CN103102416A - 重组il3与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗癌药物力达霉素的强化融合蛋白:I131L、F132L突变后的mIL3-LDM,其编码基因;还涉及所述强化融合蛋白的基因工程构建方法和所述强化融合蛋白的用途。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学、蛋白组学及生物药学领域,提供了可以产生靶向肿瘤杀伤作用的融合蛋白、制备方法以及在肿瘤的靶向治疗药物中应用。
背景技术
白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病,它的死亡率在导致儿童及35岁以下成年人死亡的恶性肿瘤中排首位。常规放疗化疗可以去除肿瘤组织中大多数增殖细胞及遗传不稳定性细胞,但不能去除肿瘤干细胞,从而造成了肿瘤复发和转移,同时缺乏针对性的常规放化疗也可能损害体内某些类型的正常细胞,出现较明显的毒副反应。肿瘤干细胞具有类似正常干细胞的自我保护特性,如有效的DNA修复、高表达多药耐药型膜转运蛋白以及处于相对静止状态及拥有特定的微环境,使其能够逃逸现有的肿瘤治疗手段,针对这些保护机制,并利用肿瘤干细胞与正常干细胞的之间的差异进行靶向治疗,才可能实现根治白血病的目的。
在肿瘤干细胞靶向治疗中,靶点的选择非常重要,已知CD123在急性髓系白血病干细胞、变异性B细胞慢性淋巴增殖性疾病特别是毛细胞白血病细胞、以及不成熟的急性T淋巴细胞白血病细胞表面均可见表达,尤其在急性髓系白血病干细胞表面呈高表达,而在正常造血干细胞表面几乎不表达此抗原,且CD123是IL-3受体的α链,依靠细胞因子与细胞因子受体的结合方式,亲和力较抗原抗体结合更高效,因此CD123可作为治疗AML的有效靶点。
虽然在靶向治疗中使用最多、最为成熟的是与肿瘤相关抗原相关的单克隆抗体,但免疫原性大,一次注射毒副反应大,患者耐受性差等缺点也限制了其进一步的应用。而细胞因子及其受体结合的靶向治疗导向特异性强、杀伤力高、稳定性好、毒副作用小、不易产生耐药,从理论上讲,既可靶向杀伤肿瘤细胞,还不会导致继发性肿瘤,是目前国内外学者的关注热点。IL-3融合蛋白在白血病治疗中的应用已经取得了一定进展,1991年美国Immunex公司研制的GM-CSF/IL-3融合蛋白命名为Pixykine、其后IL-3与TPO的融合蛋白、IL-3与白喉毒素的融合蛋白DT388IL3、IL-3与bax的融合蛋白相继问世,经过体内外试验,DT388IL3以其良好的临床疗效、较小的毒副作用脱颖而出,目前已进入临床II期实验阶段。但是DT388本身分子量较大难内化并具有一定免疫原性,体外实验纯化过程中也显示其稳定性稍差,在实际应用方面还存在很多不足。因此研制以CD123为靶点的高效、小型化且性能稳定的靶向药物成为针对肿瘤干细胞特异性靶向治疗的新焦点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的、由IL3与力达霉素构建的融合蛋白及其制备方法,以及该融合蛋白用于制备治疗白血病的药物组合物的用途。
在本发明中所提及的术语均按下述定义来理解。
“LDP”等同于力达霉素的辅基蛋白,“LDM”等同于“LDP-AE”即“辅基蛋白上结合有发色团AE”。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合,两者结合具有特异性和牢固性,LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重新组装。
在本文中提到的“AE”是指具有下式I所示化学结构的发色团,
LDM发色团的化学名:
(2R,7S,9R,10R)-7-氨基-7,8-(2*-氯-6*-羟基-1*,4*-亚苯基)-10-(4’-去氧-4’-二甲氨基-5’,5’-二甲基-吡喃核糖基)-4,8-氧杂-5-氧代-1,11,13-三烯-15,18-二炔-三环[7,7,3,010,14]-2-十九碳醇-2”,3”-二氢-7”-甲氧基-2”-亚甲基-3”-氧代-1”,4”-苯并恶嗪-5”-羧酸酯。分子式:C43H42O13N3Cl
(I)
其由野生型力达霉素生产菌产生,天然地结合于力达霉素的辅基蛋白上,而且可以通过在低温条件下用冷甲醇等有机溶剂处理力达霉素的方式得到游离状态的发色团AE,该游离的发色团AE可以与去除了AE的力达霉素辅基蛋白LDP或者基因工程产生的LDP(其上可以融合有其它蛋白片段或者不融合有其它蛋白片断)在低温条件下组装成与天然力达霉素形式相同的活性形式,这种重新组装被称为“强化”。
在本文中提到的“IL3-LDM”等同于“IL3全部CDS区编码蛋白1-133位氨基酸与LDM的融合蛋白”,“mIL3-LDM”等同于“I131L、F132L突变后的IL3全部CDS区编码蛋白与LDM的融合蛋白”。
本发明所公开的具体内容是:
1.融合蛋白,其选自下述序列之一:
