CN103060287B - 一种柚苷酶发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柚苷酶发酵培养基，其组分及重量份为：柚皮粉100份，铵盐（或尿素）4-20份，水100-300份。本发明用柚皮作为柚苷酶发酵的主要原料，以铵盐或尿素为氮源，从而消除了葡萄糖、果糖和淀粉等对柚苷酶发酵的分解代谢阻遏作用。由于柚子已经实现了产业化加工，作为副产物的柚皮具有稳定的来源；此外，柚子加工采用先剥皮后榨汁的工艺，所剩余的果皮与橙、橘和葡萄柚（西柚）的加工副产物相比具有柚皮苷和橙皮苷含量高、葡萄糖和果糖含量低等优点。因此，本发明的培养基具有来源稳定、价格低廉、柚苷酶发酵产量高等特点，有利于工业化生产。该培养基无论是用生料发酵还是用熟料发酵，都可高产柚苷酶。

Description

一种柚苷酶发酵培养基

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵培养基，具体地说涉及一种用于柚苷酶工业发酵的培养基及其应用方法。

背景技术

柚苷酶（Naringinase）是一种以水解柚皮苷(化学名为4, 5, 7-三羟黄烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)至柚皮素为活性特征的糖苷酶，它具有α-L-鼠李糖苷酶（E.C.3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21）两种酶的活性。

人们对柚苷酶的液态和固态发酵生产技术进行了较长期的研究。2011年，Puri等利用Staphylococcus xylosus MAK2菌株发酵橘皮产柚苷酶，研究表明添加橘皮可明显提高酶的产量，产酶可达8.9 IU/mL。同年，Mutuswamy等以米糠、麦麸、甘蔗渣、橘皮等为固态原料发酵柚苷酶，对比发现：向培养基中添加诱导物柚皮苷0.1%时，利用米糠固态发酵产酶最大可达58.1 U/gds；橘皮略次之为54.76 U/gds。2012年，Ni等从腐烂的柚子中筛选得到柚苷酶高产菌株黑曲霉DB056，以20 g/L的柚皮苷为唯一碳源，在200 L罐上进行柚苷酶发酵，柚苷酶活力达2.5 U/mL。但目前柚苷酶发酵存在培养基成本高、酶发酵活力低等不足，其工业酶制剂的价格十分昂贵，如：日本田边制药生产的柚苷酶制剂（酶活力为150 U/g），其售价高达2600 元/kg，限制了柚苷酶在食品工业中的应用。因此，开发新的柚苷酶发酵生产技术、降低其生产成本具有重要意义。

发酵工艺和发酵原料是影响酶发酵产量和发酵成本的重要因素。微生物发酵酶主要有两种方式：固态发酵和液态发酵。在液态发酵过程中微生物容易形成菌丝球和菌膜，限制了营养物质的吸收及酶的分泌，酶产量低、发酵效率低。相比而言，固态发酵周期短、工艺简单、不易形成菌丝球、酶产量高，是工业酶制剂常用的生产方式。相关研究表明，液态发酵柚苷酶的产量普遍比固态发酵低。此外，在液态发酵柚苷酶时常用柚皮苷和橙皮苷为原料，成本高；而在柚苷酶固态发酵过程中，常用橙、葡萄柚（西柚）和橘子的加工副产物为原料，成本低。因此，固态发酵是生产柚苷酶的理想方法。

相关研究表明，柚苷酶是诱导酶，其合成需要柚皮苷、橙皮苷等诱导物的存在。根据酶的诱导和合成相关理论，诱导酶的合成常受到分解代谢阻遏效应的调控。即当培养基中存在多种营养物时，微生物对营养物的利用具有先后顺序，优先利用营养物（速效营养物）的分解产物对迟效营养物利用的相关酶具有抑制作用，最经典的例子就是葡萄糖的存在会抑制乳糖分解酶的合成。在柚苷酶的发酵过程中，我们也发现了明显的分解代谢阻遏现象，如本说明书表1中培养基7、8和9，当培养基中含有葡萄糖、果糖和淀粉时，柚苷酶的合成量大幅度降低。因此，在寻找柚苷酶工业发酵培养基原料时，还要考虑其含有的诱导物含量及是否产生分解代谢阻遏效应等因素。

