CN103045724B - 应用基于小麦est序列的黑麦染色体特异分子标记对黑麦5r染色体进行鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于小麦EST序列的黑麦5R染色体特异的分子标记，此分子标记为根据小麦染色体上的表达序列标签序列而设计的正向引物和反向引物，用于鉴定黑麦5R染色体的特异标记；应用这些分子标记对黑麦5R染色体进行鉴定的基本步骤包括：A、标记引物的选定和制备；B、标记引物的稀释；C、黑麦染色体的特异标记：C-1、模板DNA的提取，C-2、PCR扩增，C-3、扩增产物的检测，C-4、结果比对。本发明基于小麦染色体上的EST序列设计开发出了一套黑麦染色体的特异分子标记，借助此分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的5R黑麦染色体，为黑麦染色体上的有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。
Description
本专利申请是如下专利的分案申请：发明名称为《基于小麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记及其应用》，申请日为2011-04-14；申请号为201110092988.5。
技术领域
本发明涉及分子生物学和遗传育种领域，具体涉及基于小麦表达序列标签(expressed sequence tag, EST)序列设计的分子标记，以及这些分子标记在跟踪检测黑麦染色体方面的应用。
背景技术
小麦的近缘种黑麦（Secale cereale L.）具有许多优良的性状，如根系发达、分蘖强、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐盐碱和酸性土壤，尤其是抗多种病害，如小麦白粉病（Blumeria graminis f．sp．tritici）、条锈病（Puccinia graminis f．sp．tritici）、叶锈病（P. triticina Eriks.）、秆锈病（P. graminis Pers. f. sp. tritici）、腥黑穗病（Tilletia Controversa Kuhn, TCK）和大麦黄矮病（Barley yellow dwarf virus, BYDV）等。因此，黑麦是对小麦进行遗传改良，拓宽小麦遗传基础，增加小麦栽培品种遗传变异的重要基因源。
黑麦中优异基因向小麦中转移的途径主要是创制一系列小麦/黑麦双二倍体、附加系、代换系和易位系。通过远缘杂交和染色体工程等手段将黑麦染色体导入到小麦背景中，之后，还需要对其进行准确的鉴定，才能有效地加以利用。与细胞学技术和生化标记法相比，分子标记法简单、快速和准确的特点使其广泛地用于检测、跟踪导入小麦背景中的黑麦染色体。然而，目前开发的黑麦染色体的特异标记，多集中在黑麦的1RS染色体上，如SSR标记Bmac0213（参考文献: Schneider A and Molnár-Láng M. 2008. Polymorphism analysis using 1RS-specific molecular markers in rye cultivars (Secale cereale L.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11-19），SSAP标记S10, S20，S17（参考文献: Nagy ED and Lelley T. 2003. Genetic and physical mapping of sequence specific amplified polymorphic (SSAP) markers on the 1RS chromosome arm in a wheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271-1277），EST-STS标记STSwe3和STSwe126 （参考文献: Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF,andAn DG. 2009. Development and application of EST-STS markers specific to chromosome 1RS ofSecale cereale.Cereal Research Communications 37: 13-21）等。Zhuang 等（2008）报道了1R，4R，5R，7R染色体特异的EST-SSR标记（参考文献: Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL, Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat. Acta Agron Sin, 34: 926-933）。Lee 等（2009）还报道了6个2RL染色体特异的EST标记（参考文献: Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo YW. 2009. Development and functional assessment of EST-derived 2RL-specific markers for 2BS.2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673）。
以普通小麦EST序列开发分子标记，这样的分子标记在其近缘物种中表现出很高的可转移性（参考文献: Zhang LY, Bernard M, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2005. High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals. Theor Appl Genet, 111: 677-687）。Zhang等（2007）（参考文献: Zhang LY, Bernard M, Ravel C, Balfourier F, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2007. Wheat EST-SSRs for tracing chromosome segments from a wide range of grass species. Plant Breeding, 126: 251-258）进一步报道了小麦的EST标记能够被用来跟踪其许多近缘种的染色体片段。因此，利用小麦的EST序列来开发黑麦染色体特异的分子标记十分可行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套基于小麦染色体上的EST序列而设计开发出的黑麦染色体特异的分子标记，借助这些分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的1R～7R全部黑麦染色体，为黑麦染色体上的有益基因转移到栽培小麦背景中提供简便有效的分子鉴定方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