(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的生物学功能、仅在第131位I-L、132位F-L突变的氨基酸序列构成的蛋白。
2.项目1的融合蛋白,其还功能性地结合有式(I)所示结构的发色团AE:
3.核酸分子,其编码项目1的融合蛋白的基因,其选自下述序列之一:
(a)SEQ ID NO:3所示的编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列;
(b)SEQ ID NO:4所示的编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列;
4.载体,其可操作地连接有项目3所述的核酸分子。
5.项目4的载体,所述载体是质粒。
6.宿主菌,其包含项目4所述的载体。
7.制备项目2的融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)将IL3和mIL3编码基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到本室改造后的质粒pET28a中,得到重组表达质粒pET28a IL3-LDP和mIL3-LDP;
(b)在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白IL3-LDP和mIL3-LDP,
(c)纯化步骤(b)中获得的融合蛋白,
(d)使步骤(c)中获得的融合蛋白与式(I)的发色团组装,
(e)任选地,其还包括测定步骤(d)中组装后的融合蛋白的生物学活性的步骤。
8.药物组合物,其中含有药学有效量的项目1或者2所述的融合蛋白,任选地,还含有药学上允许的佐剂。
9.项目1或者2的融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗药物中的用途。
10.项目9的用途,所述药物用于靶向杀伤急性髓系白血病细胞。
11.项目9的用途,其中的急性髓系白血病是人急性髓系白血病。
12.项目9的用途,其包括向有此需要的受试者给予有效量的项目1或者2的融合蛋白。
13.项目9的用途,其中所述疾病是CD123阳性的人急性髓系白血病。
本发明采用IL3(与载体表面受体亚基CD123特异性结合)与强效抗肿瘤药物(弹头)相结合的策略。
在进行IL3克隆时,本发明选择了IL3的CDS区全长作为靶向肿瘤干细胞表面抗原的配体片段,保留了IL3的全部结合活性区。已有关于IL3活性的研究文献报道,Asp21,Gly42,Glu43,Asn45,Asp46,Met49,Arg94,Pro96,Phe113 and Lys116是IL3与IL3受体α亚基结合的关键部位,且125-133位氨基酸对于结合有静电阻碍作用,在关于DT388IL3融合蛋白的相关文献报道中,K116W突变和Δ125-133删除改造对提高IL3与配体结合力有显著效果,但对提高稳定性无明显作用。本实验根据以上结论做进一步蛋白质谱鉴定,发现在IL3的125-133序列中,131与132位氨基酸对于维持IL3融合蛋白的稳定性起到更为关键的作用,因此采用随机突变改造IL3基因的131与132位氨基酸,而保留其他氨基酸,最大限度的维持了IL3的天然活性,之后再与弹头药物进行偶联,这种结合活性和稳定性均较好的小分子药物克服了以往靶点药物的缺陷,具有诱人的前景。
在进行“弹头”选择时,本发明选择了高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM),亦称C-1027 或C1027,是从中国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus,由中国医学科学院医药生物技术研究所提供,菌种保藏编号:CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素,是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM由两部分分子组成:一为烯二炔结构的发色团(active enediyne,AE),具有细胞毒作用,但不稳定;另一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP),对发色团的稳定起保护作用。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合,两者结合具有特异性和牢固性,LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重建。LDM以其独特的分子结构和优秀的杀伤活性成为“弹头”药物的首选。
