CN103103275A - 一种基于手性四面体构象改变对目标dna浓度进行检测的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，属于纳米生物技术领域。本发明包括：不同尺寸金纳米粒子的合成、金纳米粒子修饰辅助DNA、手性四面体的组装以及目标DNA手性传感器的构建。本发明提供了一种利用金纳米粒子-DNA复合物构建的手性四面体，通过目标DNA与大尺寸金纳米粒子上的DNA杂交互补，组装结构从空间四面体变为三聚体，通过圆二色谱法信号的变化对目标DNA浓度进行检测，目标DNA的检测限为0.97fM，线性范围在5fM-1000fM。本发明方法能特异性地对目标DNA进行快速、超灵敏检测，为痕量DNA的检测提供了一种有效的方法。
Description
技术领域
一种基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，属于纳米生物技术领域。
背景技术
手性也称圆二色性，是一种识别分子构象的特殊吸收光谱。当一束平面偏振光通过光学活性物质时，由于左右圆偏振光的折射率不同，偏振面将旋转一定的角度，这种现象称为旋光。若光学活性物质含有生色团对左、右圆偏振光的吸收能力也不同，则造成通过的左、右圆偏振光不仅速度不同，而且振幅也不一样。因此，叠加产生的偏振光将不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，这种现象称为圆二色性。
手性分子是化学结构上镜像对称而又不能完全重合的分子，一个化合物的分子与其镜像不能互相叠合，则必然存在一个与镜像相应的化合物，这两个化合物之间的关系，相当于左手和右手的关系，即互相对映。这种互相对应的两个化合物成为对映异构体。这类化合物分子称为手性分子，它是一切生命的起源。
纳米技术被认为是对21世纪一系列高新技术的产生和发展有极为重要影响的一门热点学科。所谓纳米技术，是指用数千个分子或原子制造新型材料或微型器件的科学技术。其中纳米材料是整个纳米技术发展的基础。纳米材料广义上是三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或者由该尺度范围的物质为基本结构单元所构成的材料的总称。由于纳米尺寸的物质具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应，因而纳米材料具有异于普通材料的光、电、磁、热、力学、机械等性能。纳米技术的快速发展为手性研究提供了更大的发展空间，手性与纳米材料的结合起来，创建了手性纳米材料的新型研究领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于手性四面体的构象改变，快速、简单、超灵敏的检测DNA的方法。
本发明的技术方案：一种基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，包括不同尺寸金纳米粒子的合成、金纳米粒子修饰辅助DNA、手性四面体的组装以及目标DNA手性传感器的构建。
检测的目标DNA为：5’-GGC GAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGAAAC GCG CAC CTG AGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CATGTA TCT CCA GGC AAA-3’。工艺步骤为：
（1）30nm（Au1）金纳米粒子的合成
30nm金纳米粒子用柠檬酸三纳沸水中还原氯金酸法合成；
（2）10nm（Au2）金纳米粒子的合成
10nm金纳米粒子采用两步法合成；
（3）钾盐包裹金纳米粒子
步骤（1）合成的30nm（Au1）金纳米粒子及步骤（2）合成的10nm（Au2）金纳米粒子分别用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹使得在0.1-0.5M浓度NaCl溶液中稳定存在，从而提高DNA的组装效率；
（4）金纳米粒子和辅助DNA偶联
所用的辅助DNA共有四种：DNA1，DNA2，DNA3，DNA4；DNA1为与待测浓度的目标DNA完全互补，DNA2，DNA3，DNA4为依据目标DNA而专门设计；
DNA1：5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCTATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GACCAG TTC GCC-3’；
DNA2：5’-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGACAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCTCGT CGG-3’；
DNA3：5’-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCGAAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAACAG CCC-3’；
DNA4：5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGCAGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GACTGT CGC-3’；
将步骤（3）包裹的30nm（Au1）和10nm（Au2）的金纳米粒子通过巯基与辅助DNA进行偶联，所用的辅助DNA共有四种（DNA1，DNA2，DNA3，DNA4），形成四种不同的金纳米粒子-DNA复合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）；，
（5）手性四面体结构的组装
将步骤（4）组装的四种金纳米粒子-DNA复合物等摩尔浓度混合，形成手性四面体结构，并对此结构进行表征。
（6）手性四面体检测目标DNA。
所述的基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，步骤为：
（1）30nm（Au1）金纳米粒子的合成
30nm（Au1）金纳米粒子的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，再加入2.5mL质量浓度0.2%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8分钟后快速加入0.75mL质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15分钟；透射电镜显示平均粒径为30nm；
（2）10nm（Au2）金纳米粒子的合成
10nm（Au2）金纳米粒子的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水和1mL质量浓度1%氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.1mL质量浓度1%单宁酸，0.1mL25mM碳酸钾，15.8mL超纯水作为B液。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌30分钟到形成深红色溶液。然后将溶液加热回流2分钟形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm。
