CN103073640B - 抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，特点是采用甲鱼系统性败血症球状病毒为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到特异鸡卵黄抗体粗提物，纯化后得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体纯品，包括甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备步骤；蛋鸡免疫和收集免疫鸡蛋的步骤；最后分离和纯化得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的步骤，并应用于制备预防和治疗因甲鱼系统性败血症球状病毒引起的相关疾病的药物、保健品或饲料添加剂，优点是该卵黄抗体纯度较高，且对甲鱼系统性败血症球状病毒有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，便于低成本、大批量生产，其制备方法简便易行。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用。
背景技术
甲鱼系统性败血症球状病毒（Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV）是从发病甲鱼中分离的一种新型病毒。毒株为P1015株，保藏号为 CGMCC No.5378，于2011年10月21日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。该病毒无囊膜，直径23-40nm，细胞核内、外均可增殖。该病毒能导致甲鱼系统性出血、败血，来势猛，7-10天内累积死亡率可达90-100%。2005年来，浙江宁波等地区中华鳖生态养殖场发生的暴发性败血症多由该病毒所致，常规药物治疗无效，给养殖户造成巨大经济损失。目前，该病尚处于研究初始阶段，无有效治疗方法，部分养殖户滥用抗生素进行防治，非但没有疗效，反而破坏了生态环境，使其他病原生物产生耐药性，造成并发性疾病，给该病的防治增加了压力。鉴于此，寻找一种高效、绿色的甲鱼系统性败血症治疗方法势在必行。
卵黄抗体（IgY）是从经抗原免疫的禽类所产卵中分离的具有特异性的蛋白，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种易于生产的廉价抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的特异性IgY的量（约200mg）远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量。IgY具有较强的耐酸、耐碱、耐热能力。高效卵黄抗体可以通过注射、拌饵投喂、浸泡等方式对水产动物起到保护剂疾病治疗作用，还可用于免疫学检测等领域。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，如防治传染性法氏囊病、禽流感、新城疫等疾病。但在水产行业的研究开发还处于基础阶段，目前在水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒病、抗贝氏隐孢子虫病、抗副溶血弧菌病以及抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体，但是，目前还没有关于抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体及其制备方法和应用的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒（STSSSV）的卵黄抗体及其制备方法和应用，该卵黄抗体纯度高，且对甲鱼系统性败血症球状病毒有较强的抑制作用，其制备方法简便易行，可用于STSSSV引起的疾病的预防和治疗上及开发STSSSV检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体，采用甲鱼系统性败血症球状病毒为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到所述的抗甲鱼系统性败血症球状病毒的鸡卵黄抗体粗提物，纯化后得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体纯品。
一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
（1）抗原制备
选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃ ，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原；
（2）动物免疫
将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；
（3）特异卵黄抗体的分离和纯化
将步骤（2）得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的0.05 M的 pH 为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 ℃冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 ℃，10000g的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的（NH4）2SO4使其终浓度为40%，4 ℃静置10h，再10000g离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100 ml，再次于4℃静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用0.01M 的pH 为7.2 的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。
步骤（1）中所述的TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸（EDTA），1mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）。
步骤（1）中所述的TM缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2 ，1mM PMSF。
一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的应用，可应用于制备预防和治疗因甲鱼系统性败血症球状病毒引起的相关疾病的药物、保健品或饲料添加剂，并可用于开发甲鱼系统性败血症球状病毒检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，该方法制备得到的卵黄抗体纯度较高，且对甲鱼系统性败血症球状病毒有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，便于低成本、大批量生产，其制备方法简便易行，最终获得的高产、高效、高纯度的卵黄抗体可用于由甲鱼系统性败血症球状病毒引起的疾病的预防和治疗上及开发甲鱼系统性败血症球状病毒检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断，经间接ELISA检测本法制备的抗STSSSV卵黄抗体效价达10240，可用于STSSSV导致的疾病的防治。本发明首次提出了抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体及其制备方法和应用，填补了抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的相关研究的空白，并为以后的研究与应用奠定基础。
上述甲鱼系统性败血症球状病毒（Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV），毒株为P1015株，保藏号为 CGMCC No.5378，于2011年10月21日保藏在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