本发明通过基因工程方法,以IL2体外刺激后的人外周血单个核细胞的cDNA为模板,扩增得到IL3的CDS区片段全长,之后通过质谱鉴定并随机突变131与132位氨基酸得到相对稳定的mIL3基因片段。从质粒pET30sngrldp(由中国医学科学院医药生物技术研究所提供,保藏号CGMCCNo.2010)中扩增得到LDP基因,然后通过SOE-PCR得到mIL3-LDP融合基因,将该片段组装到质粒pET28a中(该质粒经本室改造后可进行信号肽引导的细菌周质腔内可溶性表达)得到含有mIL3-LDP的质粒pET28a-mIL3LDP,将该质粒转导到表达宿主菌株BL21中,通过改变培养温度、培养基成分和培养时间优化培养条件,获得了可溶性表达的mIL3-LDP融合蛋白,将该融合蛋白与AE分子重新组装,得到强化融合蛋白mIL3-LDM。在体外试验中,本发明的融合蛋白mIL3-LDM保留了与肿瘤干细胞表面CD123特异性结合的靶向性和LDM的强大杀伤活性,较同剂量的LDM,本发明的mIL3-LDM表现出更高的肿瘤干细胞靶向抑制效果,对正常肿瘤及肿瘤干细胞的影响较小,减少了一般化疗药物的体内外毒副作用。由此提供了新型的、由mIL3和力达霉素融合而成的可用于肿瘤治疗的候选靶向肿瘤干细胞的治疗药物。
本发明的优点与积极效果在于:应用基因重组和分子重建相结合的方法,制备了IL3与抗肿瘤抗生素力达霉素的强化融合蛋白IL3-LDM,并在此基础上进行蛋白结构改造,使mIL3-LDM融合分子性质更为稳定,不易发生降解,充分保留了靶向和毒性的双功能。mIL3-LDM对CD123抗原的结合性,使其具有强烈的肿瘤干细胞特异杀伤活性,在体外实验中无论细胞系还是病人标本均显示了良好的抗肿瘤疗效,并且克服了一般药物对正常干细胞的杀伤副作用,基本不影响正常干细胞的各项功能。在肿瘤干细胞靶向免疫治疗方面达到一个新水平,具有良好的应用前景
附图说明
图1为重组表达质粒1A为LDP克隆电泳图,为了保证内切酶的单酶切作用,将LDP内部的酶切位点利用氨基酸简并性做定点突变,分前后两部分克隆LDP,1、2分别为组成LDP的前后两片段。1B为合成好的LDP全长。1C为表达质粒构建电泳图,1为IL3全长,2为LDP全长,3为IL3-LDP表达基因融合后全长。1D为随机改造后鉴定活性最佳的融合蛋白电泳图,1为mIL3全长,2为mIL3-LDP全长。
图2A为融合蛋白IL3-LDP未改造前表达产物的SDS-PAGE分析结果,其中,
1为重组菌株pET 28a IL3-LDP周质腔蛋白裂解液;
2为重组菌株pET 28a IL3-LDP周质腔蛋白透析液;
3为重组菌株pET 28a IL3-LDP周质腔蛋白纯化后;
4为重组菌株pET 28a IL3-LDP周质腔蛋白流出液;
图2B为融合蛋白pET 28a IL3-LDP表达产物的Western印迹分析结果;
图3A为融合蛋白mIL3-LDP随机改造IL3第131、132为氨基酸后取最佳改造结构I131L、F132L后的表达产物SDS-PAGE分析结果,其中,
1为重组菌株pET 28a mIL3-LDP周质腔蛋白裂解液;
2为重组菌株pET 28a mIL3-LDP周质腔蛋白纯化后;
3为重组菌株pET 28a mIL3-LDP周质腔蛋白流出液;
4为重组菌株pET 28a空菌的阴性对照裂解液;
图3B为融合蛋白pET 28a mIL3-LDP表达产物的Western印迹分析结果。
图4表示同等剂量(1umol/l)的强化融合蛋白IL3-LDM和mIL3-LDM与CD123+细胞系TF-1的结合作用的流式分析比较。其中,a为空白对照,b为IL3-LDP的结合流式分析图,c为mIL3-LDP的结合流式分析图;
图5表示强化融合蛋白IL3-LDP和mIL3-LDP与CD123+细胞系TF-1结合作用的荧光显微镜比较。其中,A为阴性对照,B为单加二抗对照,C为mIL3-LDP融合蛋白实验组。每组中a为光镜下,b为DAPI染核效果图,c为FITC标记的融合蛋白结合细胞表面效果图;
图6A、B分别表示强化融合蛋白mIL3-LDM与LDM对TF-1、MO7e、K562、HL60不同细胞系的IC50的比较。其中,
▲代表MO7e
■代表TF1
□代表HL60
●代表K562
图6C表示强化融合蛋白mIL3-LDM、LDM及常用化疗药ADR对TF-1细胞系IC50的比较,其中,
■代表mIL3-LDM
▲代表LDM
●代表ADR;
图7表示融合蛋白mIL3-LDM与LDM对干细胞杀伤作用的比较,分别展示了不同放大倍数(4X、10X、40X)的效果图。其中,图7a表示两种药物对正常脐带血干细胞克隆形成能力的作用,图7b表示两种药物对AML病人标本细胞中干细胞克隆形成能力的作用,图7c表示两种药物对AML病人标本细胞中干细胞克隆形成能力作用的统计;
图8表示融合蛋白mIL3-LDM与LDM对细胞杀伤作用的凋亡机制研究,图8a表示TF-1 细胞系未经处理,图8b表示LDM处理72h后,图8c表示mIL3-LDM处理72h后。结果显示二者作用机理基本一致,表示融合蛋白确实发挥了靶向杀伤效果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行阐述,所述的实施方式仅仅用来解释和说明本发明,其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
