CN103060443B - 一种臂尾轮属轮虫的线粒体12s 基因的部分rDNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种臂尾轮属轮虫的线粒体ND12s 基因的部分rDNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法，测序方法步骤包括臂尾轮属轮虫总DNA提取、PCR引物扩增及序列测定、系统发生分析；鉴定方法使用臂尾轮属轮虫的线粒体ND12s rDNA进行鉴定。本测序方法中所设计的PCR引物可以扩增出红臂尾轮虫等的线粒体ND12s rDNA，测序结果可用于对红臂尾轮虫等进行精确鉴定，解决了利用形态学和超微结构存在的鉴定困难，使得在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种臂尾轮属轮虫的线粒体12s基因的部分rDNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法。
背景技术
早期的轮虫分类学和系统学研究主要是依据形态学数据。如Wallace（1989）利用八种形态学特征进行聚类分析研究发现轮虫门（Rotifera）、真轮虫总纲（Eutatoria）和单巢纲（Monogonota）为单系，利用九种形态学特征进行聚类分析研究发现叶轮属（Notholca）分为六个分支。Melone（1998）通过对1种棘头动物、6种轮虫和2个外群（涡虫和颚胃动物）的60个形态特征进行矩阵分析，获得一个简约聚类树，发现双巢纲（Digononta）为并系类群，但不能确定轮虫门的单系性。该系统树不同于依据分子水平数据或演化分类原理而产生的系统树。以形态学数据所研究的轮虫系统学存在缺陷，因为轮虫的形态受遗传和环境因子两方面的影响，尽管遗传因素占主导地位。随着轮虫研究的深入，已有研究者发现形态学数据已经不能满足轮虫部分种类鉴别和系统进化研究（Guiset，1977；Koste，1978；Shiel，1993；Fontaneto，2007）。Sergi(2005)等研究了褶皱臂尾轮虫(B. plicatilis)L-型的两个种B. plicatilis sensu stricto 和B. manjavacas之间的形态度量差异，发现B. plicatilis s.s.比B. manjavacas平均长6％，两个种的个体之间表现出较大的形态度量交迭，形态学分类不能用于鉴别这两个种，目前它们的分类只能依据分子指标。2003年，为了了解形态可塑性和基因变异在轮虫的形态变化中的作用，Derry等研究了不同形态的龟甲轮虫(Keratella)线粒体COⅠ基因序列，发现有棘刺和无棘刺的螺形龟甲轮虫(Keratella cochlearis)遗传变异较大，核酸序列的差异达到4.4％，暗示它们是不同的种。而单棘刺和双棘刺的曲腿龟甲轮虫(K. hiemalis)核酸序列的差异为0.21％，并且氨基酸序列没有变异，说明它们的形态变异归因于环境的诱导。
传统的轮虫分类主要依据头冠、棘刺、足和口器等外部形态和内部结构等形态学特征。但由于轮虫种类众多、体型微小及表型可塑性，轮虫外部形态有些物种非常相似，并且同一物种还有季节性的周期变形，且许多种类缺乏有效地形态学分类特征，仅通过传统的方法进行鉴定和分类存在一定的困难，如壶状臂尾轮虫和红臂尾轮虫均为臂尾轮属常见种类，因它们具有相似的形态，早期的研究曾将这两种轮虫归为一种，称为Brachionus urceus，也译为壶状臂尾轮虫（张家楫）；后来Koste、章宗涉和黄祥飞等根据虫体前端棘刺的两侧是否对称和眼点的形状把B.urceus分为B.urceolaris和B.rubens两种，因此种的界定标准仍存在模糊不清之处，因此传统鉴定方法满足不了鉴定要求，并且内部咀嚼器的超微结构需要电子显微镜的辅助，鉴定困难。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种臂尾轮属轮虫的线粒体12s基因的部分rDNA测序及鉴定臂尾轮属轮虫的方法，本鉴定方法使用实验所设计的引物扩增轮虫线粒体上12s基因的部分rDNA序列，并对PCR产物进行纯化、连接、克隆、转化、测序，将序列进行比对分析来鉴别轮虫的种类。对轮虫进行分子生物学的种类鉴定，解决了利用形态学和超微结构存在的鉴定困难，使得在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种臂尾轮属轮虫的线粒体12s基因的部分rDNA测序方法，包括以下步骤：
A、臂尾轮属轮虫总DNA提取；
B、PCR引物扩增及序列测定；
C、系统发生分析。
所述步骤B中PCR引物为：BP12SF: 5’ -CACAAAAGACAAGGATTAGATACCC- 3’和BP12SP: 5’ -GT AACAGAGGTGACGGGATTTGTAC-3’；
扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min, 53℃退火1.5min, 72℃延伸1 min, 共35个循环；最后72℃延伸10min, 4℃保存。
一种鉴定臂尾轮属轮虫的方法，使用臂尾轮属轮虫的线粒体12s基因的部分rDNA序列进行鉴定。
基于线粒体12s基因的部分rDNA序列鉴定臂尾轮属轮虫，结果准确可靠；本方法中所设计的PCR引物可以扩增出红臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、角突红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、十指臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫的线粒体12srDNA，利用对12srDNA比对结果（包括A、C、G、T碱基的含量、变异位点、简约信息位点等）进一步分析了有争议种类的分类地位以及对轮虫种群之间的亲缘关系及轮虫的系统进化做出分子生物学的解释，可对红臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、角突红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、十指臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫进行精确鉴定。解决了利用形态学和超微结构存在的鉴定困难，使得在大规模培养轮虫的过程中，减少种群混杂带来的种群竞争而造成轮虫减产甚至大量死亡的可能性。
具体实施方式
本鉴定臂尾轮属轮虫的方法所用生物材料为红臂尾轮虫、萼花臂尾轮虫、角突红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、裂足臂尾轮虫、镰形臂尾轮虫、十指臂尾轮虫、尾突臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫，挑取每种轮虫单个个体，单克隆培养，其中红臂尾轮虫、方形臂尾轮虫、壶状臂尾轮虫、角突臂尾轮虫采用Gilbert（1963）配方，其余几种采用原地方水样过滤后作培养液，温度与采集时环境温度基本保持一致，所用食物为以HB-4培养液培养的，处于指数生长期的斜生栅藻，当单个克隆轮虫个体数目达到一定多的量的时候，用25μm孔径滤网滤出轮虫，并以无菌蒸馏水冲洗，Eppendof管收集，置于-20℃冰箱保存。
总DNA提取：利用 董 云 伟等(2002)的方法提取轮虫DNA。采用WizardTM基因组DNA纯化试剂盒(pormega， USA)提取轮虫DNA；将冻存的轮虫从-20℃冰箱中取出，离心数秒，吸去多余水分。加入60μl核裂解液(nuclear lysis solution)，轻弹离心管以使轮虫悬浮均匀，在4℃放置10min，取出；65℃水浴40min；取出冷却至室温，加入20μl蛋白沉降液(protein precipitation solution)，剧烈震荡10s，冰浴5min，13000g离心4min，小心吸取上清，加入60 μl异丙醇，2.5μl糖原(20mg/ml, Sigma，USA)，小心混匀。-70℃放置30min, 13000g离心20min，然后弃去上清，用70%酒精洗涤两次。在无菌室将其吹干，然后加入50μl无菌双蒸水，4℃放置过夜以溶解DNA。
PCR扩增及序列测定：扩增反应在PCR扩增仪上进行。PCR 引物设计如下： BP12SF: 5’ -CACAAAAGACAAGGATTAGATACCC-3’和BP12SP:5’-GTAACAGAGGTGACGGGATTTGT
AC-3’， 引物于上海Invitrogen公司合成；PCR 反应体系的总体积为25μl, 包括1×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus), 0.4 mmol/L dNTP, 1.5μmol/L 引物, DNA模板2μl, 1U的TaKaRa La Taq酶, 超纯水补至25μl；扩增反应程序如下: 94℃预变性5min；94℃变性1min, 53℃退火1.5min, 72℃延伸1 min, 共35个循环；最后72℃延伸10min, 4℃保存；扩增完成后，用BBI 试剂盒纯化PCR产物，取2μl 于1%的琼脂糖凝胶电泳上检查，其余-20℃保存备用。将纯化产物用TaKaRa Pmd 18-T Vector克隆；最后送上海生工测序。
系统发生分析：对测序结果进行处理并分析，序列编辑使用CLUSTALX（1.81）软件（Thompson，1999）进行DNA序列比对。
通过引物测得轮虫12s基因的部分rDNA序列如下：
红臂尾轮虫：
