CN103088094B

CN103088094B - 绛红褐链霉菌sp3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用

Info

Publication number: CN103088094B
Application number: CN201310033858.3A
Authority: CN
Inventors: 朱天辉; 张丽娜; 李姝江; 韩珊; 谯天敏
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN103088094A

Abstract

本发明公开了一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制备：A1去菌发酵滤液的制备：A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；A3纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液；在杂交竹栽培区，发病前喷雾或灌（根）10-50倍（体积比）上述抗菌蛋白，喷雾每株200毫升，防治效果为70-80%；灌根每株100毫升，防治效果为75-85%。

Description

绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用

技术领域

本发明涉及的是绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用。

背景技术

撑×绿杂交竹是南方重要的经济用材竹，也是四川等地引种发展的主要经济竹种之一。近年来，由丝孢纲真菌暗孢节菱孢菌[Arthriniumphaeospermum (Corda) M.B.Ellis]引起的杂交竹梢枯病导致撑×绿杂交竹大面积枯死，造成巨大的经济损失，极大地威胁着长江中上游地区退耕还林的进程和生态屏障的建设。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究较少。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。李姝江和谯天敏等从杂交竹健康植株分离到一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ZB27，用其菌悬液和代谢产物处理对杂交竹梢枯病有较好的防治效果，但铜绿假单胞菌为条件致病菌，作为生防菌剂在田间使用受到限制，而本发明涉及的绛红褐链霉菌SP3(本申请人已于2012年09月27日申请中国专利，申请号为201210367119.3，公开号CN102864110A，发明名称：绛红褐链霉菌SP3菌株及其在红豆杉土传根病和红豆杉促生上的应用)对杂交竹生防效果较好，但用其代谢产物—纯抗菌蛋白作为诱导因子，诱导植物抗性，提高杂交竹免疫性尚无人报道。

诱导抗性，即利用生物或非生物因子激发植物的防卫基因，使植物产生局部的或系统的抗病性而达到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意义。其中，关于化学诱导因子诱导抗性的研究国内外报道很多。另外，利用生物因子诱导植物产生抗性的研究也较多，这些生物因子包括致病菌、弱毒小种、AM真菌、植物根围促生细菌（PGPR）和放线菌等。随着研究的深入，发现一些来源于微生物的诱导因子和微生物一样可以诱导寄主植物产生防卫反应，尤其是诱导植保素的合成和积累。Thakkera等利用从Fusarium oxysporum f. sp cubense获得的激发子处理香蕉根部，可引起香蕉叶片防御性相关酶的积累，能有效提高感病品种的抗性；Jung等发现从芽孢杆菌菌株中纯化获得的细菌素（class Iid）可诱导大豆PAL、APX、SOD和PPO等活性的增加；Mao等从Alternaria tenuissima的菌丝中纯化得到耐热酸性蛋白激发子PeaT1，能够诱导烟草对TMV产生系统抗病性；李云锋等利用从稻瘟病菌细胞壁中纯化获得的糖蛋白激发子CSBⅠ（分子量为102 kDa）接种水稻，可引起叶片内POD、PAL、LOX活性、绿原酸和木质素含量的显著增加。蒋继志等从31种微生物中筛选出了两种放线菌源激发子，其中放线菌A 5295发酵液型激发子诱抗效果最高，达63. 97%，并推测发酵液中有效诱抗物质可能是蛋白质类、多糖类等物质。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用。

本发明涉及的绛红褐链霉菌SP3菌株，本申请人已于2012年09月27日申请中国专利，申请号为201210367119.3，公开号CN102864110A，发明名称：绛红褐链霉菌SP3菌株及其在红豆杉土传根病和红豆杉促生上的应用。

本发明的技术方案如下：

一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制备：

A1去菌发酵滤液的制备：

从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁸cfu/mL；然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基中，于25℃、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min，取上清液用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，备用；

A2采用硫酸铵沉淀法提取抗菌物质，制备活性粗蛋白；利用55%饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；