实施例1 重组表达质粒pET28a IL3-LDP与pET28a mIL3-LDP的构建
PCR扩增IL3:
采正常人外周静脉血约10ml,抗凝处理后加入淋巴细胞分离液,吸取白膜层相,经1×PBS洗涤两遍后,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,并加入IL-2和CD3/p-gp双功能抗体刺激细胞增殖。提取正常人外周血白膜细胞的总RNA,经反转录PCR(RT-PCR)得到对应的cDNA作为模版,获得与Genbank中检索到的人IL-3核心编码区的cDNA序列完全一致的IL3基因序列全长。PCR引物由上海英骏公司合成,分别引入相应酶切位点。
具体地,以人外周血淋巴细胞的cDNA做为模板,用P1作为5’端引物,P2作为3’端引物,进行PCR扩增,反应条件为:94℃预变性5分钟,然后94℃变性1分钟,56℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行30个循环。最后一个循环后,72℃延伸10分钟。得到以Mlu I酶切位点开头的IL3基因片段A(约432bp)。将片段A进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
IL3上游引物P1:
5’-GCGC ACGCGT ACGCTGCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG
Mlu I酶切位点
IL3下游引物P2:
5’-CGCTGATCCGCCTCCACCAAAGAT
CGCGAGGCTCAAAGT
PCR扩增LDP:
用含有LDP基因的重组质粒pET30sngrldp(由中国医学科学院医药生物技术研究所提供,保藏号CGMCC No.2010)为模板,因为其中第128-133bp和第222-227bp的碱基序列与MLU I酶切位点序列相同,且这个酶切位点在目的载体的多克隆位点中存在,为避免以后试验中发生错误酶切,利用氨基酸的简并性突变相应密码子的第三位碱基并保持原氨基酸不改变。用P3作为5’端引物,用P4作为3’端引物,进行PCR扩增,反应条件:94℃预变性5分钟,然后94℃变性1分钟,56℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行30个循环。最后一个循环后,72℃延伸10分钟。得到LDP的基因片段B1(约156bp)。用P5作为5’端引物,用 P6作为3’端引物,进行PCR扩增,反应条件:94℃预变性5分钟,然后94℃变性1分钟,53℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行30个循环。最后一个循环后,72℃延伸10分钟。得到LDP的基因片段B2(约186bp)。将片段B1、B2进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
SOE-PCR扩增LDP突变后全长,利用纯化后的片段B1、B2,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,42℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共10个循环,然后72℃再延伸10分钟,生成少量突变后LDP模板。完成上步反应后,补加P7和P8引物,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,60℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共30个循环,72℃再延伸10分钟。得到突变后LDP基因片段C(片段B1+B2,约360bp)。将片段C进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
LDP片段B1上游引物P3:
5’-GCG CCC GCC TTC TCC GTC AGT CCC
LDP片段B1下游引物P4:
5’-GGA CGT CGC GGT CGC CGG GTT GCA AGC GTC CTG
LDP片段B2上游引物P5:
5’-ACC GCG ACG TCC TTC ACC ACG GAT GCG TCC GGA
LDP片段B2下游引物P6:
5’-GCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG GCC
LDP全片段C上游引物P7:
5’-TTTGGTGGAGGCGGATCAGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTLDP全片段C下游引物P8:
5’-GCGCGCATGCTCA ATGATGGTGATGGTGATG
Sph I酶切位点
TGATCCGCCTCCACCGCCGAAGGTCAGAGCCAC
SOE-PCR扩增IL3-LDP:
利用纯化的片段A(IL3)和片段C(LDP)产物,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,64℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共10个循环,然后72℃再延伸10分钟,生成少量IL3-G4S-LDP模板。完成上步反应后,补加P1和P8引物,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,54℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共30个循环,72℃再延伸10分钟。得到IL3-LDP基因片段D(片段A+C,约806bp),将反应产物D(SEQ ID No:1)进行1%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将回收得到的IL3-LDP片段和pET28a载体分别经Mlu I、sphI酶切后,将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1∶3的比例用Takara公司的T4连接酶16℃连接16个小时后,转化感受态大肠杆菌BL21,筛选出重组克隆质粒,并进行菌液PCR及酶切鉴定后,测序,结果表明,融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序 结果与预期完全一致,融合蛋白的基因编码序列为771bp,序列正确,命名为p ET28a IL3-LDP,菌体PCR产物的电泳图参见图1A。
按照随机改造后最佳效果定点突变IL3的131-132位氨基酸,获得mIL3-LDM
利用质粒p ET28a IL3-LDP为模板,以P9和P10为引物,扩增随机改造后的mIL3,反应条件:94℃预变性5分钟,然后94℃变性1分钟,66℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,进行30个循环。最后一个循环后,72℃延伸10分钟。得到mIL3-LDM的基因片段mA(约432bp)。将片段mA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。
mIL3上游引物P9:
5’-GCGC AC GCGT AC GCT GCT CCC ATG ACC CAG ACA ACG
mIL3上游引物P10:
5’-GCGGGCGCTGATCCGCCTCCACCAAA NNNNNN GAGGCTC
利用纯化的片段mA(mIL3)和片段C(LDP)产物,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,66℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共10个循环,然后72℃再延伸10分钟,生成少量mIL3-G4S-LDP模板。完成上步反应后,补加P1和P8引物,进行扩增,反应条件:94℃变性1分钟,54℃退火1分钟,72℃延伸2分钟,共30个循环,72℃再延伸10分钟。得到IL3-LDP基因片段mD(片段mA+C,约806bp),将反应产物D(SEQ ID No:2)进行1%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将回收得到的mIL3-LDP片段和pET28a载体分别经Mlu I、sphI酶切后,将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1∶3的比例用Takara公司的T4连接酶16℃连接16个小时后,转化感受态大肠杆菌BL21,筛选出重组克隆质粒,并进行菌液PCR及酶切鉴定后,测序,结果表明,融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序结果与预期完全一致,融合蛋白的基因编码序列为771bp,序列正确,命名为pET28a mIL3-LDP,菌体PCR产物的电泳图参见图1B。
其中IL3-LDP融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3所示,其中,1-69位为信号肽;70-438位为IL3的CDS区;439-453位为G4S;454-783位为力达霉素辅基蛋白。784-798位为G4S;799-816位为HIS6标签;817-819位为终止密码子。其中G4S为由4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的连接肽。