本发明一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体，采用甲鱼系统性败血症球状病毒为抗原免疫产蛋母鸡，从免疫鸡蛋卵黄中提取得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的鸡卵黄抗体粗提物，纯化后得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体纯品，具体过程如下：
1、甲鱼系统性败血症球状病毒抗原的制备
选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃ ，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，其中TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，5mM EDTA，1mM PMSF，TM缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2 ，1mM PMSF。
2、母鸡的免疫
将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1）得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存。
3、抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的分离和纯化
将步骤（2）得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的0.05 M的 pH 为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4 ℃冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4 ℃，10000g的条件下离心20 min后取上清液，在上清液中加入饱和的（NH4）2SO4使其终浓度为40%，4 ℃静置10h，再10000g离心20 min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100 ml，再次于4℃静置10 h后，10000 g离心20 min，沉淀用0.01M 的pH 为7.2 的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。
二、抗甲鱼系统性败血症球状病毒的应用效果研究
本发明一种抗STSSSV卵黄抗体，通过制备STSSSV抗原免疫鸡蛋，收集高免疫鸡蛋进行分离和纯化，保护实验来确定应用效果，保护实验方案及结果具体如下：
1、鸡胚水平的保护效果研究
（1）选取符合SPF标准的0日龄种蛋，气室向上38℃孵化，相对湿度50%，每4小时翻蛋一次，培养4-6d后，选取血管粗大且呈鲜红色的发育良好的鸡胚在暗室内画出气室轮廓，并标明大血管所处位置，以备病毒接种用；
（2）选取患系统性败血症的甲鱼若干只，取甲鱼内脏，加入质量体积比1：5的pH为7.4的TM缓冲液，于匀浆器中匀浆，将匀浆液于4℃ ，6000g离心20min后取含病毒的上清液，将离心所得的沉淀用1～2ml的TM缓冲液重悬，再次匀浆，将再次匀浆得到的匀浆液于4℃，6000g，离心20min，合并两次离心所得的上清液，将上清液先后用0.45μm、0.22μm的滤膜抽滤除去组织碎片，再用0.22μm的针式滤头过滤除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000IU青霉素和1000μg链霉素，于4℃冰浴过夜处理，即得到甲鱼系统性败血症球状病毒液（STSSSV）；
（3）选取健康，发育良好的4～6日龄的鸡胚，按表1将各组份注射到鸡胚的卵黄囊内，每组10个。
表1 鸡胚接种液处理及分组
将已接种了病毒的鸡胚于33.5℃的恒温条件下培养9～10天，观察记录死亡情况，死亡情况见表2。
表2 接种10d后各组死亡情况
由表2可知，抗STSSSV卵黄抗体对鸡胚无毒副作用，且对STSSSV有明显中和作用，对鸡胚保护率为70%。
2、甲鱼保护效果研究
取出壳10d的小甲鱼随机分为两组，每组10只，取STSSSV病毒液8ml（病毒制备方法与鸡胚水平的保护效果研究的病毒制备方法相同），加入曝气自来水1L，浸泡小甲鱼5h后，全部换曝气自来水，进行常规饲养，组1投喂普通甲鱼饲料，组2投喂甲鱼饲料与抗STSSSV卵黄抗体1:1混合料， 10d后组1死亡8只，死亡率80%；组2死亡3只，死亡率30%。结果表明抗STSSSV卵黄抗体能降低STSSSV对稚鳖的致死率，对稚鳖有明显的保护效果。
综合以上两个实例说明，按本发明方法制备的抗STSSSV卵黄抗体对STSSSV有明显的抑制作用，是高效、安全、绿色的新型生物制剂，可用于STSSSV引起的相关疾病的防治，并有望用于该病毒的检测。
Claims (1)
1.一种抗甲鱼系统性败血症球状病毒的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)抗原制备
选取患病甲鱼，取甲鱼内脏置于预先冰浴过的TNE缓冲液中，匀浆直至完全碎裂，将匀浆液在4℃，6000g条件下离心10min后，取上清液在4℃，8000g条件下离心20min，取再次离心所得上清液于4℃，35000g离心1.5h后获取一次沉淀物，将一次沉淀物的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，沉淀下层白色部分重悬于1ml的TM缓冲液中，4℃冰浴过夜；次日将过夜处理的沉淀重新悬浮起来，4℃下3500g条件下离心5min后，取上清液于4℃，38000g条件下离心1.5h获取二次沉淀物，将二次沉淀物的沉淀上层疏松部分小心去掉后，下层白色沉淀用少量TM缓冲液重悬后制成病毒悬浮液，即为甲鱼系统性败血症球状病毒抗原；所述的TNE缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mM Tris-HCl，200mM NaCl，5mM EDTA，1mM PMSF，所述的TM缓冲液的pH为7.5，配制终浓度如下：50mMTris-HCl，10mM MgCl2，1mM PMSF；
(2)动物免疫
将蛋鸡进行1次基础免疫和2～3次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤(1)得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，所述的加强免疫为在步骤(1)得到的甲鱼系统性败血症球状病毒抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，注射用量为每千克母鸡注射500mg甲鱼系统性败血症球状病毒抗原，每次免疫间隔时间为15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于4℃冰箱保存；
(3)特异卵黄抗体的分离和纯化
将步骤(2)得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，吸取卵黄液，然后在卵黄液中加入卵黄液10倍体积的0.05M的pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4℃冰箱静置过夜处理，将过夜处理后的混合液于4℃，10000g的条件下离心20min后取上清液，在上清液中加入饱和的(NH4)2SO4使其终浓度为40％，4℃静置10h，再10000g离心20min后取沉淀，将沉淀用140g/L的Na2SO4稀释至100ml，再次于4℃静置10h后，10000g离心20min，沉淀用0.01M的pH为7.2的PBS重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体。
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