CN103054910A - 一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，该方法是将破壁灵芝孢子粉提取得到灵芝孢子油，在加入石油醚，乙醇等有机溶剂和纯净水进行提取，提取得到的下层溶液进行浓缩，浓缩液使用大孔树脂柱等进行柱分离，用纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；收集最后一次洗脱液经冷冻干燥后得到抗肿瘤组合物。通过本发明得到的组合物能抑制体外及体内的肿瘤细胞生长，抑瘤率达到56.3%以上。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学及中药学领域，具体涉及一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法。
背景技术
灵芝，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。始载于《神农本草经》，后列入《本草纲目》，被列为上品，味甘性平，扶正固本。具有抗肿瘤，免疫调节，抗氧化，抗放射线损伤及化疗药损伤，改善睡眠，强心降压，镇咳平喘的作用。
灵芝孢子粉，为灵芝子实体生长成熟期所产生的生殖细胞灵芝孢子的集合。含有脂肪酸类，甾醇类，三萜类，生物碱类，内酯，蛋白质和氨基酸，糖肽以及无机盐，现代药理研究表明灵芝孢子粉的抗肿瘤的作用：抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的转移，促进肿瘤细胞的分化，抑制肿瘤内血管生成，同时通过增强人体的免疫力达到抗肿瘤的功能。
灵芝孢子油是由破壁灵芝孢子粉中通过超临界CO2提取提出的天然成分，富集了灵芝孢子粉中的灵芝三萜类、脂肪酸类、麦角甾醇类成分，抗肿瘤活性成分比灵芝孢子粉更高，具有调节血脂，增强免疫，抗肿瘤等多方面作用。
但是灵芝孢子油的成分复杂，哪些成分具有更大的抗肿瘤的生物活性在目前还不十分明确，仍然是学术界研究的热点。灵芝孢子油的成分大部分为已知的各种脂肪酸及甘油三酯，其中真正起抗肿瘤作用的成分尚不明确。而有关于灵芝孢子油的抗肿瘤活性应用多是将灵芝孢子油与其他中药或中成药相混合。
中国专利200610086075.1一种富含萜类的灵芝孢子油类制剂加工方法：采用膜分离的方法收集特定分子量的孢子油以提高有效成分含量，其总三萜纯度能提高1倍但是并未提供具体的抗肿瘤活性数据。
中国专利申请20110168831.6一种提高灵芝孢子油抗肿瘤功效的加工方法：采用超声离心静置的方法分离特定层的孢子油以提高抗肿瘤活性，新孢子油得率为26~27%，剂量为160mg/kg时，该新孢子油对小鼠肉瘤的抑瘤率为55.57%，对小鼠胸腔积液中原代肿瘤的抑瘤率为56.06%。但是该新孢子油的抗肿瘤功效的成分并未提及。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，该组合物具有良好的抗肿瘤功效。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，它包括以下步骤：
1.1． 将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯（分析纯）、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇（分析纯）和0.5-1.0V升纯净水(18MΩ.cm)；
1.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
1.3. 静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
1.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
1.5 将上述这0.01V 升浓缩液用0.02-0.025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6V升的大孔树脂柱进行分离；
1.6 用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；
1.7 收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；
1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
本发明所指的石油醚或乙酸乙酯、无水乙醇或甲醇为分析纯。
或它包括以下步骤：
2.1． 将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯（分析纯）、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇（分析纯）和0.5-1.0V升纯净水(18MΩ.cm)；
2.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
2.3. 静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
2.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
2.5 将上述这0.01 V升浓缩液用0.02-0.025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；
2.6 用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；
2.7 收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；
2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
按上述方法制备所得的组合物通过高效液相色谱仪（HPLC）的指纹图谱的测定，有主要4个成分具有良好的抗肿瘤功效。通过本发明得到的组合物，对小鼠的前列腺癌细胞RM-1的半抑制率IC50是2.19 (μg/mL)，对小鼠肺腺癌细胞LA795是4.49，对小鼠淋巴白血病细胞L1210是5.47，（IC50小于10为有效）。该组合物对荷有前列腺RM-1癌肿瘤的小鼠，用量110mg/kg时，对小鼠抑瘤率为56.9%，有好的抑瘤效果。
附图说明
图1为抗肿瘤组合物的HPLC指纹图谱
具体实施方式
下面结合视图对本发明进行详细的描述, 下面的实施例可以使本专业的技术人员更理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