mIL3-LDP融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:4所示,其中:1-69位为信号肽;70-438位为IL3的CDS区,其中433-438位为随机突变改造的氨基酸序列;439-453位为G4S;454-783位为力达霉素辅基蛋白。784-798位为G4S;799-816位为HIS6标签;817-819位为终止密码子。其中G4S为由4个甘氨酸和1个丝氨酸组成的连接肽。
实施例2 IL3-LDP与mIL3-LDP的表达与验证
2.1 IL3-LDP与mIL3-LDP的表达
将实施例1中获得的含有质粒p ET28a IL3-LDP与p ET28a mIL3-LDP的大肠杆菌BL21 的单菌落接种于5ml含卡娜青霉素(Kan)50μg/ml的2×YT培养基中,在恒温摇瓶箱中37℃,200rpm,振荡培养过夜;移入500ml含Kan 100μg/ml的2×YT培养基(1L的2×YT培养基含1.6%胰化蛋白胨、1.0%酵母抽提物、0.5%氯化钠,PH 7.4)中,37℃,200rpm,振荡培养8h后,在低温高速真空离心机上6000rpm、4℃离心10分钟收集菌体,将菌体重新悬浮于1000ml含Kan 100μg/ml及1mM IPTG的2×YT培养基,30℃,200rpm,振荡培养4h;8,000rpm、4℃离心10分钟收集菌体,冷冻于-20℃冰箱备用。
将冻存的菌体化冻,加入50ml细菌周质腔蛋白提取液(三羟甲基氨基甲烷25mmol/L,乙二胺四乙酸1mmol/L,苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L,蔗糖20%(w/w,NaCl 200mmol/L,pH 7.5),振荡混匀,置于4℃轻摇1h。12000rpm,4℃离心20分钟,取上清。将提取物用PBS透析12h后,在快速蛋白层析仪(FPLC)上进行纯化,用结合缓冲液(25mM Tris,100mMNaCl,10mM咪唑)平衡亲和层析柱,上样,再用结合缓冲液冲洗基线,至基线稳定后,用洗脱缓冲液(25mM Tris,100mM NaCl,0.5M咪唑)洗脱,洗脱液用PBS置换。然后用12% SDS-PAGE分析外源蛋白表达情况,结果表明,经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白,且pIL3-LDP与mIL3-LDP的表达产物主要存在于细菌可溶性周质腔中(图2、3)。
2.2用Western印迹法确认IL3-LDP与mIL3-LDP
将2.1获得的蛋白进行电泳,电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转,条件为:恒电流0.7mA/cm2,时间为5小时。电转结束后的硝酸纤维素膜(NC膜)与用封闭液1000倍稀释的一抗即抗HIS单抗孵育,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗,进行显色分析,结果表明,重组菌株表达的确为C-末端带有LDP的重组融合蛋白IL3-LDP(图2)与mIL3-LDP(图3)。将该含表达融合蛋白IL3-LDP与mIL3-LDP的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为p ET28a IL3-LDP与p ET28a mIL3-LDP。
实施例3 IL3-LDP与mIL3-LDP的免疫学活性
通过流式细胞仪测定IL3-LDP与mIL3-LDP的体外免疫荧光结合活性。将1×106个/mlTF-1细胞重悬于含有不同浓度的FITC标记的抗CD123-perCP5.5抗体或实施例2获得的IL3-LDP与mIL3-LDP的100μL PBS溶液中,4℃放置1h,2000g,离心10分钟,弃上清液,PBS洗3次,FACS测定抗CD123结合TF-1细胞的阳性率。证明相同浓度的抗CD123抗体及IL3-LDP与mIL3-LDP与TF-1细胞的结合活性基本相同,IL3-LDP与mIL3-LDP融合蛋白保留了与靶抗原特异性结合的能力(图4)。
将流式细胞仪测定样本准备好后,2000g,离心10分钟,弃上清液;加入4%多聚甲醛溶液固定10分钟,2000g,离心10分钟,弃上清液;加入20ulDAPI(浓度为100ng/ml)核染料,室温孵育10分钟,2000g,离心10分钟,弃上清液;用PBS重悬至细胞浓度为1×107个/ml TF-1细胞,取30ul滴于玻片上,加盖玻片后,用40%甘油封片,荧光显微镜下观察,mIL3-LDP融合蛋白保留了与靶细胞膜表面抗原特异性结合的能力(图5)。
实施例4 力达霉素的制备及其活性型发色团AE的相对含量测定
4.1力达霉素(LDM)的制备