（3）钾盐包裹金纳米粒子
分别取步骤（1）制备的30nm（Au1）金纳米粒子及步骤（2）制备的10nm（Au2）金纳米粒子各自取10mL 50nM分别置于甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5μL 10mg/mL及乙瓶加入5μL 20mg/mL的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；各自用6000r/min及13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；
（4）金纳米粒子和辅助DNA偶联
步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子（Au1及Au2），分别取一份50μL30nm金纳米粒子（Au1）于1号PCR管中，分别取三份50μL 10nm金纳米粒子（Au2）于2，3及4号PCR管中，向4个管中依序各自加入1μL 10μM的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混匀后，向各体系中加入5μL5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；Au1-DNA1用6000r/min离心10分钟，Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4用13000r/min离心10分钟，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积5倍；
（5）手性四面体结构的组装
步骤（4）制备的四种金纳米粒子-DNA的复合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成手性四面体结构。这种手性四面体结构，因为引入了大尺寸、非球形的金纳米粒子，增加了结构的不对称性，所以在523nm处有很强的圆二色信号。
（6）手性四面体检测目标DNA
在步骤（5）的制备过程中加入与DNA1完全互补的目标DNA，此时，目标DNA会与Au1-DNA1互补杂交，其他三种金纳米粒子-DNA复合物（Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）组装形成10nm金的三聚体结构，此时手性四面体在523nm处的特征圆二色信号发生减弱。根据523nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线。本实验中，DNA的检测限为0.97fM，线性范围在5fM-1000fM。
表1DNA的编号、序列及长度
注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
本发明的有益效果：本发明制备了一种通过改变手性自组装四面体的构型，利用圆二色信号简单、快速、超灵敏地检测DNA的方法。为转基因产品今后的生产、监管提供了方便，可满足国内对其生产、监管的需要。
附图说明
图1：手性四面体组装结构的透射电镜图；
图2：加入目标DNA后的纳米材料组装结构透射电镜图；
图3：手性四面体中加入不同浓度目标DNA后的圆二色变化曲线图；沿着箭头的方向，DNA浓度依次为0pM，0.005pM，0.01pM，0.05pM，0.1pM，0.5pM，1.0pM，5pM；
图4：目标DNA检测的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：
（1）30nm（Au1）金纳米粒子的合成
30nm（Au1）金纳米粒子的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，再加入2.5mL 0.2%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8分钟后快速加入0.75mL1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15分钟；透射电镜显示平均粒径为30nm；
（2）10nm（Au2）金纳米粒子的合成
10nm（Au2）金纳米粒子的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水和1mL 1%氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠，0.1mL 1%单宁酸，0.1mL 25mM碳酸钾，15.8mL超纯水作为B液。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下将B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌30分钟到形成深红色溶液。然后将溶液加热回流2分钟形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm。
（3）钾盐包裹金纳米粒子
步骤（1）制备的30nm（Au1）金纳米粒子以及步骤（2）制备的10nm（Au2）金纳米粒子各取10mL 50nM，各自加入5μL 10mg/mL及5μL 20mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；各自用6000r/min及13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；
（4）金纳米粒子和辅助DNA偶联
步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子（Au1及Au2），分别取一份50μL30nm金纳米粒子（Au1）于1号PCR管中，分别取三份50μL 10nm金纳米粒子（Au2）于2，3及4号PCR管中，向4个管中依次加入1μL10μM的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混匀后，向各体系中加入5μL5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；Au1-DNA1用6000r/min离心10分钟，Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4用13000r/min离心10分钟，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积5倍；
（5）手性四面体结构的组装
步骤（4）制备的四种金纳米粒子-DNA的复合物（Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成手性四面体结构。这种手性四面体结构，因为引入了大尺寸、非球形的金纳米粒子，增加了结构的不对称性，所以在523nm处有很强的圆二色信号。
（6）手性四面体检测目标DNA
在步骤（5）的制备过程中加入与DNA1完全互补的目标DNA，此时，目标DNA会与Au1-DNA1互补杂交，其他三种金纳米粒子-DNA复合物（Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4）组装形成10nm金的三聚体结构，此时手性四面体在523nm处的特征圆二色信号发生减弱。根据523nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线。本发明中，目标DNA的检测限为0.97fM，线性范围在5fM-1000fM。
