CN103045560A - 获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性β-1,3-1,4-葡聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的β-1，3-1，4-葡聚糖酶。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)将序列1自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；(b)将序列1所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个：(I)将序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G；(II)将序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G；(III)将序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。本发明为β-葡聚糖酶的蛋白质工程改造提供了重要方法，也为酸性β-葡聚糖酶的工业应用提供了重要基因资源。

Description

获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性β-1,3-1,4-葡聚糖酶

技术领域

本发明涉及一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性β-1，3-1，4-葡聚糖酶。 

背景技术

β-葡聚糖是由葡萄糖通过β-糖苷键聚合在一起形成的高分子聚合多糖，是自然界中含量最丰富的聚糖。β-1，3-1，4-葡聚糖是自然合成的多聚糖，与阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纤维素、果胶等均属高等植物(尤其是禾本植物)细胞壁中的结构性非淀粉多糖。从结构上看，它主要由葡萄糖残基通过β-1，3和(或)β-1，4糖苷键连接而成。β-1，3-1，4-葡聚糖是由葡萄糖以β构型通过β-1，3-和β-1，4-混合键形成的直链聚糖。β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶类的总称。包括内切和外切β-1，3葡聚糖酶(EC 3.2.1.39；EC 3.2.1.58)、β-1，3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)、内切和外切β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4；EC 3.2.1.74)(Boyce et al.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，76：835-841；McCarthy et al.international journal of biological macromolecules，2003，33：141-148)。 

工业用β-葡聚糖酶主要来源于微生物。迄今，报道的微生物β-1，3-1，4-葡聚糖酶大多属于糖苷水解酶16家族，包括细菌、真菌和瘤胃微生物，微生物产生的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在酿造业和饲料工业中具有十分重要的应用价值。其中，耐热β-葡聚糖酶在工业应用中具有更高的价值。β-葡聚糖酶应用于啤酒工业中，可降低麦汁黏度，改善过滤性能，提高过滤速度，改善麦汁清亮度；提高糖化生产能力，促进可发酵性产物的提高；提高啤酒的胶体稳定性，清除因β-葡聚糖引起的冷浑浊；提高滤酒效率，增加批次滤酒量，纯生啤酒生产中可大幅度地提高膜的使用效率，延长膜的使用寿命等。在啤酒工业应用中，β-葡聚糖酶需在酸性条件下(pH 4.5-5.0)作用。另外，由于动物的胃内环境呈酸性，胃内容物到达十二指肠仍显略酸性。因此，对耐热β-1，3-1，4-葡聚糖酶进行定向进化，开发酸性条件下稳定和高效的耐热β-1，3-1，4-葡聚糖酶对于其在食品、饲料及能源工业中应用具有重要意义。 

定向进化应用最广泛的两种技术是易错PCR(error prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)。其中易错PCR技术是在体外扩增目的基因时以一定的频率在基因内部引入点突变，由于突变只发生在单一分子内部，属于无性进化。与易错PCR不同，DNA改组技术是利用重叠延伸PCR技术，将已获得的存在于不同基因中的多突变信息随机重组到同一个DNA分子，形成新的基因随机突变库，属于有性进化。 

发明内容

本发明的目的是提供一种获得定向突变基因的方法和基于其发现的酸性β-1，3-1，4-葡聚糖酶。 

本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)： 

(a)将序列表中序列1自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质； 

(b)将序列表中序列1所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质； 

所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个： 

(I)将序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G； 

(II)将序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G； 

(III)将序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。 

所述蛋白质具体可为如下(1)至(8)中任一所述的蛋白质： 

(1)序列表中序列3自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质； 

(2)序列表中序列3所示的蛋白质； 

(3)序列表中序列5自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质； 

(4)序列表中序列5所示的蛋白质； 

(5)序列表中序列9自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质； 

(6)序列表中序列9所示的蛋白质； 

(7)序列表中序列7自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质； 

(8)序列表中序列7所示的蛋白质。 

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。 

所述基因具体可为如下①至⑧中任一所述的DNA分子： 

①序列表的序列4自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子； 

②序列表中序列4所示的DNA分子； 

③序列表的序列6自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子； 

④序列表中序列6所示的DNA分子； 

⑤序列表的序列10自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子； 

⑥序列表中序列10所示的DNA分子； 

⑦序列表的序列8自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子； 

⑧序列表中序列8所示的DNA分子。 

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。 

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因 表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。 