A3 纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液：

A31 DE52离子交换层析；

A32 Sephadex G-75凝胶过滤层析；

A33 Sephadex G-50凝胶过滤层析；

所述的绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用，在杂交竹栽培区，发病前喷雾或灌根10-50倍（体积比）所述绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，喷雾每株200毫升；灌根每株100毫升。

不论是喷雾或是浸根诱导，不同浓度抗菌蛋白处理的病情指数差异显著，除200倍稀释液处理与对照差异不显著外，其余均显著低于对照（P＜0.05），其中以10倍稀释液处理的病情指数最低，分别是23.95和20.89，20倍稀释液次之。喷雾和浸根两种诱导方法都以10倍抗菌蛋白稀释液的诱抗效果最好，分别为56.22%和62.88%；其次是50倍稀释液的处理，分别为45.39%和51.18%；再者，100倍稀释液的诱抗效均在20%以上；200倍稀释液诱导后挑战接种发病最为严重，诱抗效果仅为0.10%和-2.77%。表明随着抗菌蛋白处理浓度的升高，杂交竹的抗病能力也随之增强。

附图说明

图1为粗蛋白经DE52离子交换层析结果；

图2为峰5经Sephadex G-75凝胶过滤层析结果；

图3为峰5-4反向HPLC纯度检测结果；

图4为峰5-4经Sephadex G-50凝胶过滤层析结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1 绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白（几丁质结合抗菌蛋白母液）制备

1.去菌发酵滤液的制作

从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁸cfu/mL；然后以1%的接种量接入灭菌的发酵培养基（黄豆饼粉3g，葡萄糖 5g，甘油 5g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，CaCO₂ 2g，蒸馏水 1000mL）中，于25℃、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min，取上清液用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，备用。

2 抗菌物质提取方法筛选

（1）甲醇、乙醇和丙酮提取

取3份去菌发酵滤液，每份100mL，按照1:5（v/v）的比例分别加入冷甲醇、乙醇和丙酮(-20℃)，在-20℃放置10min，10 000r/min离心15min，使沉淀风干，上清液用旋转蒸发仪减压蒸干，沉淀物和蒸干物分别用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液溶解并调整至5mL，测定其抑菌活性（采用杯碟法测定待测物质的抑菌活性。在PDA平板中央接入直径6mm供试真菌菌丝块，用打孔器距中心3.0cm 处无菌挖取4个孔洞。每孔加入100μL待测物质，于 25℃培养3-5d测量抑菌带宽度，下文粗蛋白及抗菌蛋白活性测定均以杂交竹梢枯病菌为指示菌。以加灭菌后的Tris-HCl做对照，每处理均设 3个重复。

（2）硫酸铵沉淀法提取

取去菌发酵滤液100mL，在0℃下加入硫酸铵使溶液相对饱和度为100%，4℃下过夜，10 000r/min离心15min，沉淀物再用0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液溶解后，4℃下用8-14kDa的透析袋透析脱盐，聚乙二醇20 000包埋浓缩，调整至5mL。分别测定沉淀溶解液和上清液的抑菌活性（同上）。

1-2倍体积低温有机溶剂即可使多数蛋白质溶解度降低并析出，饱和度为100%的硫酸铵也可将发酵滤液中的蛋白质全部析出。绛红褐链霉菌发酵滤液经有机溶剂沉淀后的上清液仍有活性，可能是部分未沉淀的活性蛋白，也可能是其它小分子次生代谢物质，后者可通过萃取进行提取。

试验结果表明：100%硫酸铵饱和度沉淀的抗菌物质的抑菌活性最大，显著高于有机溶剂沉淀，上清液无抑菌活性；甲醇和乙醇对抗菌物质也有较好的沉淀效果，抑菌带宽度分别是10.8mm和11.0mm，丙酮沉淀效果最差。上清液蒸干物则以丙酮抑菌活性最大（表1）。以上分析说明发酵滤液中起主要抑菌作用的是蛋白质类物质，并且以硫酸铵盐析法的提取效果最佳。