组装四面体结构的表征：
将上述组装好的产品进行5000r/min离心10min，弃上清，沉淀重分散到120μL的超纯水中，超纯水洗一次。电镜表征：7μL的上述处理过的样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥。投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200kV，如图1和2所示。圆二色谱表征：取组装好的体系100μL于比色皿中，用超纯水做空白对照。圆二色谱仪采用法国Bio-LogicMOS-450+SMF-300，如图3所示。
Claims (2)
1.一种基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，其特征在于：包括不同尺寸金纳米粒子的合成、金纳米粒子修饰辅助DNA、手性四面体的组装以及目标DNA手性传感器的构建；
检测的目标DNA为：5’- GGC GAA CTG GTC CCG TCT ACT TAC CGA AAC GCG CAC CTG AGA CCT TCT AAT AGG GAA AGC CGT AAT GTG CAT GTA TCT CCA GGC AAA -3’；
步骤为：
（1）30nm金纳米粒子Au1的合成
30nm金纳米粒子用柠檬酸三纳沸水中还原氯金酸法合成；
（2）10nm金纳米粒子Au2的合成
10nm金纳米粒子采用两步法合成；
（3）钾盐包裹金纳米粒子
步骤（1）合成的30nm金纳米粒子Au1及步骤（2）合成的10nm金纳米粒子Au2分别用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹使得在0.1-0.5M浓度NaCl溶液中稳定存在，从而提高DNA的组装效率；
（4）金纳米粒子和辅助DNA偶联
所用的辅助DNA共有四种：DNA1，DNA2，DNA3，DNA4；DNA1为与待测浓度的目标DNA完全互补，DNA2，DNA3，DNA4为依据目标DNA而专门设计；
DNA1：5’- TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC -3’；
DNA2：5’- TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG -3’；
DNA3：5’- TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC -3’；
DNA4：5’- TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC -3’；
将步骤（3）钾盐包裹的Au1和Au2通过巯基与辅助DNA进行偶联，形成四种不同的金纳米粒子-DNA复合物：Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4；
（5）手性四面体结构的组装
将步骤（4）组装的四种金纳米粒子-DNA复合物等摩尔浓度混合，组装手性四面体结构，并对此结构进行表征；
（6）手性四面体检测目标DNA。
2.根据权利要求1所述的基于手性四面体构象改变对目标DNA浓度进行检测的方法，其特征在于：
（1）30nm金纳米粒子Au1的合成
30nm金纳米粒子Au1的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，再加入2.5mL 0.2%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8分钟后快速加入0.75mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15分钟；透射电镜显示平均粒径为30nm；
（2）10nm金纳米粒子Au2的合成
10nm金纳米粒子Au2的合成方法为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水和1mL 1%氯金酸作为A液；另取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠，0.1mL 1%单宁酸，0.1mL 25mM碳酸钾，15.8mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下将B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌30分钟到形成深红色溶液，然后将溶液加热回流2分钟形成亮红色溶液，最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10nm；
（3）钾盐包裹金纳米粒子
分别取步骤（1）制备的30nm金纳米粒子Au1及步骤（2）制备的10nm金纳米粒子Au2各自取10mL 50nM分别置于甲瓶及乙瓶中，甲瓶加入5μL 10 mg/mL及乙瓶加入5μL 20mg/mL的二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；各自用6000r/min及13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；
（4）金纳米粒子和辅助DNA偶联
步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子Au1 及Au2，分别取一份50μL 30nm金纳米粒子Au1于1号PCR管中，分别取三份50μL 10nm金纳米粒子Au2于2，3及4号PCR管中，向4个管中依序各自加入1μL 10μM的DNA1，DNA2，DNA3及DNA4，混匀后，向各体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；Au1-DNA1用6000r/min离心10分钟， Au2-DNA2，Au2-DNA3及Au2-DNA4 用13000r/min 离心10分钟，，去除上清液，沉淀加水稀释至原体积5倍；
（5）手性四面体结构的组装
步骤（4）制备的四种金纳米粒子-DNA的复合物：Au1-DNA1，Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4，各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成手性四面体结构，这种手性四面体结构，因为引入了大尺寸、非球形的金纳米粒子，增加了结构的不对称性，所以在523nm处有很强的圆二色信号；
（6）手性四面体检测目标DNA
在步骤（5）的制备过程中加入与DNA1完全互补的目标DNA，此时，目标DNA会与Au1-DNA1互补杂交，其他三种金纳米粒子-DNA复合物Au2-DNA2，Au2-DNA3，Au2-DNA4组装形成10nm金的三聚体结构，此时手性四面体在523nm处的特征圆二色信号发生减弱；根据523nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线。
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