柚苷酶固态发酵的培养基主要由碳源和氮源组成。目前，相关文献报道的发酵柚苷酶的碳源主要有橘皮、橙皮、甘蔗渣等；而氮源主要是豆饼粉、麸皮、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等。目前报道的固态发酵柚苷酶的培养基原料具有以下几方面不足：（1）鲜食所剩下的橙皮、橘皮和葡萄柚（西柚）皮由于收集困难、来源不稳定而不适用于工业发酵柚苷酶；（2）甘蔗渣和其他碳源由于缺乏诱导物而需要加入柚皮苷和橙皮苷等才能合成柚苷酶，成本高；（3）蛋白胨、酵母膏和牛肉膏等氮源由于价格昂贵，仅适用于实验室研究，用于工业发酵会大幅增加成本；（4）豆饼粉、麸皮等由于含有大量的淀粉而容易产生分解代谢阻遏，柚苷酶的合成量受到限制，难以实现高产发酵。因此，目前报道的柚苷酶发酵培养基的原料由于来源不稳定、价格高及存在分解代谢阻遏等原因而不能应用于工业生产，寻找来源稳定、加工低廉、产量高的发酵培养基是实现柚苷酶工业发酵的关键。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供一种原材料来源稳定、价格低廉、消除分解代谢阻遏的柚苷酶固态发酵培养基，不仅提高柚苷酶的发酵产量，还降低其发酵培养基成本。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种柚苷酶发酵培养基，以柚子加工的副产物柚皮为碳源、铵盐或尿素为氮源配制培养基，其组分及重量份为：柚皮粉100份，铵盐或尿素4-20份，水100-300份。

所述铵盐为硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、磷酸铵、磷酸氢铵和碳酸氢铵中的一种或几种。

制备本发明的柚苷酶发酵培养基的方法：

（1）将柚皮晒干或烘干，粉碎，得到柚皮粉；

（2）按所述重量份称取柚皮粉、铵盐或者尿素、水，并搅拌均匀。

本发明用工业加工柚子的副产物柚皮为碳源进行发酵。具有以下几个优点：（1）柚子是我国南方大宗的亚热带水果，近年来，柚子果汁加工业快速发展，产生了大量的加工副产物——果皮，柚皮具有稳定的工业来源，相比鲜食所剩的橘皮、橙皮和葡萄柚（西柚）皮，柚皮容易收集、来源稳定、成本低；（2）由于柚子果实大、果皮厚而硬，在工业生产柚子果汁的过程中，采用了先剥皮后榨汁的工艺，不仅有效防止了果皮中的柚皮苷、橙皮苷等流失到果汁中，同时也防止了果肉和果肉渣中的葡萄糖和果糖等渗透到果皮中。而橘汁、橙汁和葡萄柚果汁加工由于采用整果榨汁的工艺，其副产物（果皮和果肉渣混合物）中柚皮苷和橙皮苷含量少（流失到果汁中，导致柚苷酶诱导作用弱），且含有一定量的葡萄糖和果糖（果肉渣带入，容易产生分解代谢阻遏）。因此，柚皮与橘、橙、葡萄柚（西柚）鲜食和加工所产生的副产物明显不同，不仅来源稳定、成本低，而且其中柚皮苷和橙皮苷的含量高、葡萄糖和果糖含量低，对柚苷酶的诱导作用强并消除了分解代谢阻遏作用，从而可大幅度提高柚苷酶的产量。

铵盐是常用的工业发酵氮源，但目前的相关研究报道铵盐对柚苷酶的合成具有抑制作用，不能作为柚苷酶高产发酵的氮源，而我们前期研究发现铵盐只在液态发酵过程中对柚苷酶的合成具有抑制作用，而在固态发酵过程中用铵盐为氮源却消除了以豆饼粉为氮源时产生的葡萄糖分解代谢阻遏（表1培养基5）效应，有利于提高柚苷酶的发酵产量（表1培养基6）。另外，在研究过程中我们发现尿素可水解生产铵根离子，从而实现和铵盐基本同等的作用和效果。本发明用铵盐或尿素为氮源，具有以下优点：（1）相比蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等价格昂贵，铵盐和尿素价格便宜，来源稳定，更适于工业化中应用；（2）相比豆饼粉和麸皮等氮源中含有大量的淀粉，其容易被微生物分泌的淀粉酶分解成葡萄糖而产生分解代谢阻遏效应，铵盐和尿素不产生分解代谢阻遏，可有效提高柚苷酶的产量。如：我们研究时发现，当豆饼粉和柚皮的重量份数比例大于35:100时（表1培养基5），柚苷酶的合成量就显著下降。而用铵盐或尿素代替豆饼粉时，柚苷酶的产量就大幅度提高（见实施例6）。