所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pET-26b(+)载体得到的重组质粒。 

所述重组菌具体可为将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。 

本发明还保护一种制备所述蛋白的方法，是发酵培养所述重组菌，得到所述蛋白。所述发酵培养的条件具体可为：①将菌株接种至液体LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)振荡培养(37℃，200rpm)至OD₆₀₀为0.6；②在步骤①的菌液加入IPTG(使其终浓度为1.0mM)，30℃振荡培养(200rpm)4h，得到发酵液。 

本发明还保护所述蛋白作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的应用。所述应用中，所采用的反应温度可为40-70℃，优选为50-60℃。所述应用中，所采用的反应pH可为4.0-9.5，优选为4.5-7.5，最优选为5.0、5.5或6.0。所述应用具体可为，采用所述蛋白降解大麦葡聚糖，获得葡萄糖。 

本发明还保护一种获得定向突变基因的方法，包括如下步骤： 

(1)以野生型蛋白的编码基因为模板，进行易错PCR，得到PCR产物； 

(2)将步骤(1)的PCR产物进行随机片段化，得到约50bp的DNA片段； 

(3)将步骤(2)的DNA片段进行拼接重组，得到突变DNA库； 

(4)将步骤(3)的突变DNA库构建到pET-26b(+)载体上并转化大肠杆菌BL21(DE3)； 

(5)将步骤(4)得到的重组子进行定向筛选，得到正向重组子； 

(6)将步骤(5)得到的正向重组子进行测序，根据测序结果获得定向突变基因。 

所述步骤(1)中：所述野生型蛋白的编码基因如序列表的序列2所示；所述易错PCR所用的引物为PtgluF和PtgluR组成的引物对；50μL所述易错PCR体系为：7mMMg²⁺，0.2mM Mn²⁺，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，1mM dCTP，1mM dTTP，0.2μM PtgluF，0.2μM PtgluR，2.5U Taq DNA polymerase，模板20ng；所述易错PCR的反应条件为：95℃5min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，30个循环；72℃8min。 

所述步骤(2)中：所述随机片段化为用DNase I对所述PCR产物进行酶切处理；100μL所述酶切体系为：8mM Mg²⁺，0.67mM Mn²⁺，8μg PCR产物，0.0252U DNase I；所述酶切的反应条件为20℃反应15min。 

所述步骤(3)中，所述拼接重组包括重叠延伸和拼接PCR两个步骤；50μL所述重叠延伸体系为：0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，2μg步骤(2)的DNA片段，1U PfuDNA聚合酶；所述重叠延伸的反应条件为：95℃5min；95℃30s、50℃30s、72℃第一个循环为2min且每个循环比前一个循环增加5s，30个循环；72℃8min；所述拼接PCR体系为：0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，0.2μM PtgluF，0.2μM PtgluR，1μL重叠延伸产物，1U Pfu DNA聚合酶；所述拼接PCR的反应条件为：95℃5min；95℃30s、55℃30s、72℃2min，30个循环；72℃8min。 

所述步骤(5)中：所述定向筛选包括初筛和复筛两个步骤；所述初筛为：在筛选平板上培养所述重组子，然后进行刚果红染色，用1M NaCl水溶液洗涤后选择显示透明圈的重组子进行复筛；所述复筛为：将初筛得到的重组子的发酵液和含有所述野生型蛋白的编码基因的平行对照菌的发酵液分别进行β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶学性质鉴定，如果两者有差异，说明所述重组子为正向重组子。 

所述PtgluF如序列表的序列11所示。所述PtgluR如序列表的序列12所示。 

本发明提供的基因定向进化方法，采用易错PCR(error prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)相结合的方法，对来源于嗜热拟青霉(Paecilomyces theromophila)J18的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(PtLic16A，Genbank GU451059)进行了体外分子随机突变和重组，利用β-葡聚糖酶降解大麦葡聚糖使刚果红染色平板出现透明圈的原理，建立了阳性克隆的高通量筛选体系，最终筛选得到的突变体PtLic16AM的反应最适pH由7.0降至5.0，且保持了原有的耐热性和比酶活。测序分析发现PtLic16AM的编码序列中有4个位点发生突变，引发了3处氨基酸替换，即D74G，D239G，C281S。本发明为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的蛋白质工程改造提供了重要方法，也为酸性β-1，3-1，4-葡聚糖酶的工业应用提供了重要基因资源。本发明得到的酸性β-1，3-1，4-葡聚糖酶在保持其它酶学性质基本不变的基础上，其最适pH由原来的7.0变为5.0，且稳定性向酸性偏移，在pH 4.0-9.5范围内稳定。该发明为酶的定向进化提供了重要的参考，为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的工业应用提供了重要材料。 