本发明所述纯净水的电阻率大等于18MΩ.cm。
一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，它包括以下步骤：
1.1． 将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯（分析纯）、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇（分析纯）和0.5-1.0V升纯净水(18MΩ.cm)；
1.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
1.3. 静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
1.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
1.5 将上述这0.01V 升浓缩液用0.02-0.025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6V升的大孔树脂柱进行分离；
1.6 用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；
1.7 收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；
1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
实施例1：
1．将200mL的灵芝孢子油加入1000mL分液容器内，再依次加入200mL的石油醚、100mL的无水乙醇和100mL纯净水，总液体体积为600mL；
2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
3．静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL；
5．将这2mL浓缩液用5mL大孔树脂（HZ816）搅拌，挥干，再加入到50mL的大孔树脂柱（HZ816）进行分离；
6．用体积为大孔树脂柱2倍（100mL）纯净水和体积为大孔树脂柱2倍（100mL）50%乙醇、体积为大孔树脂柱3倍（150mL）75%乙醇进行梯度洗脱；
7．收集75%的乙醇洗脱液；
8．将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物，得率为0.47%。
实施例2
1．将200mL的灵芝孢子油加入1000mL分液漏斗内，再依次加入100mL的石油醚、200mL的甲醇和200mL纯净水，总液体体积为700mL；
2．将分液漏斗固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
3. 静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL；
5．将这2mL浓缩液用5mL大孔树脂（HZ816）搅拌，挥干，再加入到100mL的大孔树脂柱（HZ816）进行分离；
6．用体积为大孔树脂柱2倍（200mL）纯净水和体积为大孔树脂柱3倍（300mL）50%乙醇、体积为大孔树脂柱3倍（300mL）85%乙醇梯度洗脱；
7．收集85%的乙醇洗脱液；
8．将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物，得率为0.55%.
制作组合物的另一种方法它包括以下步骤：
2.1． 将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯（分析纯）、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇（分析纯）和0.5-1.0V升纯净水(18MΩ.cm)；
2.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
2.3. 静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
2.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
2.5 将上述这0.01 V升浓缩液用0.02-0.025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；
2.6 用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；
2.7 收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；
2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
实施例3
1．将200mL的灵芝孢子油加入1000mL分液漏斗内，再依次加入100mL的乙酸乙酯、200mL的无水乙醇和150mL纯净水，总液体体积为650mL；
2．将分液漏斗固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
3．静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至2mL；
5．将这2mL浓缩液用5mL聚酰胺树脂搅拌，挥干，再加入到100mL的聚酰胺树脂柱进行分离；
6．用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍（200-300mL）的纯净水、250mL50%的乙醇和300mL95%的乙醇梯度洗脱；
7．收集95%的乙醇洗脱液；
8．将洗脱液进行冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物，得率为0.60%。
我们对制得的组合物进行检测和动物试验
该组合物的高效液相色谱（HPLC）的指纹图谱的测定方法：
1．仪器与试药
岛津LC-20A，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），甲酸（色谱纯），纯净水(18MΩ.cm)。
2．色谱条件
流动相：甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液；
柱子：ODS-3，5μm×4.6mm×250mm；
流速：2mL/min；
波长：278nm；
柱温：40℃；
进样L：20μL。