将力达霉素产生菌(由中国医学科学院医药生物技术研究所提供,CGMCC NO.0135)冷干管中加0.7ml无盐水,使之形成菌悬液,用白金耳接种于高氏1号斜面培养基培养,28℃,7-10天,表面生长白色气生菌丝,取一小块接种于一级种子100ml/500ml三角瓶培养(发酵培养基成分为:淀粉1%,玉米浆0.5%,血胨0.5%,葡萄糖0.5%,MgSO4 0.02%,KI 0.06%,玉米面1.5%,CaCO3 0.4%,自来水配制,pH 7.0,15磅消毒),28℃,旋转摇床培养48h,在转种5%于1000ml/5000ml立瓶中作为二级种子,以相同发酵培养基培养,28℃,往返摇床培养18h,上200L发酵罐,装量为100L,接种量2%,加0.03%泡敌为消沫剂,罐压0.04,28℃,搅拌400转/分,气流1/1,pH 6.5-7.0,发酵96h,得到所需发酵液。取发酵液10L,离心取上清,以HCl调至pH 4.0,加(NH4)2SO4 4.5Kg于8℃搅拌3h,析出的力达霉素离心分离(4℃,8000转/分,15min),所得的沉淀物加200ml冷水溶解,透析,再离心除去不溶物,上清液经羟基磷灰石柱吸附,0.001M磷酸缓冲液(pH 6.8)洗脱,活性部分冷冻干燥,得粗制品1500mg。粗制品溶于水,经Sephadex G-75柱层析,活性部分冷冻干燥后,得到145 mg抗肿瘤高活性的力达霉素白色粉末精制品。
4.2活性型发色团AE的相对含量测定
与LDM蛋白部分相比,发色团分子量较小,其理论含量仅占力达霉素的7.4%。由于AE是LDM发挥作用的活性部分,辅基蛋白仅有保护AE的功能,因此一般通过测定AE在发色团总量中的相对含量,即可以确定LDM制品的活性高低。
采用HPLC对LDM进行分析可以测得AE占发色团总量的百分比值,具体方法为:
将如上述制备的LDM制品溶于HPLC流动相(乙腈∶水为23∶77),在FPLC快速蛋白色谱仪上经Waters径向加压C4半制备柱分离,洗脱液为乙腈∶水(23∶77),自动收集器收集,用HPLC C4分析柱检测收集到的各组分。
分析结果显示,本发明人制备的LDM,其AE组分占LDM发色团总量的90.63%。通过分析确定该LDM制品符合LDM的质量控制标准,为AE高含量的LDM精制品,将该LDM制品冻干,置于-80℃冰箱保存,以便用于强化融合蛋白mIL3-LDM的制备。
4.3强化融合蛋白mIL3-LDM的制备。
取高活性LDM冻干品10mg,加5ml冷甲醇振摇5分钟,-20℃放置1小时,中间振摇1次;在0℃,12000转/分钟离心20分钟,上清液含发色团AE,沉降物为肽链,重复提取2次。将含有发色团AE的甲醇液蒸发浓缩,-70℃储存。发色团AE不稳定,实验需低温(4℃)、避光进行。
然后取实施例2获得的mIL3-LDP融合蛋白分别溶于PBS中,加入5倍摩尔分子量的发色团-甲醇溶液(体积比为50∶1),混合振摇,室温放置12小时。最后将混合液进行PD-10柱层析,经A280nm和A343nm紫外监测后收集强化融合蛋白mIL3-LDM。以下实施例所涉及的 mIL3-LDM均按照本方法制备。
实施例5 mIL3-LDM对肿瘤细胞的特异性的细胞毒作用
5.1 mIL3-LDM对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞毒作用
接种细胞悬液于96孔板中(100μl/孔,每孔细胞数量>1000)。设立空白孔、PBS孔及加药孔,加药孔分别加入梯度稀释后的不同浓度的LDM和mIL3-LDM,将培养板在培养箱培养(在37℃,5% CO2)0.5-2小时后取出,用PBS洗2遍,加入含有GM-CSF生长因子的1640培养基培养24、48和72小时。向每孔加入10μl CCK-8溶液,将培养板在培养箱内孵育2-4小时,用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。按下述公式计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC50)值:
细胞存活率=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。
结果发现强化融合蛋白mIL3-LDM对CD123阳性的TF-1、MO7e细胞的IC50值分别为1.25×10-9M和0.93×10-9M,对CD123表达弱阳性的HL60细胞的IC50值为5.47×10-7M,对无特异性CD123抗原表达的K562细胞的IC50值为2.21×10-6M,而力达霉素对TF-1、MO7e细胞的IC50值分别为3.23×10-7M和2.11×10-7M,对HL60细胞的IC50值为1.12×10-6M对K562细胞的IC50值为1.967×10-6M,表明mIL3-LDM较好的保留了力达霉素的细胞毒作用,并对CD123阳性的肿瘤细胞有更为明显的选择性杀伤作用,具体结果参见图6。
5.2 mIL3-LDM对病人原代肿瘤干细胞的特异性细胞毒作用