附图说明

图1为重组菌甲得到的粗酶液和蛋白液的SDS-PAGE电泳图；1：粗酶液；2：蛋白液。 

图2为蛋白液甲和对照蛋白液在不同反应温度下的相对酶活；“○”代表对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)；“●”代表蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)。 

图3为蛋白液甲和对照蛋白液的温度稳定性；“○”代表对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)；“●”代表蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)。 

图4为蛋白液甲和对照蛋白液在不同反应pH下的相对酶活；“○”代表对照蛋白液(PtLi c16A蛋白液)；“●”代表蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)。 

图5为蛋白液甲和对照蛋白液在不同反应pH下的pH稳定性；“○”代表对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)；“●”代表蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料如分子试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原材料均可从商业途径获得；如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 

嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18：中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为CGMCC 6885，中国农业大学；参考文献：江正强等.嗜热拟青霉木糖苷酶的性质及其与木聚糖酶的协同作用，食品与发酵工业，2008，34(07)：12-16。嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)J18简称嗜热拟青霉J18。 

大麦β-葡聚糖、葡萄糖购自Sigma公司。pET-26b(+)载体：购自Novagen公司，产品编号：69862。大肠杆菌BL21(DE3)：购自Novagen公司，产品编号：69450。 

酶活测定方法(DNS法)： 

(1)以大麦葡聚糖(barley β-glucan)为底物，用50mM MES缓冲液配制成底物浓度为1％(g/100mL)的底物溶液； 

(2)在小试管中加入50μL底物溶液，再加入100μL 50mM MES缓冲液；70℃预热3min，加入50μL待测溶液(或其稀释液)，反应10min，加入200μL DNS试剂(将1g 3，5-二硝基水杨酸、1g NaOH、0.2g苯酚溶于蒸馏水并定容至100mL，即为贮存液；使用前在贮存液中加入无水亚硫酸钠，使其浓度为0.05g/100mL)终止反应；煮沸15min后加入200μL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后在540nm波长下测定吸光度值。以葡萄糖作为标准品制作标准曲线。酶活力的单位定义为：将每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活性单位(U)。根据利用葡萄糖制作的标准曲线，利用540nm吸光度值计算待测溶液的酶活力的公式如下：酶活(U/mL)＝(1.6514×OD₅₄₀+0.0104)×n，n＝稀释倍数。 

实施例1、β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的定向进化 

一、β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(PtLic16A)的随机突变 

1、易错PCR 

对嗜热拟青霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(GENBANK ACCESSION NO.GU451059；野生型基因，将其命名为PtLic16A基因，将其编码的蛋白命名为PtLic16A蛋白，PtLic16A蛋白如序列表的序列1所示，PtLic16A基因如序列表的序列2所示)进行序列分析，发现该基因5’端包含编码18个氨基酸残基组成的信号肽的序列。根据嗜热拟青霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的成熟蛋白编码区(即去掉信号肽编码序列)设计易错PCR引物PtgluF和PtgluR。 

PtgluF(序列11)：5’-TCGATGTCATGATGTATCATCTTGTTGACGACTACGGCCGG-3’；PtgluR(序列12)：5’-CCGCTCGAGGGGTGCGTACACGCGGAGCGAG-3’。 

以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行易错PCR扩增，得到PCR扩增产物(PtLic16A-m)。 

易错PCR体系(50μL)：7mM Mg²⁺，0.2mM Mn²⁺，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，1mM dCTP，1mM dTTP，0.2μM PtgluF，0.2μM PtgluR，2.5U Taq DNA polymerase，20ng cDNA。 

易错PCR反应条件：95℃5min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，30个循环；72℃8min。 

