CN103468810B - 一种基于手性纳米材料对dna进行检测的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，属于纳米生物技术领域。本发明包括：金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立。本发明提供了一种新型的手性材料的制备方法，该方法是在原非手性组装材料的基础上，通过外加DNA的引入对其几何构象进行重构，从而将非手性纳米材料转变为手性纳米材料；利用圆二色谱可见光区（520nm）的信号变化，实现在阿摩尔（10^-18）水平对目标DNA进行快速、高效、超灵敏地检测。

Description

一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法

技术领域

一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，具体涉及一种用于DNA超灵敏检测的手性纳米材料的制备及DNA的检测方法，属于纳米生物技术领域。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的承担者，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。由于DNA分子中碱基序列的变异与人类许多遗传疾病有关，因此，对特定序列的DNA的分析以及对DNA链中碱基突变的检测在基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分深远的意义。传统DNA的检测方法主要是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)。PCR是一种在体外扩增DNA片段的重要技术。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，痕量模板DNA可扩增至几百万倍。PCR技术可以将部分DNA序列进行复制，信号放大，在灵敏度方面代表了检测的极限。尽管如此，PCR技术仍然存在一些固有的缺点，如成本高、需要专业技能和设备以及依赖聚合酶的操作、容易出现假阳性等，这些特点都严重阻碍了PCR的广泛应用。

随着纳米科学技术的兴起，纳米材料由于其独特的物理和化学属性已成为制备生物传感器的中流砥柱。纳米材料是一类结构单元的尺寸介于1-100nm范围之间的材料，由于它的尺寸已经接近电子的相干长度，它的性质因为强相干所带来的自组装超结构的性质发生很大变化。并且，其尺度已接近光的波长，加上其具有大表面的特殊效应，因此其所表现的特性，例如熔点、磁性、光学、导热、导电特性等等，往往不同于该物质在整体状态时所表现的性质。纳米传感器因仪器简单、价格低廉、测定快速准确和方法灵敏度高等特点已经广泛应用于环境、医药、食品等的检测中。手性纳米材料结合了纳米材料特殊的物理性质和手性分子化学结构上镜像对称性，这种新型复合材料可以将手性信号从紫外光区转移到可见光区，从而大大拓展了其应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于DNA超灵敏检测的手性纳米材料的制备及DNA的检测方法。

本发明的技术方案：一种基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法，包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立。工艺步骤为：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子；

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA共有四种（Y1, Y2，Y3, Y4，），形成四种不同的Au-DNA复合物（Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4）；

Y1：5’-SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA复合物，等比例混合组装形成金纳米粒子四面体；

（5）手性四面体的构建

步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段DNA环（含13个碱基），在步骤（4）组装的过程中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环被完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大，原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号；

（6）目标DNA手性传感器的建立

根据步骤（5）的方法构建基于手性检测的DNA传感器；在步骤（4）的制备过程中加入不同浓度的目标DNA：Y5，根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线；本发明中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM；

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

所述的基于手性纳米材料对DNA进行检测的方法：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子的方法为：分别取两个洁净的三角瓶，A瓶中加入158mL超纯水和2mL质量浓度1%氯金酸；B瓶中加入8mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.2mL质量浓度1%单宁酸，0.2mL 25mM碳酸钾，31.6mL超纯水。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌40分钟到形成深红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10±2nm。

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的10柠檬酸根修饰的金纳米粒子取100mL于离心管中，13000r/min浓缩10倍至终浓度为 50nM，加入10μL 20mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；用13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）修饰好的金纳米粒子各取50μL于四个PCR管中，向四个PCR管中依序各自加入1μL 10μM的Y1，Y2，Y3及Y4混匀后，向各体系中加入5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；合成好的Au-DNA复合物用13000r/min 离心10分钟，去除上清液，沉淀加1×tris-硼酸缓冲液至原体积；

合成好的四种Au-DNA复合物为：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4；

Y1：5’- SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA的复合物（Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4）各取50μL混合于1.5mL离心管中，加入5μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成对称的金纳米粒子四面体，该结构没有手性信号。

（5）手性四面体的构建

步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段含13个碱基的DNA环；在步骤（4）组装的过程中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大。原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号，

该结构在圆二色谱520nm处表现出明显的特征峰。

（6）目标DNA手性传感器的建立

基于步骤（5）的方法建立目标DNA手性传感器，具体操作为：在步骤（4）的制备过程中加入不同浓度的目标DNA（Y5），根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线。本实验中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM（即50-50000阿摩尔）。

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

本发明的有益效果：本发明提供了一种新型的手性材料的制备方法，该方法是在原非手性组装材料的基础上，通过外加DNA的引入对其几何构象进行重构，从而将非手性纳米材料转变为手性纳米材料；利用圆二色谱可见光区（520nm）的信号变化，实现在阿摩尔（10^-18）水平对目标DNA进行快速、高效、超灵敏地检测。