取鉴定过CD123表达阳性的急性髓系白血病病人原代细胞,分离白膜细胞后,用无血清的1640培养基洗2遍,重悬为1×106个/ml的单细胞悬液。取200ul置于24孔板中央,加入2×10-9M的mIL3-LDM,3×10-7M的LDM,孵育2小时后,PBS洗2遍,轻轻吸取上清液弃掉,再缓慢加入stem cell公司的髓系细胞克隆形成培养基#4434 0.5ml,用尖头滴管反复吹打培养基,使细胞均匀分布在半固体培养基中,避免出现气泡,并在每个试验孔周围孔中加入2/3体积的生理盐水防止培养基干燥。将培养板在培养箱培养(在37℃,5%CO2)7-10天后,随时观察克隆形成率和克隆形成绝对数量。
对照组取正常人脐带血,分离白膜细胞后进行同样操作。(图7)
结果发现mIL3-LDM较好的保留了力达霉素的细胞毒作用,且主要针对病人原代肿瘤干细胞选择性杀伤,与此同时,mIL3-LDM对正常人脐带血干细胞的杀伤作用较弱,保留了大多数正常干细胞的生理特性。
表1:融合蛋白mIL3-LDM体外对AML病人原代肿瘤干细胞的生长抑制作用
缩写注释:AML代表急性髓系白血病。
实施例6 mIL3-LDM杀伤作用的机制研究
接种细胞悬液于96孔板中(100μl/孔,每孔细胞数量>1000)。分别加入IC20和IC50浓度的LDM和mIL3-LDM,将培养板在培养箱培养(在37℃,5%CO2)2小时后取出,用PBS洗2遍,加入含有GM-CSF生长因子的1640培养基培养72小时。收集悬浮细胞TF-1,2000rpm离心5min,用PBS洗涤细胞二次,2000rpm离心5min,加入500L的Binding Buffer;实验组加入5uL Annexin V-FITC和5uL Propidium Iodide双染,混匀;对照组分别设未给药的空白组、5uL Annexin V-FITC和5uL Propidium Iodide单染组及双染组,室温、避光反应5~15min;1小时内,进行流式细胞仪检测(图8)。
结果发现,mIL3-LDM与LDM处理后72小时均可见细胞的早期、晚期凋亡过程,二者对细胞的毒性机理完全一致,说明IL3确实将LDM靶向CD123阳性细胞群,之后由小分子的LDM进行有效杀伤。
Claims (13)
1.融合蛋白,其选自下述序列之一:
(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的蛋白;
(b)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的生物学功能、仅在第131位I-L、132位F-L突变的氨基酸序列构成的蛋白。
2.权利要求1的融合蛋白,其还功能性地结合有式(I)所示结构的发色团AE。
3.核酸分子,其编码权利要求1的融合蛋白的基因,其选自下述序列之一:
(a)SEQ ID NO:3所示的编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列;
(b)SEQ ID NO:4所示的编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列(由于密码子简并性造成的同氨基酸序列也在保护范围内);
4.载体,其可操作地连接有权利要求3所述的核酸分子。
5.权利要求4的载体,所述载体是质粒。
6.宿主菌,其包含权利要求4所述的载体。
7.制备权利要求2的融合蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)将IL3和mIL3编码基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到本室改造后的质粒pET28a中,得到重组表达质粒pET28a IL3-LDP和mIL3-LDP;
(b)在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白IL3-LDP和mIL3-LDP;
(c)纯化步骤(b)中获得的融合蛋白;
(d)使步骤(c)中获得的融合蛋白与式(I)的发色团组装;
(e)任选地,其还包括测定步骤(d)中组装后的融合蛋白的生物学活性的步骤。
8.药物组合物,其中含有药学有效量的权利要求1或者2所述的融合蛋白,任选地,还含有药学上允许的佐剂。
9.权利要求1或者2的融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途。
10.权利要求9的用途,所述药物用于靶向杀伤急性髓系白血病细胞。
11.权利要求9的用途,其中的急性髓系白血病是人急性髓系白血病。
12.权利要求9的用途,其包括向有此需要的受试者给予有效量的项目1或者2的融合蛋白。
13.权利要求9的用途,其中所述疾病是CD123阳性的人急性髓系白血病。
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PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130515 |