2、DNA的片段化 

用DNase I对步骤1的PCR扩增产物进行酶切处理。 

酶切体系(100μL)：8mM Mg²⁺，0.67mM Mn²⁺，8μg PCR扩增产物，0.0252U DNaseI。 

酶切条件：20℃反应15min，然后加入2.5mM EDTA终止反应，最后80℃保温10min以灭活DNase I。 

回收纯化40-60bp左右的DNA片段(PtLic16A-m/DNase I)。 

3、获得随机突变体库 

(1)重叠延伸PCR 

将步骤2的DNA片段作为模板，进行重叠延伸PCR，得到重叠延伸PCR扩增产物。 

重叠延伸PCR体系(50μL)：0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，8μL(约2μg)模板，1U Pfu DNA聚合酶。 

重叠延伸PCR条件：95℃5min；95℃30s、45℃30s、72℃第一个循环为1min(每个循环比前一个循环增加5s)，30个循环；72℃8min。 

(2)全长PCR 

将步骤(1)的重叠延伸PCR扩增产物为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行全长PCR，得到PCR扩增产物(随机突变体库)。 

全长PCR体系(50μL)：0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，0.2μM PtgluF，0.2μMPtgluR，1μL(50-100ng)模板，1U Pfu DNA聚合酶。 

全长PCR条件：95℃5min；95℃30s、55℃30s、72℃2min，30个循环；72℃8min。 

4、获得突变体表达文库 

(1)用限制性内切酶BspH I和Xho I双酶切步骤3的随机突变体库，回收酶切产物。 

(2)用限制性内切酶NcoI和Xho I双酶切pET-26b(+)载体，回收载体骨架(约5230bp)。 

(3)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，利用电转化法将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，收集所有的转化子，即为突变体表达文库。随机挑选10个转化子进行测序分析，突变率约为0.8％。 

二、突变体表达文库定向筛选 

1、将步骤一的突变体表达文库适当稀释后均匀涂布于的LB平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃培养24h。 

2、收集步骤1的平板上的菌落，编号，并转移至筛选平板(含有质量百分含量为0.5％大麦葡聚糖、1mM IPTG和50μg/mL卡纳霉素的LB平板)，37℃培养1天；原平板继续37℃培养，以便以后挑取突变体菌株。 

3、将步骤2中的筛选平板60℃放置1h，使细胞裂解，然后用0.1％(质量百分含量)的刚果红水溶液染色15min，用1M NaCl水溶液洗去刚果红；通过透明圈的位置及平板上的相应编号从原平板上挑取相应菌株，进行步骤4的复筛。 

4、将步骤3得到的菌株进行酶学性质鉴定，具体方法如下： 

将采用相同培养时间和培养条件的的各个菌株的发酵液8,000g冷冻离心10min，菌体利用50mM MES缓冲液重悬，超声波破碎后离心取上清液(粗酶液)。分别采用不同pH的50mM MES缓冲液稀释粗酶液，并采用与其相同的缓冲液作为酶活测定中的缓冲液。将粗酶液的稀释液进行酶活测定。酶活测定的反应温度为70℃。 

在pH小于7的条件下，如果突变菌株的粗酶液的酶活高于对照菌(将序列表的序列2自5’末端第55位至942位核苷酸所示DNA分子插入pET-26b(+)载体，得到重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到对照菌)的粗酶液，该菌株即为正突变子。经复筛，得到1个正突变子。 

5、将正突变子提取质粒进行测序，与PtLic16A基因相比，pET-26b(+)载体的NcoI和Xho I酶切位点之间的DNA片段发生了4个单核苷酸突变，分别为A→G(序列表的序列2自5’末端第221位核苷酸)、C→T(序列表的序列2自5’末端第291位核苷酸)、A→G (序列表的序列2自5’末端第716位核苷酸)、T→A(序列表的序列2自5’末端第841位核苷酸)，即序列表的序列2所示的PtLic16A基因突变为了序列表的序列4所示的DNA，将序列表的序列4所示的DNA命名为PtLic16AM基因；以上单核苷酸突变引起了序列表的序列1所示蛋白质的三个氨基酸残基发生突变，分别为D→G(序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基)、D→G(序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基)、C→S(序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基)，即序列表的序列1所示的PtLic16A蛋白突变为序列表的序列3所示的蛋白，将序列表的序列3所示的蛋白命名为PtLic16AM蛋白(自N末端第1至18为氨基酸残基组成信号肽)。该正突变子即将重组质粒甲(骨架载体为pET-26b(+)载体，在骨架载体的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA片段甲)转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌甲。 