附图说明

图1：金纳米粒子四面体的透射电镜图；

图2：目标DNA诱导的构象改变后的四面体的透射电镜图；

图3：金纳米粒子四面体中加入不同浓度目标DNA后的圆二色变化曲线图；沿着箭头的方向，DNA浓度依次为0fM，0.05fM，0.5fM，1fM，5fM，10fM，50fM；

图4：目标DNA检测的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成金纳米粒子的方法为：分别取两个洁净的三角瓶，A瓶中加入158mL超纯水和2mL 质量浓度1%氯金酸；B瓶中加入8mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.2mL质量浓度1%单宁酸，0.2mL 25mM碳酸钾，31.6mL超纯水。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌40分钟到形成深红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10±2nm。

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的10nm柠檬酸根修饰的金纳米粒子取100mL于离心管中，13000r/min浓缩10倍至终浓度为 50nM，加入10μL 20mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；用13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）修饰好的金纳米粒子各取50μL于四个PCR管中，向四个PCR管中依序各自加入1μL 10μM的Y1，Y2，Y3及Y4混匀后，向各体系中加入5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；合成好的Au-DNA复合物用13000r/min 离心10分钟，去除上清液，沉淀加1×tris-硼酸缓冲液至原体积；

Y1：5’- SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’。

（4）金纳米粒子四面体的组装

步骤（3）制备的四种Au-DNA的复合物（Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4）各取50μL混合于1.5mL离心管中，加入5μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成对称的金纳米粒子四面体，该结构没有手性信号。

（5）手性四面体的构建

在步骤（4）的制备过程中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大。原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，该结构在圆二色谱520nm处表现出明显的特征峰。

（6）目标DNA手性传感器的建立

基于步骤（5）的方法建立目标DNA手性传感器，具体操作为：在步骤（4）的制备过程中加入不同浓度的目标DNA（Y5），根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线。本实验中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM。

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

组装四面体结构的表征：

将上述组装好的产品进行13000r/min离心10min，弃上清，沉淀重分散到120μL的超纯水中，超纯水洗一次。电镜表征：7μL的上述处理过的样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥。投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200 kV，如图1和2所示。圆二色谱表征：取组装好的体系100μL于比色皿中，用超纯水做空白对照。圆二色谱仪采用法国Bio-Logic MOS-450+SMF-300，如图3所示。

Y1：5’-SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

 

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

 

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

 

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

 

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

Claims (2)

1.一种手性纳米传感器的构建方法，其特征在于包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立；工艺步骤为：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子；

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA共有四种：Y1, Y2，Y3, Y4，形成四种不同的Au-DNA复合物：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4；

Y1：5’-SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA复合物，等比例混合组装形成金纳米粒子四面体；

（5）手性四面体的构建

步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段含13个碱基的DNA环；在步骤（4）组装的四面体中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环被完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大，原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号；

在此步骤手性四面体的构建过程中加入不同浓度的目标DNA：Y5；

（6）目标DNA手性传感器的建立

构建基于手性检测的DNA传感器：根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线；本发明中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM；

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

2.根据权利要求1所述的手性纳米传感器的构建方法，其特征在于：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子的方法为：分别取两个洁净的三角瓶，A瓶中加入158mL超纯水和2mL 质量浓度1%氯金酸；B瓶中加入8mL质量浓度1%柠檬酸三钠，0.2mL质量浓度1%单宁酸，0.2mL 25mM碳酸钾，31.6mL超纯水；A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌40分钟到形成深红色溶液；最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10±2nm；

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的10nm柠檬酸根修饰的金纳米粒子取100mL于离心管中，13000r/min浓缩10倍至终浓度为 50nM，加入10μL 20mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10小时；用13000r/min，离心10分钟后去除上清液，加水恢复到原体积；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）修饰好的金纳米粒子各取50μL于四个PCR管中，向四个PCR管中依序各自加入1μL 10μM的Y1，Y2，Y3及Y4混匀后，向各体系中加入5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2小时；合成好的Au-DNA复合物用13000r/min 离心10分钟，去除上清液，沉淀加1×tris-硼酸缓冲液至原体积；

合成好的四种Au-DNA复合物为：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4；

Y1：5’- SH-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’；

Y2：5’- SH-TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’；

Y3：5’- SH-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’；

Y4：5’- SH-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA的复合物：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4各取50μL混合于1.5mL离心管中，加入5μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成对称的金纳米粒子四面体，该结构没有手性信号；

（5）手性四面体的构建

步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段含13个碱基的DNA环；在步骤（4）组装的四面体中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大；

原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号，该结构在圆二色谱520nm处表现出明显的特征峰；

在此步骤手性四面体的构建过程中加入不同浓度的目标DNA：Y5；

（6）目标DNA手性传感器的建立

构建基于手性检测的DNA传感器：根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线；本发明中，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM；

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。