GTGCGTGATGAGTCTTAAGATAATTTAGTTTAAAATTCAAATAATTTGGCGGTAAGGAAAGAACTCAGAGAAACCTGAGTATTAATTGGATGATCCACCATTATAATTTCTTAGTATGTTTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGGTTATCGTTAGATCTTTAGCCTTCTAATTTAATTAAATTCAAATTCAGGTCAATATAGGGATTGTTACTAAGTTTTCTTGGGTTGCAATTAAGATCATTGGTGATTTAGTTAATTTAAATCTAATTTGGATTTGAAAGTAAACGCTTATGTAGATGTGTTGAATTGGTCTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTCCCTTTTGGTTACAAGC
萼花臂尾轮虫：
ATGAGTGATGATACAAGATAATTAAATTACAAATTCAAACAATTTGGCGGTAAGAAAAGAACTCAGAGAAACCTAAGTATTAATTGGATGATCCACCATCATACATTCTTATTATATTTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGTCTATCGTTAGATCTTTAGACTATTAAATTTATAAATATAAATTCAGGTCCATATAGGGATTGTTAATAAGATAACTCGGGTTGCATTTAAAACTACTAGTAGCTTAATCAATATTAGCTTAATTCGGATTTGAAAGTAAATATTTCTGTAAATATATTGAATTCCTCTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTACC
角突臂尾轮虫
CTTCTGTATTACCTAAAGATAATTACATTTGAAATTTAACATATTTGGCGGTAAAGAGAGACCTCAGAGAAACCTGCGAATTAATTGGATGATCCACCTTTATACTTTCTTAGTATGTTTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGGGTACTGTCAGATCTATAGCCTAATTAAATTATTACTAATCGTAATTCAGGTCTATATAGGGATTGTTACTAAGGTCTCTTGGGTTGCATTTAAGATAATTGGTGGTAGTTTTAGTTTACTACTTAATTCGGATTTGAAAGTAAATATTTTTGTTTATATATTGAATTTCCTTCTCTTTAAGTACAAATCCCGTCACCATCTGAATAGAGACACC
方形臂尾轮虫
TGTCGATGCAACTAAATATGATAATTTCGTTTAAAATTCAAATAATTTGGCGGTAAGAAAAGAACTCAGAGAAACCTGAGAATTAATTGGATGGTCCACCAGTAATATTACTTAGCATGTATGTTACCTGTATGTCTGTTTAGATTATCGTTAGCTCTTTAATCTTTTCATTGTTTAATATAAATTCAGGTCGATATAGGGATTGTTGCTAAGTTTACTTGGGTTGCATTTAAGATTACTAATAACTCAGTTAATATGGGTTTAATTTGGATTTGAAAGTAAATATTTTTGTATATATATTGAATTCCACTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTCCCGTCATGTTTACAGAGA
裂足臂尾轮虫
TGGTGAGAGTTTCTACGATAATTTATTTTAAAAATTTAATATATTTGGCGGTAGAGAGAGACCTCAGGGAAACCTGCGAATTAATTGGATGATCCACCATTTTACTTTCTTAACATGTTAGTTACCTGTATGTCTGTTTAGGGTACTGTCCGATCTATAGCCGTCCAGTTTTTTTTAAACGTAATTCCAGGCCATATAAGGATTGGTGTTAAAGTTTCCTGGGTTGCATTTTAAAATAATTGTGGTCCTGTTTATTTAAAATTTTATTCCGAATTTAAAATTAATTTTTTTTAATTTAATTTAATTTCCTTTTTTTTTAATTCCAATCCCCTCCCCTTCTTTACA
镰形臂尾轮虫
ATGTGTGATGATAACACAAGATAATTTAATTAAAAATTCAAACAATTTGGCGGTGAGAAAAGAACTTAGGGAAACCTGGGGATTAATTGGATGATCCACCATTATTATGTCTTAGTATGTGTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGATTATCGTTAGATCTTTAGTCTTTTGTTTTACAAAACTTGAGTTCAGGTCGATATAGGGATAGTTACTAAGGTCTTCTGGGTTGCATTTAAGATTATTGATAGTTTTTATATTACAAAACTTAATCTGGACTTAAAAGTAAACTTTTATGTACATAAGTTGAATTTTGCTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTACC
十指臂尾轮虫
ACTGGAATACTTACAAGATAATTACTTTTAAAATTTAAAAAATTTGGCGGTAAAAGAAGACCTCAGAGAAACCTGTGAATTAATTGGATGAGCCACCATTAAACTTTCTTGAAATATTTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGATTATCGTTAGATCTTTAATCTTTTAGTTACTTTAACTTAAATTCAGGTCGATATAGGGATTGTTTTCAAGTTTCCATGGGTTGCATTTATGCTAATTAGTGACTTTTTTAATATAAGTCTAATTTGGATTTGATAGTAAATATTTATGTATGTATGTTGAATTTCTCTTCTTTTAAGTACAAATCCCGTCCCATCTATTACAA
尾突臂尾轮虫
ATTGCCTGCTGAATTATTATGATAATTATTTTACAAATTCAATATATTTGGCGGTAAGAAAAGAACTCAGAGAAACCTGCGAGTTAATTGGATGATCCACCATTTTTACTTCTTATTATGTTTGTTACCTGTATGTCTGTTTAGAGTATTGTTAAATCTTTAGTCTTCTCTATTTAAAAGAATGTTAATTCAGGTCAATATAGGGATTGTTAATAAGTCTTCTTGGGTTGCATTTAGGATAAATAGTAGTCTTTCCAAAATTAGGCTTAATTCGGATTTGAAAGTAAATATTCTATAAATATATTAAATTTTATTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTCCCTTCTATTACAAGGAGT
壶状臂尾轮虫
GTTGGTGATGTTAAAGATAATTAAGTTTTAAATTCAAATAATTTGGCGGTAAGAAAAGAACTCAGAGAAACCTGAGAATTAATTGGATGGTCCACCATTATTCGTTCTTAATAAATAAGTTGCCTGTATGTCTGTTTAGATTATCGTTAGATCTTTAGTCTTTATATTGTTCAATTTAAATTCAGGTCAATATAGGGATTATTATTAAGTTTCCTTGGGTTGCATTTAAGCTTATTAGTGATTTAATTAATAAAAATCTAATTTGGATTTGAAAGTAAATATTTGTGTAAGTATTTTGAATTCTACTTTTCTTAAGTACAAATCCCGTCCCT
Claims (3)
1.一种臂尾轮属轮虫的线粒体12s基因的部分rDNA测序方法，包括以下步骤：
A、臂尾轮属轮虫总DNA提取；
B、PCR引物扩增及序列测定；
所述步骤B中PCR引物为：BP12SF:5’-CACAAAAGACAAGGATTAGATACCC-3’和BP12SP:5’-GTAACAGAGGTGACGGGATTTGTAC-3’。
2.如权利要求1所述的测序方法，其特征在于：所述步骤B中扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min,53℃退火1.5min,72℃延伸1min,共35个循环；最后72℃延伸10min,4℃保存。
3.一种鉴定臂尾轮属轮虫的方法，使用臂尾轮属轮虫的线粒体12S基因的部分rDNA序列进行鉴定，所述线粒体12S基因的部分rDNA序列使用权利要求1或2的测序方法测定。
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2012
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 基于16S rDNA序列探讨十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位;程双怀 等;《动物分类学报》;20091031;第34卷(第4期);934、935页 * |
| 程双怀 等.基于16S rDNA序列探讨十种臂尾轮虫的系统关系和分类地位.《动物分类学报》.2009,第34卷(第4期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103060443A (zh) | 2013-04-24 |
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