实施例2、重组蛋白的制备及其酶学性质检测 

一、重组质粒和重组菌的构建 

1、重组质粒乙的构建 

D74G-F：5’-ACATGGGTGTCGGCTTCACCAATCC-3’； 

D74G-R：5’-GGGATTGGTGAAGCCGACACCCATG-3’。 

(1)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用PtgluF和D74G-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(2)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用D74G-F和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(3)将步骤(1)的PCR扩增产物和步骤(2)的PCR扩增产物混合作为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(4)用限制性内切酶BspHI和XhoI双酶切步骤(3)的PCR扩增产物，回收酶切产物。 

(5)用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-26b(+)载体，回收载体骨架(约5230bp)。 

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：骨架载体为pET-26b(+)载体，在骨架载体的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列6自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA片段乙。 

2、重组质粒丙的构建 

D239G-F：5’-GCGAACTGGGGCACGCCCGCTG-3’； 

D239G-R：5’-GCGGGCGTGCCCCAGTTCGCCG-3’。 

(1)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用PtgluF和D239G-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(2)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用D239G-F和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(3)将步骤(1)的PCR扩增产物和步骤(2)的PCR扩增产物混合作为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(4)用限制性内切酶BspHI和XhoI双酶切步骤(3)的PCR扩增产物，回收酶切产物。 

(5)用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-26b(+)载体，回收载体骨架(约5230bp)。 

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒丙。根据测序结果，对重组质粒丙进行结构描述如下：骨架载体为pET-26b(+)载体，在骨架载体的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列8自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA片段丙。 

3、重组质粒丁的构建 

C281S-F：5’-CATTGGTGGCAGCGCCAGCCGT-3’； 

C281S-R：5’-ACGGCTGGCGCTGCCACCAATG-3’。 

(1)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用PtgluF和C281S-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(2)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用C281S-F和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(3)将步骤(1)的PCR扩增产物和步骤(2)的PCR扩增产物混合作为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(4)用限制性内切酶BspH I和XhoI双酶切步骤(3)的PCR扩增产物，回收酶切产物。 

(5)用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-26b(+)载体，回收载体骨架(约5230bp)。 

(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒丁。根据测序结果，对重组质粒丁进行结构描述如下：骨架载体为pET-26b(+)载体，在骨架载体的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列10自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA片段丁。 

4、对照质粒的构建 

(1)以嗜热拟青霉J18的cDNA为模板，用PtgluF和PtgluR组成的引物对进行 易错PCR扩增，得到PCR扩增产物。 

(2)用限制性内切酶BspHI和XhoI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。 

(3)用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-26b(+)载体，回收载体骨架(约5230bp)。 

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到对照质粒。根据测序结果，对对照质粒进行结构描述如下：骨架载体为pET-26b(+)载体，在骨架载体的NcoI和Xho I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA片段。 

5、重组菌的构建 

将重组质粒乙转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。 

将重组质粒丙转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌丙。 

将重组质粒丁转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌丁。 

将对照质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到对照菌。 

二、重组蛋白的制备 

将重组菌甲、重组菌乙、重组菌丙、重组菌丁或对照菌分别进行蛋白的诱导表达和纯化，具体步骤如下： 

(1)菌株的发酵 

①将菌株接种至液体LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)振荡培养(37℃，200rpm)至OD₆₀₀为0.6。 

②在步骤①的菌液加入IPTG(使其终浓度为1.0mM)，30℃振荡培养(200rpm)4h，得到发酵液。 

(2)蛋白的提取 

①粗酶液的获得 

将步骤(1)得到的发酵液8,000g离心10min，收集菌体，按1∶100(体积比)重悬于平衡缓冲液(50mM pH8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑)，然后在冰水浴进行超声波破碎(超声功率为200W，共进行90次超声破碎，每次3s，每次超声处理后停止4s)，8000×g离心10min，收集上清即为粗酶液。 

