中溶解后分别用石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇四部分。将氯仿部分用硅胶（100-200目），石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析分离，得到5个部分。其中石油醚/乙酸乙酯6:4部分经硅胶和Sephadex LH-20凝胶进行分离后可得到化合物1（0.00021%），2（0.000061%），5（0.0002%）和6（0.000052%）。其中石油醚/乙酸乙酯1:1部分经相同分离过程可得到化合物3（0.0002%）和4（0.000052%）。将石油醚部分用硅胶（100-200目），石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析分离，也得到5个部分。其中石油醚/乙酸乙酯6:4部分经硅胶，Sephadex LH-20凝胶和高效液相色谱进行分离后可得到化合物7（0.00015%）和8（0.00034%）。
用上述方法得到的化合物1－8的结构式为：
实施例2：
1、实验方法
心叶烟半叶枯斑法：挑选健康合适的心叶烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的3片叶子，供试化合物分离自三裂蟛蜞菊，用二甲基亚砜（DMSO）溶解成10mg/ml的母液于4℃保存，临用时用无菌水稀释为所需浓度，DMSO的终浓度25μl/ml对实验结果无影响。每片叶子的一半均匀施药100μl作为处理，另一半施以25μl/ml DMSO溶液。3h后每片叶子摩擦接种50μg/ml TMV 200μl，未施药的一半作为阳性对照，未施药且摩擦接种25μl/ml DMSO溶液的叶片作为空白。10min后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3-4天后按公式计算TMV抑制率：1-（处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数）×100。每个化合物重复三次。
2、实验结果
由于心叶烟属于TMV的枯斑寄主，可以通过比较只接种病毒的叶片和经化合物处理叶片的枯斑数量及枯斑大小来判断化合物是否抑制了病毒的初侵染。表1为化合物1-8在不同浓度下与对照药物“宁南霉素”在心叶烟上对TMV侵染抑制率的比较，由结果可知，化合物1-8可以显著抑制TMV对寄主的初侵染，从而减少病毒进入寄主细胞并进一步复制和增值的机会，起到对寄主保护的作用。在低浓度下化合物1-8对TMV侵染的抑制率由于市售抗病毒农药“宁南霉素”
表1化合物1-8在不同浓度下与宁南霉素在心叶烟上对TMV侵染抑制率的比较
实施例2：
（1）实验方法
普通烟K326体内实验（叶圆片法）：挑选健康合适的普通烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的2片叶子，供试化合物用无菌水稀释为所需浓度，每片叶子均匀施药200μl。24h后，每片叶子摩擦接种50μg/ml TMV 200μl；未施药的接种叶片作为阳性对照，未施药且摩擦接种25μl/ml DMSO溶液的叶片作为阴性对照。10min后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。3天后将叶片切成直径1cm的圆片，取10片进行Western-blot检测。接种7天后取施药叶的上位新叶，将叶片切成直径1cm的圆片，用于检测系统获得性抗性。每个化合物重复三次。
（2）实验结果
由于普通烟K326属于TMV的系统寄主，可以通过Western-blot方法比较烟草叶片中TMV外壳蛋白（CP）的积累量从而得知预施化合物是否抑制了病毒的积累和转移。由图1及图2可见，化合物1和6在施药叶和新生叶中均有良好的诱导活性，化合物2，7和8在新生叶中具有良好的诱导活性。
实施例3：
1、实验方法
烟叶中苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定：将不同浓度的化合物1喷洒于普通烟K326的叶片上，分别于6小时和24小时取烟叶样品。相同浓度DMSO处理的烟叶为阴性对照。取鲜叶0.5g，加10%聚乙烯吡咯烷酮（0.05mol/L，pH 8.8硼酸缓冲液配制）0.5mL加2mL含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液（pH 8.0），4℃下研磨，10000r/min离心15min，取上清液1mL（或稀释为适合浓度），加1mL0.02mol/L苯丙氨酸（0.05mol/L，pH 8.8硼酸缓冲液配制），加2mL重蒸馏水，对照不加苯丙氨酸，多加1mL重蒸水，总体积为4mL，2min时，290nm波长下测OD值。或置于恒温水浴30℃保温30min后290nm波长下测OD值，以光密度变化0.01所需的酶量为一个活性单位（相当于每毫升反应混合物形成1μg肉桂酸）。结果以每小时每克鲜重产生的肉桂酸量表示，即μmol/g-1·h-1。
2、实验结果
PAL酶是水杨酸合成途径上的关键酶，而水杨酸是系统获得性抗性（SAR）信号通路上的关键信号分子。实验结果表明，在较低浓度下，化合物1在处理烟叶6小时和24小时后均可以使烟叶中的PAL酶活性升高，从而促进水杨酸的合成，激活SAR信号通路，使烟草进行自我保护）（图3所示）。说明三裂蟛蜞菊中的此类化合物是可以诱导植物系统获得性抗性的一类小分子化合物。
Claims (3)
1.下列结构式所示的倍半萜内酯在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用，
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的倍半萜内酯为从三裂蟛蜞菊中提取的倍半萜内酯。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的倍半萜内酯化合物由下述方法获得：将三裂蟛蜞菊干燥全草经95%甲醇回流提取3次，得到的浸膏在水中溶解后分别用石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，得到石油醚，氯仿，乙酸乙酯和正丁醇四部分；将氯仿部分用硅胶100-200目，石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析分离，得到5个部分，其中石油醚/乙酸乙酯6:4部分经硅胶和Sephadex LH-20凝胶进行分离后得到化合物5；其中石油醚/乙酸乙酯1:1部分经相同分离过程得到化合物4。
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