表1 几种抗菌物质提取方法比较

3、活性粗蛋白的制备

采用硫酸铵沉淀法，取10份100mL的无菌发酵液，均以发酵原液为初始浓度，在0℃下加入硫酸铵分别至饱和度20%、30%、40%、50%、55%、60%、70%、80%、90%和100%，10 000r/min离心15min，收集每一饱和度所对应的沉淀物与上清液，沉淀物溶解在0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl缓冲液中，4℃下用8-14kDa的透析袋透析脱盐，聚乙二醇20 000包埋浓缩，每份浓缩样品均调整至5mL。测定各沉淀溶解液和上清液的抑菌活性，确定最适的硫酸铵盐析浓度；该菌株的发酵滤液经不同饱和度硫酸铵盐析后抑菌效果差异较大，硫酸铵饱和度＜55%时，沉淀物抑菌活性随饱和度升高而明显增大，而上清液抑菌活性则逐渐降低；当饱和度≥55%时，沉淀物抑菌活性无明显变化，100%饱和度的沉淀物抑菌活性仅比55%提高1.5%，而上清液均无抑菌活性。因饱和度越高硫酸铵沉淀物中杂蛋白含量也越高，从而增大了纯化的难度，故选择55%硫酸铵饱和度为盐析抗菌蛋白的最适浓度。利用最适硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为粗蛋白。

4、抗菌蛋白纯化方法

（1） DE52离子交换层析

DE52离子交换柱（20cm×1.5 cm）用1mol/L NaCl清洗后，以0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl平衡。取2mL粗蛋白上样后，先用0.05mol/LpH8.5 Tris-HCl淋洗60min，然后以0.05mol/L pH8.5 Tris-HCl和1mol/L的NaCl进行阶式梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各洗脱蛋白峰，蛋白峰液经0.05mol/L pH8.5的Tris-HCl透析、聚乙二醇20 000包埋浓缩，各浓缩蛋白峰液均调整至2mL，测定其抑菌活性；55%饱和度的硫酸铵盐析粗蛋白经DE52离子交换层析后，出现9个洗脱峰（图1），其中峰2、3、5洗脱蛋白质有抑菌活性，以峰5洗脱蛋白质活性最大。

（2）Sephadex G-75凝胶过滤层析

以0.05mol/L pH8.5的Tris-HCl平衡层析柱（50cm×1.5cm）。取2mL经DE52离子交换层析后的抗菌蛋白上样，用0.05mol/L pH8.5的Tris-HCl洗脱，流速为0.5mL/min。收集各洗脱蛋白峰。蛋白峰液经透析、浓缩后（方法同上），测定其抑菌活性。峰5洗脱蛋白质经SephadexG-75凝胶过滤层析，出现4个洗脱峰（图2），只有峰5-4洗脱蛋白质具有抑菌活性。具有抑菌活性的蛋白（峰5-4）样品采用SDS-PAGE电泳只有一条带，进一步反向HPLC检测其纯度（图3），2个洗脱峰，保留时间分别为17.02min和21.59min。

（3）Sephadex G-50凝胶过滤层析

上述峰5-4洗脱蛋白经Sephadex G-50凝胶过滤层析【同<SephadexG-75凝胶过滤层析>】得到2个洗脱峰（图4），其中峰5-4-1洗脱蛋白质具有抑菌活性，且反向HPLC检测为单峰，保留时间为21.59min，该洗脱液即为几丁质结合抗菌蛋白母液。

(4)贮存方法:4℃低温保藏2-3年仍具诱导作用。

5、 N末端部分氨基酸序列测定及其对蛋白质序列库的类似性检索

经纯化得到的抗菌蛋白样品冻干后由西农生（北京）生物技术有限公司采用蛋白测序仪PPSQ-31A (Shimadzu Corporation，日本)协助测定。以N末端25个氨基酸的序列片段为靶序列，采用BLASTP程序对蛋白质数据库的类似性检索，综合数据库NCBI、Uniprot和DDBJ，从中检出4个序列与抗菌蛋白AMP N端序列相似（几丁质结合蛋白），同源性均为81.00%。