②蛋白纯化 

将粗酶液上样于Ni-IDA柱(Ni-IDA Resin，1×5cm)进行纯化；纯化过程为(流速为1mL/min)：先用平衡缓冲液洗脱10个柱体积(5-10个柱体积均可)，然后用洗脱液甲(50mM pH 8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，50mM咪唑)洗脱10个柱体积(5-10个柱体积均可)，最后用洗脱液乙(50mM pH 8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，100mM 咪唑)洗脱至OD₂₈₀小于0.1，收集洗脱液乙过柱后的溶液，即为蛋白液。 

重组菌甲得到的蛋白液为蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)，重组菌乙得到的蛋白液为蛋白液乙(PtLic 16A-D74G蛋白液)，重组菌丙得到的蛋白液为蛋白液丙(PtLic16A-D239G蛋白液)，重组菌丁得到的蛋白液为蛋白液丁(PtLic16A-C281S蛋白液)，对照菌得到的蛋白液为对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)。 

重组菌甲得到的粗酶液和蛋白液的SDS-PAGE电泳图见图1。 

三、重组蛋白的酶学性质 

1、最适反应温度 

将蛋白液甲(或对照蛋白液)用50mM pH 7.0MES缓冲液进行适当稀释后进行酶活测定(采用50mM pH 7.0MES缓冲液作为酶活测定中的缓冲液)。酶活测定分别采用如下几种反应温度：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃。 

蛋白液甲和对照蛋白液的最适反应温度均为70℃。分别将两种蛋白液在最适反应温度下的酶活作为100％，计算各自在其它反应温度下的相对酶活，见图2。结果表明，蛋白液甲和对照蛋白液的酶活随反应温度变化的趋势一致且在各个反应温度下的酶活没有显著差异。 

2、温度稳定性 

将蛋白液甲(或对照蛋白液)用50mM pH 7.0MES缓冲液进行适当稀释，进行预处理(在不同温度下孵育30min，然后置于冰水浴中冷却30min)后进行酶活测定(采用50mM pH 7.0MES缓冲液作为酶活测定中的缓冲液)，以未经预处理蛋白液的酶活力为对照，计算各种预处理后的残余酶活力占对照酶活力的相对酶活。酶活测定采用70℃的反应温度。 

将未经预处理的蛋白液甲(或对照蛋白液)的酶活作为100％，计算经过不同温度预处理后蛋白液甲(或对照蛋白液)的相对酶活，见图3。结果表明，蛋白液甲和对照蛋白液的温度稳定性一致，且采用各个温度预处理后的酶活没有显著差异。 

3、最适pH测定 

将蛋白液甲(或对照蛋白液)用不同缓冲液进行适当稀释后进行酶活测定。分别采用不同缓冲液稀释蛋白液，并采用与其相同的缓冲液作为酶活测定中的缓冲液。酶活测定采用70℃的反应温度。 

分别采用以下几种缓冲液：Citrate，pH 3.0-6.0；MES，pH 5.0-7.0，Phosphate，pH 6.0-7.5；Tris-HCl，pH 7.5-9.0；CHES，pH 8.5-10。 

在不同缓冲液存在重叠pH的情况下，选择酶活较高的结果作为该pH下的结果。 

蛋白液甲的最适反应pH为5。将蛋白液甲pH 5条件下的酶活作为100％计算其它 反应pH下的相对酶活，见图4。 

对照蛋白液的最适反应pH为7。将对照蛋白液pH 7条件下的酶活作为100％计算其它反应pH下的相对酶活，见图4。 

4、pH稳定性 

将蛋白液甲(或对照蛋白液)用不同缓冲液进行适当稀释，进行预处理(50℃水浴30min，然后置于冰水浴中冷却30min)后进行酶活测定(采用50mM pH 7.0MES缓冲液作为酶活测定中的缓冲液)。酶活测定时采用70℃的反应温度。 

分别采用以下几种缓冲液：Citrate，pH 3.0-6.0；MES，pH 5.0-7.0，Phosphate，pH 6.0-7.5；Tris-HCl，pH 7.5-9.0；CHES，pH 8.5-10。在不同缓冲液存在重叠pH的情况下，选择酶活较高的结果作为该pH预处理下的结果。 

将采用50mM pH 7.0MES缓冲液进行稀释且没有进行预处理的蛋白液甲(或对照蛋白液)的酶活作为100％，计算经过不同pH下预处理后蛋白液甲(或对照蛋白液)的相对酶活，见图5。结果表明，蛋白液甲和对照蛋白液的pH稳定性一致，且采用各个pH预处理后的酶活没有显著差异(pH 4.0-9.5下稳定)。 