因此，本发明提供的以加工所产生的副产物柚皮为碳源和以铵盐或尿素为氮源进行柚苷酶固态发酵具有原料来源稳定、成本低、柚苷酶产量高的特点，是适合工业化生产柚苷酶的培养基。且该培养基无论是用生料发酵还是用熟料发酵，都可以高产柚苷酶。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例中的培养基通过以下方法制备：

（1）将柚皮晒干或烘干，粉碎，得到柚皮粉；

（2）实施例1-11按照重量比例称取柚皮粉、铵盐或尿素、水搅拌均匀，进行生料发酵（培养基不灭菌而直接接种后进行发酵）或熟料发酵（培养基在121oC条件下灭菌20-60分钟后接种发酵）。

（3）采用Davis法测定酶活性，柚苷酶的活力定义为目前该领域中的通用定义,即1个柚苷酶活力单位为在pH 4.0和40oC条件下水解1μg柚皮苷所需要的酶量，酶反应时间为60 min。

下述实施例中采用的发酵菌株为棘孢曲霉，可利用本发明的培养基进行柚苷酶发酵的微生物不限于棘孢曲霉，其他的如黑曲霉、土曲霉、青霉等微生物也可利用本发明的培养基进行柚苷酶发酵。采用不同的微生物利用本发明的培养基进行柚苷酶发酵并不影响本发明的专利保护范围。

实施例1

柚皮粉100份，硫酸铵4份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到41767.38 U/gds；

本实施例中的生料发酵方法为：培养基不灭菌而直接接种后进行发酵，实施例2-6、实施例10、实施例11的生料发酵方法可参考本实施例的生料发酵方法进行。

实施例2

柚皮粉100份，硫酸铵12份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到67022.68 U/ gds；

实施例3

柚皮粉100份，硫酸铵8份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到61525.67 U/gds；

实施例4

柚皮粉100份，硫酸铵10份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到70687.27 U/gds；

实施例5

柚皮粉100份，硝酸铵13份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到70452.16 U/gds；

实施例6

柚皮粉100份，磷酸氢二铵10份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到86326.91 U/gds；

实施例7

柚皮粉100份，磷酸氢二铵10份，水150份，熟料发酵柚苷酶活力达到60620.91 U/gds；

本实施例中的熟料发酵方法为：培养基在121oC条件下灭菌20-60分钟后接种发酵，实施例8、实施例9和实施例12的熟料发酵方法可参考本实施例的熟料发酵方法进行。

实施例8

柚皮粉100份，磷酸氢二铵10份，水200份，熟料发酵柚苷酶活力达到60530.28 U/gds；

实施例9

柚皮粉100份，磷酸氢二铵10份，水300份，熟料发酵柚苷酶活力达到42651.50 U/gds；

实施例10

柚皮粉100份，尿素5份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到55486.89 U/gds。

实施例11

柚皮粉100份，硫酸铵4份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到39358.86 U/gds；

实施例12

柚皮粉100份，硫酸铵8份，磷酸氢二铵12份，水150份，熟料发酵柚苷酶活力达到66027.95 U/gds。

实施例13

柚皮粉100份，磷酸氢二铵14份，水100份，生料发酵柚苷酶活力达到113476.03 U/gds。

本发明人还进行相关对比实验，以测验本发明的培养基进行柚苷酶发酵的效果，如下面的表1所示：表1

上述对比实验中，采用的菌株以及发酵方法和实施例4保持一致，培养基编号为6的实验方案即为本发明的实施例4的方案。从该组对比实验中发现，本发明的培养基中采用硫酸铵作为氮源可以很好地替代豆饼粉；以表1中培养基3、4和5对比可显示用铵盐做氮源可克服提高豆饼粉添加量所引起的分解代谢阻遏效应，从而提高柚苷酶的产量。

Claims (2)

1.一种柚苷酶发酵培养基，其特征在于：其组分及重量份为：柚皮粉100份，铵盐或尿素4-20份，水100-300份。

2.根据权利要求1所述的柚苷酶发酵培养基，其特征在于：所述铵盐为硫酸铵、硝酸铵、磷酸氢二铵、氯化铵、磷酸铵、磷酸氢铵和碳酸氢铵中的一种或几种。