3．指纹图谱鉴定：如图1所示，灵芝孢子油的组合物有主要4个成分，具有良好的抗肿瘤功效。
以下通过实验例对本发明方法的效果做进一步阐述。根据化学药物临床前指导原则：IC50提取物在30μg/mL之内，合成物在10μg/mL之内为抑瘤有效。
实验例1：该组合物对小鼠肿瘤细胞增殖的抑制效果
实验材料：按照本专利的实施例1方法制备得到组合物
实验方法：制备小鼠前列腺癌细胞RM~1，小鼠肺腺癌细胞LA795，小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞悬液加入96孔培养板中：每孔细胞浓度为RM~1：10000/孔，LA795：1500/孔，L1210：2×105/孔，共90μL。放置于37℃培养箱中培养12小时；加入不同浓度的组合物：0.5μg/mL，0.5μg/mL，2.5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL各10μL；在溶剂对照组中加入乙酸乙酯（分析纯）10μL；将96孔板放置于37℃培养箱孵育72小时；每孔加入10μL的CCK-8孵育2小时，测定450nm吸光度。
实验结果：用半抑制率IC50（即某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%的浓度）来表示，
表1. 组合物对不同癌细胞的半抑制率IC
50
| 细胞株 | IC50 (μg/mL) |
| 小鼠前列腺癌细胞RM-1 | 2.19 |
| 小鼠肺腺癌细胞LA795 | 4.49 |
| 小鼠淋巴白血病细胞L1210 | 5.47 |
IC50越低越表明该组合物抑瘤的效果越好，因此该组合物对小鼠前列腺癌细胞RM-1增值的抑制效果最好。
实验例2：组合物对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制效果
实验材料：按照本专利的实施例3方法制备得到组合物
实验方法：1、肿瘤接种：体外培养RM-1小鼠前列腺癌细胞，实验前将细胞配成1×107个/mL，接种到小鼠腋下，每只0.2mL；接种肿瘤后的动物继续饲养7天，待肿瘤生长至一定体积时开始给药；分组及给药：将小鼠随机分为阴性对照组、溶媒（吐温80）对照组、组合物低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性药（环磷酰胺）对照组，共6组，每组10只；阴性对照组，溶媒对照组和实验组行灌胃给药，阳性药对照组行腹腔注射给药，给药前禁食12-16小时，不禁水；阴性对照组给予0.2mL纯净水/只，溶媒对照组给予0.5%吐温80溶液0.2mL/只，低中高剂量组分别2.5mg/mL，5mg/mL，10mg/mL的组合物溶液，溶剂为0.5%吐温80溶液，给予0.2mL/只，阳性药对照组为2mg/mL的环磷酰胺溶液，给予0.2mL/只；给药时间为10天，给药10天后，处死称重，解剖小鼠取肿瘤，称肿瘤重。
实验结果：剂量为110mg/kg时，该组合物对小鼠抑瘤率为56.9%因此该组合物对小鼠前列腺癌具有好的抑瘤率。
Claims (3)
1.一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
1.1．将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇和0.5-1.0V升纯净水；
1.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
1.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
1.5 将上述这0.01V 升浓缩液用0.02-0.025V升大孔树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6V升的大孔树脂柱进行分离；
1.6 用体积为大孔树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于75%乙醇进行梯度洗脱；
1.7 收集浓度大等于75%乙醇的洗脱液；
1.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
2.一种灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
2.1．将V升的灵芝孢子油加入容积大于5V升的分液容器内，再依次加入0.1-1.0V升的石油醚或乙酸乙酯、0.1-1.0V升的无水乙醇或甲醇和0.5-1.0V升纯净水；
2.2．将分液容器固定在全自动液液萃取器内，进行提取0.5小时；
静置0.5小时后分层，分离下层溶液；
2.4．将下层溶液进行旋蒸浓缩，用甲醇定容至 0.01V升；
2.5 将上述这0.01 V升浓缩液用0.02-0.025 V升聚酰胺树脂搅拌，挥干甲醇，再装入0.25-0.6 V升的聚酰胺树脂柱进行分离；
2.6 用体积为聚酰胺树脂柱2-3倍的纯净水、50%乙醇及浓度大等于85%乙醇进行梯度洗脱；
2.7 收集浓度大等于85%乙醇的洗脱液；
2.8 将洗脱液经冷冻干燥，真空度为20Pa，冻结温度为-20℃，捕水器温度为-50℃，得到抗肿瘤组合物。
3.根据权利要求1或2所述的灵芝孢子油中抗肿瘤组合物及其制备方法，其特征在于，所述纯净水的电阻率大等于18MΩ.cm。
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Application publication date: 20130424 Assignee: Xianzhi Technology (Fujian) Co.,Ltd. Assignor: Fujian Xianzhilou Biological Science and Technology Co., Ltd. Contract record no.: 2014350000111 Denomination of invention: Anti-tumor composition in ganoderma lucidum spore oil and preparation method thereof Granted publication date: 20140625 License type: Common License Record date: 20141112 |
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| LICC | Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model |