基于小麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记，这些分子标记为根据小麦染色体上的EST序列而设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦1R～7R染色体的特异标记，其碱基序列见表1，
表1. 根据小麦染色体表达序列标签序列而设计的17对标记引物序列
其中，1-SWES999、2-SWES1119、3-SWES1128用于鉴定黑麦1R染色体，4-SWES120用于鉴定黑麦2R染色体，5-SWES228用于鉴定黑麦3R染色体，6-KSUM62、7-CFE218、8-MAG1424、9-SWES180、10-SWES182用于鉴定黑麦4R染色体，11-MAG1242用于鉴定黑麦5R染色体，12-SWES78、13-SWES206、14-SWES231、15-DUPW111用于鉴定黑麦6R染色体，16-CFE228、17-DUPW535用于鉴定黑麦7R染色体；其中，“EST”一列列出了分子标记所对应的小麦染色体上的EST序列的名称。
应用上述基于小麦EST序列的黑麦1R～7R染色体特异的分子标记对小麦背景中的黑麦染色体进行鉴定的方法，其步骤包括：
A、分子标记的选定和制备：根据所需鉴定的黑麦染色体选定分子标记，比如，预备检测小麦与黑麦远缘杂交后代材料当中是否含有黑麦2R染色体，则选定4-SWES120分子标记，然后根据表1给出的序列合成此标记引物；
B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100mmol L-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10mmol L-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L-1 Tris-HCl与1mmol L-1 EDTA，pH=8.0；
C、黑麦染色体的特异标记：
C-1、模板DNA的提取：取待测物——小麦与黑麦的远缘杂交后代材料，对照物0——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物1——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA；
C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物0及对照物1进行扩增；
C-3、扩增产物的检测：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对：将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物0、对照物1的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物1的电泳图谱均含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中含有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物0的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤A中选定的标记引物由上海联合基因有限公司合成。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤C-2中对所述待测物、对照物0及对照物1的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为0.2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，正、反向引物各0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
作为上述方法的一种优选技术方案，所述扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，根据标记引物的退火温度退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；其中各标记引物的退火温度为，1-SWES999，57；2-SWES1119，51；3-SWES1128，49；4-SWES120，55；5-SWES228，62；6-KSUM62，62；7-CFE218，60；8-MAG1424，52；9-SWES180，53；10-SWES182，58；11-MAG1242，55；12-SWES78，50；13-SWES206，55；14-SWES231，58；15-DUPW111，58；16-CFE228，60；17-DUPW535，58。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1～2h。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
①本发明的17个黑麦染色体的特异分子标记，是序列转化性的标记，比前人所用的RAPD标记更加稳定和具有可重复性；引物与模板的结合能力较强，能很好地扩增出目标片段，实验条件要求比较宽松；与鉴定外源染色体的C-分带和原位杂交的鉴定方法相比，操作步骤简单，实验技术要求较低，可以简单、快速地鉴定小麦背景中的黑麦染色体；
②本发明的17个黑麦染色体特异的分子标记覆盖了全部黑麦1R～7R染色体，能够检测小麦背景中的全部黑麦染色体，为利用黑麦有益基因改良普通小麦提供了分子标记辅助选择的基础；
③本发明是根据小麦的EST序列开发的分子标记，在小麦和黑麦之间具有很好的可转移性，这为饱和黑麦遗传连锁图谱提供了丰富的标记来源；
④本发明开发的分子标记，其序列直接来源于基因的转录区域，这为黑麦功能基因的鉴定奠定了基础。
附图说明
图1：黑麦5R染色体特异分子标记11-MAG1242在帝国黑麦、普通小麦中国春和“中国春-帝国黑麦”二体附加系（1R-7R）中的检测结果，其中，M：marker pUC19/MspI，箭头示在帝国黑麦和5R附加系中的特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：1R附加系，4：2R附加系，5：3R附加系，6：4R附加系，7：5R附加系，8：6R附加系，9：7R附加系。