实施例2 绛红褐链霉菌SP3纯抗菌蛋白诱导杂交竹抗病效果

1.抗菌蛋白的诱导处理

将规格一致的撑×绿杂交竹苗，苗高2m。用于喷雾处理的竹苗分株盆栽，用无菌水将实施例1制备的几丁质结合抗菌蛋白母液进行稀释，分别用10倍（体积比，下同）、50倍、100倍、200倍抗菌蛋白稀释液对杂交竹进行叶片喷雾诱导或浸根诱导。叶面喷雾方法：各诱导液均匀喷洒于叶片，以叶面刚好滴水为准，24h内喷施3次。浸根方法：根部浸泡于各诱导液中，24h后植入盆土中。以无菌水作对照。诱导处理后套袋保湿3d挑战接种杂交竹梢枯病菌（从PDA培养基上的菌落边缘切取菌龄为3天、直径为6mm的杂交竹梢枯病菌菌饼，叶片正面无菌针刺制造伤口，接种菌饼，菌面朝下，无菌湿润滤纸覆盖，套袋）。每处理重复3次。

2、效果统计：逐日统计发病情况，按下列方法计算接种后第7天的病情指数和诱抗效果。

病情指数和诱抗效果计算方法：分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积10%以下；3级：11%～25%；5级：26%～40%；7级：41%～65%；9级：65%以上。分别计算叶片和枝条上的病情指数和防治效果。

病情指数=[∑(病级叶数或枝数×代表数值)/(叶数或枝数总和×发病最重级的代表数值)]×100；

诱抗效果(%)=[(发病对照病情指数－诱导处理病情指数)/发病对照病情指数]×100

表1 不同诱导方法的诱导抗病性效果

注:表中数据后不同英文字母表示在P<0.05水平差异显著（LSD测验），*表示显著相关。

表1显示: 不论是喷雾或是浸根诱导，不同浓度抗菌蛋白处理的病情指数差异显著，除200倍稀释液处理与对照差异不显著外，其余均显著低于对照（P＜0.05），其中以10倍稀释液处理的病情指数最低，分别是23.95和20.89，20倍稀释液次之。喷雾和浸根两种诱导方法都以10倍抗菌蛋白稀释液的诱抗效果最好，分别为56.22%和62.88%；其次是50倍稀释液的处理，分别为45.39%和51.18%；再者，100倍稀释液的诱抗效均在20%以上；200倍稀释液诱导后挑战接种发病最为严重，诱抗效果仅为0.10%和-2.77%。表明随着抗菌蛋白处理浓度的升高，杂交竹的抗病能力也随之增强。

实施例3、田间防治实例

在杂交竹栽培区，发病前喷雾或灌（根）10-50倍（体积比）上述抗菌蛋白，喷雾每株200毫升，防治效果为70-80%；灌根每株100毫升，防治效果为75-85%。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液，所述的绛红褐链霉菌SP3保藏编号为CGMCC NO.6383，其特征在于，按照以下方法制备：

A1去菌发酵滤液的制备：

从新鲜培养的斜面菌种制备绛红褐链霉菌SP3孢子悬浮液，调整孢子浓度为10⁸cfu/mL；然后以1％的接种量接入灭菌的发酵培养基中，于25℃、140r/min振荡培养4d，发酵液于8000r/min离心15min，取上清液用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，备用；

A2利用55％饱和度的硫酸铵盐析浓度对发酵液进行粗提取，得到的即为活性粗蛋白；

A3纯化抗菌蛋白，得到几丁质结合抗菌蛋白母液：

A31DE52离子交换层析；

A32Sephadex G-75凝胶过滤层析；

A33Sephadex G-50凝胶过滤层析。

2.根据权利要求1所述的绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液在制备诱导杂交竹抗病药剂中的应用，其特征在于，在杂交竹栽培区，发病前按照体积比10-50倍所述绛红褐链霉菌SP3抗菌蛋白母液进行喷雾或灌根，喷雾每株200毫升；灌根每株100毫升。