四、重组蛋白的比活力 

1、酶活测定 

分别将蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)、蛋白液乙(PtLic16A-D74G蛋白液)、蛋白液丙(PtLic16A-D239G蛋白液)、蛋白液丁(PtLic16A-C281S蛋白液)和对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)用缓冲液进行适当稀释后进行酶活测定。分别采用不同缓冲液稀释蛋白液，并采用与其相同的缓冲液作为酶活测定中的缓冲液。酶活测定采用70℃的反应温度。 

分别采用如下缓冲液：50mM pH 7.0MES缓冲液、50mM pH 5.0citrate缓冲液、50mM pH 5.5citrate缓冲液、50mM pH 6.0citrate缓冲液。 

2、蛋白浓度测定 

采用Lowry等(Lowry et al.The Journal of Biological Chemistry，1951，193：265-275)的方法检测蛋白液甲(PtLic16AM蛋白液)、蛋白液乙(PtLic16A-D74G蛋白液)、蛋白液丙(PtLic16A-D239G蛋白液)、蛋白液丁(PtLic16A-C281S蛋白液)和对照蛋白液(PtLic16A蛋白液)的蛋白浓度；以牛血清白蛋白作为标准品制作标准曲线。 

3、比活力测定 

蛋白的比活力(U/mg)＝蛋白液的酶活测定结果(U/mL)÷蛋白液的浓度测定结果(mg/mL)。 

各个蛋白液的比活力(U/mg)见表1。 

表1各个蛋白液的比活力(U/mg)、最适pH及pH稳定性 

通过定点突变发现，其中2个定点突变对于提高PtLic16A酸性催化能力产生了一定作用，主要表现在最适pH的降低。3个点突变基因编码的重组酶的比酶活、最适温度和温度稳定性均没有发生明显变化。3个突变对于提高PtLic16A酸性催化能力起到的作用程度不同，D74G和C281S的突变起到了主要作用，而D239G单点突变对于其性质没有影响，因此PtLic16AM在pH方面性质的改变可能是D74G和C281S共同作用的结果。 

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)将序列表中序列1自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的蛋白质进行定点突变得到的蛋白质；

所述(a)或(b)中，所述定点突变为如下三个突变中的至少一个：

(I)将序列表的序列1自N末端第74位氨基酸残基由D突变为G；

(II)将序列表的序列1自N末端第239位氨基酸残基由D突变为G；

(III)将序列表的序列1自N末端第281位氨基酸残基由C突变为S。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(1)至(8)中任一所述的蛋白质：

(1)序列表中序列3自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；

(2)序列表中序列3所示的蛋白质；

(3)序列表中序列5自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；

(4)序列表中序列5所示的蛋白质；

(5)序列表中序列9自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；

(6)序列表中序列9所示的蛋白质；

(7)序列表中序列7自N末端第19至314位氨基酸残基组成的蛋白质；

(8)序列表中序列7所示的蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述蛋白的基因。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是如下①至⑧中任一所述的DNA分子：

①序列表的序列4自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；

②序列表中序列4所示的DNA分子；

③序列表的序列6自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；

④序列表中序列6所示的DNA分子；

⑤序列表的序列10自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；

⑥序列表中序列10所示的DNA分子；

⑦序列表的序列8自5’末端第55至942位核苷酸所示的DNA分子；

⑧序列表中序列8所示的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求3或4所述基因插入pET-26b(+)载体得到的重组质粒。

7.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求6所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。

8.一种制备权利要求1或2所述蛋白的方法，是发酵培养权利要求5或7所述重组菌，得到所述蛋白。

9.权利要求1或2所述蛋白作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的应用。

10.一种获得定向突变基因的方法，包括如下步骤：

(1)以野生型蛋白的编码基因为模板，进行易错PCR，得到PCR产物；

(2)将步骤(1)的PCR产物进行随机片段化，得到约50bp的DNA片段；

(3)将步骤(2)的DNA片段进行拼接重组，得到突变DNA库；

(4)将步骤(3)的突变DNA库构建到pET-26b(+)载体上并转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(5)将步骤(4)得到的重组子进行定向筛选，得到正向重组子；

(6)将步骤(5)得到的正向重组子进行测序，根据测序结果获得定向突变基因。

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