图2：黑麦5R染色体特异分子标记11-MAG1242在普通小麦“小偃6号”和“德国白”黑麦杂交后代等材料中的检测结果，其中，M：marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：小偃6号，4：德国白黑麦，5：WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），6：WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），7：WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），8：WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），9：洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），10：洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），11：小黑麦06CT456（AABBRR），12：小黑麦06CT461（AABBRR）。
图3：黑麦4R染色体特异分子标记6-KSUM62在普通小麦“小偃6号”和“德国白”黑麦杂交后代等材料中的检测结果，其中，M：marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：小偃6号，4：德国白黑麦，5：WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），6：WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），7：WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），8：WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），9：洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），10：洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），11：小黑麦06CT456（AABBRR），12：小黑麦06CT461（AABBRR）。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。制备本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例1：黑麦5R染色体特异分子标记的开发
应用11-MAG1242分子标记对黑麦5R染色体进行鉴定的方法，待测材料为“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系，对照材料为帝国黑麦、普通小麦中国春和其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系；其中，“中国春-帝国黑麦”二体异附加系（1R-7R）为公知公用材料（参考文献: Driscoll C J, Sears E R, 1971. Individual additions of the chromosomes of “Imperial” rye to wheat. Agron Abstr, 1971:6）；操作步骤如下：
A、分子标记的制备：根据11-MAG1242标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100mmol L-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10mmol L-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L-1 Tris-HCl与1mmol L-1 EDTA，pH=8.0；
C、黑麦染色体的特异标记：
C-1、模板DNA的提取：取待测材料“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系和对照材料帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系，利用常规DNA提取方法分别提取其DNA；
C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系进行扩增；扩增实验的具体操作为，取9支体积为0.2ml的Eppendof管，向其中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，正、反向引物各0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，根据标记引物的退火温度退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；其中11-MAG1242标记引物的退火温度为55℃；最终获取“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系各自的扩增产物，共计9份；
C-3、扩增产物的检测：在步骤C-2所得的9份扩增产物中分别加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对：参看附图1，图中：M：marker pUC19/MspI，箭头示在帝国黑麦和5R附加系中的特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：1R附加系，4：2R附加系，5：3R附加系，6：4R附加系，7：5R附加系，8：6R附加系，9：7R附加系；11-MAG1242在帝国黑麦和“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系中均有大约500bp的特异性扩增，而在中国春和其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系均没有该特异性扩增；这表明11-MAG1242即为黑麦5R染色体的特异分子标记，可用来对黑麦5R染色体进行快捷、简便的特异跟踪和鉴定。
实施例2：黑麦5R染色体特异分子标记的应用
应用11-MAG1242分子标记对普通小麦“小偃6号”和“德国白”黑麦杂交后代等材料中黑麦5R染色体进行鉴定的方法，待测材料为中国春，帝国黑麦，小偃6号，德国白黑麦，WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），小黑麦06CT456（AABBRR），小黑麦06CT461（AABBRR）；操作步骤如下：
A、分子标记的制备：根据11-MAG1242标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100mmol L-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10mmol L-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L-1 Tris-HCl与1mmol L-1 EDTA，pH=8.0；
C、黑麦染色体的特异标记：
C-1、模板DNA的提取：取待测材料，利用常规DNA提取方法分别提取其DNA，共计12份；
C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中对12份待测样品分别进行扩增；扩增实验的具体操作为，取12支体积为0.2ml的Eppendof管，向其中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，正、反向引物各0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，根据标记引物的退火温度退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；其中11-MAG1242标记引物的退火温度为55℃；最终获取中国春，帝国黑麦，小偃6号，德国白黑麦，WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），洛夫林10（Petkus黑麦的1BL/1RS易位系），洛夫林13（Petkus黑麦的1BL/1RS易位系），小黑麦06CT456（AABBRR），小黑麦06CT461（AABBRR）各自的扩增产物，共计12份；
C-3、扩增产物的检测：在步骤C-2所得的12份扩增产物中分别加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对：参看附图2，图中：M：marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：小偃6号，4：德国白黑麦，5：WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），6：WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），7：WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），8：WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），9：洛夫林10（Petkus黑麦的1BL/1RS易位系），10：洛夫林13（Petkus黑麦的1BL/1RS易位系），11：小黑麦06CT456（AABBRR），12：小黑麦06CT461（AABBRR）；11-MAG1242在含有黑麦5R染色体的材料（2：帝国黑麦，4：德国白黑麦，11：小黑麦06CT456，12：小黑麦06CT461）中均扩增出500bp左右的多态性特异片段，而在其它不携带黑麦5R染色体的材料中均未出现特异扩增片段，与实施例1的结果相一致。
实施例3-黑麦4R染色体特异分子标记的应用
应用6-KSUM62分子标记对黑麦4R染色体进行鉴定的方法，待测材料为中国春，帝国黑麦，小偃6号，德国白黑麦，WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），小黑麦06CT456（AABBRR），小黑麦06CT461（AABBRR）；操作步骤如下：
A、分子标记的制备：根据6-KSUM62标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100mmol L-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10mmol L-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L-1 Tris-HCl与1mmol L-1 EDTA，pH=8.0；
C、黑麦染色体的特异标记：
C-1、模板DNA的提取：取待测材料，利用常规DNA提取方法分别提取其DNA，共计12份；
C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中对12份待测样品分别进行扩增；扩增实验的具体操作为，取12支体积为0.2ml的Eppendof管，向其中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，正、反向引物各0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，根据标记引物的退火温度退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；其中6-KSUM62标记引物的退火温度为62℃；最终获取中国春，帝国黑麦，小偃6号，德国白黑麦，WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），小黑麦06CT456（AABBRR），小黑麦06CT461（AABBRR）各自的扩增产物，共计12份；
C-3、扩增产物的检测：在步骤C-2所得的12份扩增产物中分别加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1.5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对：参看附图3，图中：M：marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1：中国春，2：帝国黑麦，3：小偃6号，4：德国白黑麦，5：WR64（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），6：WR81（小偃6号-德国白1BL/1RS易位系），7：WR91（小偃6号-德国白2R（2D）代换系），8：WR41（小偃6号-德国白4B/4R交互易位系），9：洛夫林10（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），10：洛夫林13（黑麦Petkus的1BL/1RS易位系），11：小黑麦06CT456（AABBRR），12：小黑麦06CT461（AABBRR）；6-KSUM62在含有黑麦4R染色体的材料（2：帝国黑麦，4：德国白黑麦，8：WR41，11：小黑麦06CT456，12：小黑麦06CT461）中均扩增出160bp左右的多态性特异片段，而在其它不携带黑麦4R染色体的材料中均未出现特异扩增片段，这表明6-KSUM62即为黑麦4R染色体的特异分子标记，可用来对黑麦4R染色体进行快捷、简便的特异跟踪和标记。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
序列表
SEQ ID NO 1:
ACGCTGCGGA TGAAGATG 18
SEQ ID NO 2:
GCTGGCAATG CTGAAAGG 18
SEQ ID NO 3:
GAAACCCACC TCCCTTAC 18
SEQ ID NO 4:
AGAGCCTACC ATCCCATC 18
SEQ ID NO 5:
GCCTACCATC CCATCTTC 18
SEQ ID NO 6:
CCTCCCTTAC CCTATCAA 18
SEQ ID NO 7:
CGACGACTAC CTCCTCAAGA A 21
SEQ ID NO 8:
GAACAGGCAA CGACGACAG 19
SEQ ID NO 9:
GCATCTTCTT CCTCTGCTCC TG 22
SEQ ID NO 10:
CGGGCTTCTT GTCCTCGTC 19
SEQ ID NO 11:
GGAGAGGATA GGCACAGGAC 20
SEQ ID NO 12:
GAGAGCAGAG GGAGCTATGG 20
SEQ ID NO 13:
GGATCGAGAG CGAGGACAT 19
SEQ ID NO 14:
CTCCACTCCC GTCAGCTC 18
SEQ ID NO 15:
TGAACATCAA GGGGCTGC 18
SEQ ID NO 16:
ACGACAGACA TAAAGAAGAG CG 22
SEQ ID NO 17:
AGCGTGTCTA ACAAGTGC 18
SEQ ID NO 18:
ATCTACCTAA CCAAACTATC AT 22
SEQ ID NO 19:
GCGGAGCGGA ATGGATAAA 19
SEQ ID NO 20:
CAAGGAAGGA AACGCAGGA 19
SEQ ID NO 21:
GCCACCGACT GTTAGGTTTC ACTC 24
SEQ ID NO 22:
CGAGGGTTCT TGGGAATGAC AC 22
SEQ ID NO 23:
GGAAGGCAAC AACAAAGTG 19
SEQ ID NO 24:
CAGGCTGTGG ACGGAGAT 18
SEQ ID NO 25:
TGCCATCGAC AACTACCAA 19
SEQ ID NO 26:
CGTTTCTCCT CCAATCCAG 19
SEQ ID NO 27:
AAGCATCCTA CATAGCCCTC A 21
SEQ ID NO 28:
GGAGACCACT CGGCAGAAA 19
SEQ ID NO 29:
CTTATCGCTG TTCATCGTCG 20
SEQ ID NO 30:
GGAAGGGAAA GTACAACTCG C 21
SEQ ID NO 31:
CACACCACCA CTGTCCTCC 19
SEQ ID NO 32:
GAACTCGTGC ATCCCGTC 18
SEQ ID NO 33:
GCCTCCAGTT AAACCTTCCC 20
SEQ ID NO 34:
TGATGGCTTG CTTTCAGAGG 20
Claims (4)
1.应用基于小麦EST序列的黑麦染色体特异分子标记引物对黑麦5R染色体进行鉴定的方法，其特征步骤包括：
A、分子标记的选定和制备：合成标记引物“11-MAG1242”，其正向引物序列见SEQ ID NO：21，其反向引物序列见SEQ ID NO：22；
B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100mmol L-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10mmol L-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L-1 Tris-HCl与1mmol L-1 EDTA，pH=8.0；
C、黑麦染色体的特异标记：
C-1、模板DNA的提取：取待测物——小麦与黑麦的远缘杂交后代材料，对照物0——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物1——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA；
C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物0及对照物1进行扩增；
C-3、扩增产物的检测：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得的扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对：将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物0、对照物1的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物1的电泳图谱均有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物0的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体；
其中，步骤C-4中所述的“特异扩增片段”为500bp左右的多态性特异片段。
2.根据权力要求1所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于：步骤C-2中对所述待测物、对照物0及对照物1的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为0.2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，正、反向引物各0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
3.根据权力要求2所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于：所述扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存。
4.根据权力要求1所述的对黑麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于：步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1～2h。
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| 小麦EST-SSR标记的开发、定位和作图;陈海梅;《山东农业大学硕士学位论文》;20051231;附表1-2、第18-22页第2节 * |
| 小麦产量相关形状的分子遗传分析及抗赤霉病侵染QTL的分子标记开发;赵冬梅;《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》;20071215;全文 * |
| 赵冬梅.小麦产量相关形状的分子遗传分析及抗赤霉病侵染QTL的分子标记开发.《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》.2007,全文. |
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