CN103041406A

CN103041406A - 模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法

Info

Publication number: CN103041406A
Application number: CN2013100162247A
Authority: CN
Inventors: 张晓宏; 李亚楠; 欧雪梅
Original assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2033-01-16
Also published as: CN103041406B

Abstract

本发明涉及一种模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，包括如下步骤：制备AAO模板，制备诊疗协同纳米颗粒，去除模板，纯化纳米颗粒，合成表面活性剂，制备诊疗协同纳米颗粒释放体系。本发明实现了一种或多种造影剂和药物同时且定量成比例的进入同一剂型并精确控制制备具有最佳治疗效果的诊疗协同体系的目的，是一种操作简单、成本低、产率高、纳米药物组分和比例可调、形貌可控、尺寸小、粒径分布窄、对环境无污染的纳米诊疗协同体系制备方法，为新一代高载药量的诊疗协同制剂的研制及应用提供物质基础与技术保障，可用于癌症诊断和治疗领域，具有广泛的应用前景。

Description

模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法

技术领域

本发明涉及一种诊疗协同释放体系的制备方法，具体涉及一种模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法。

背景技术

癌症是严重危害人类健康和生命的疑难疾患，居疾病死亡率之首，其早期诊断和后期治疗都至为重要。在早期诊断方面，癌症成像学检测法可以对小体积肿瘤的位置、范围、形态进行精确的定位和判断，以确定原发部位癌灶及有无转移。在后期治疗方面，化学疗法占较大比例，近40年来发展很快，疗效不断提高。但目前的抗癌药物和成像造影剂大多存在水溶性差、对肿瘤组织的选择性差、疗效低、毒性大、使用单一造影剂容易产生错误的诊断结果、使用单一药物治疗易产生多药耐药性等缺点，限制了临床应用，并难以实现剂型的多样化。增加疏水药物和造影剂的水溶性、提高造影成像效果、克服耐药性具有十分重要的现实意义和研究价值，是医药化学领域亟待解决的问题。为了增加癌症诊断和治疗效果并减小毒副作用，全球许多科学家都竞相研发最新型的纳米药物载体材料和技术，致力于把疏水性药物或造影剂通过某些载体包裹以对其进行增溶。

近年来，随着生物技术的不断发展，各种新型的药物载体层出不穷，其制备工艺逐步完善，作用机制进一步阐明、剂型逐步改善、毒性和免疫原性大幅降低，特别是大量实验数据证明大多数的药物载体可以提高药物治疗指数和造影剂的成像效果、降低药物毒性、减小药物副作用、减小剂量。

尽管药物载体发展迅速，且具备了许多优点和特点，其临床应用并不像预期的那样广泛，主要原因在于载体的引入极大的降低了载药量、载体的存在给机体增加了额外的代谢负担、载体的合成成本高且耗时，更重要的是，具有协同诊断治疗效果的一种或多种造影剂和药物很难同时且定量成比例的进入同一剂型，使得具有最佳治疗效果的纳米诊疗体系无法精确的控制制备。另外，载体基药物在体液环境中的分布和稳定性也面临着极大的挑战。随着癌症诊断和治疗业的发展，制备高载药量、尺寸均一且比例可控的多组分诊疗协同体系成为必要。

发明内容

本发明提供了一种制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，以达到使一种或多种造影剂和药物同时且定量成比例的进入同一剂型并精确控制制备具有最佳治疗效果的诊疗协同纳米颗粒释放体系的目的。

为了实现上述目的，本发明采用的技术手段如下：

模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，包括如下步骤：

1）制备AAO模板；

2）制备诊疗协同纳米颗粒：对AAO模板进行表面改性处理；选择具有协同效应的疏水药物和成像造影剂，在有机溶剂中配制成浓度为1毫摩尔/升至饱和的诊疗协同溶液，将表面改性处理后的AAO模板浸泡在诊疗协同溶液中≥5分钟，取出硬模板晾干，重复浸泡和晾干步骤≥10次；

3）去除模板：用0.1-10mol/L的NaOH溶液、5wt%~50wt%的H₃PO₄溶液或磷酸+铬酸混合酸溶解去除模板；

4）纯化纳米颗粒：用水稀释并离心分离去除模板后的溶液，弃掉上层清液，得到单分散疏水诊疗协同纳米颗粒；

5)合成表面活性剂：以末端为氨基的聚乙二醇（以后简称：PEG）为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐（以下简称PMHC18）作为疏水端，通过NH₂和COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18的两亲性表面活性剂；

6)制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：将步骤4）所制备的诊疗协同纳米颗粒溶于水中，制得诊疗协同纳米颗粒水溶液；将步骤5）合成的表面活性剂溶于水中，制得表面活性剂水溶液；将诊疗协同纳米颗粒水溶液与表面活性剂水溶液混合，超声、震荡或机械搅拌使得两者通过疏水相互作用、静电作用和/或范德华力作用实现表面活性剂对诊疗协同纳米颗粒的稳定包裹，即纳米颗粒的功能化，制得诊疗协同纳米颗粒释放体系。

优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000-20000。

优选地，步骤1）中，制备AAO模板的条件如下：取纯度≥99.999%的铝片并对其进行预处理，电解液为3wt%-20wt%的硫酸、磷酸或草酸溶液；加入适量乙醇调控模板的制备过程；氧化电压20-200V，氧化温度0-32℃，氧化时间为0.5-12小时。

优选地，上述预处理包括退火、去油渍、清洗和抛光步骤。

优选地，步骤2）中，疏水药物为一种或两种以上，成像造影剂为一种或两种以上。

优选地，步骤2）中，所述有机溶剂选自下列物质中的一种或几种：乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。

优选地，步骤2）中，所述AAO表面改性是指将AAO置于下列物质中的一种或多种中进行超声处理8-12分钟：水、乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中；且表面改性最后选择的溶剂与诊疗协同溶液中的有机溶剂相同。

优选地，步骤4）中，所述离心转速为4000-24800转/分钟。

优选地，步骤6）中，所述诊疗协同纳米颗粒水溶液的浓度为10umol/L-1000umol/L；

优选地，步骤6）中，所述表面活性剂水溶液的浓度为0.1mg/mL-100mg/mL；

优选地，步骤6）中，所述诊疗协同纳米颗粒水溶液与表面活性剂水溶液的体积比为1:10-10:1。

本发明的有益效果是：

1）实验条件温和，操作简单，不需要使用大量的毒性溶剂和添加剂，不需要复杂的合成和制备过程；

2）制备时间短，效率高；

3）组分、形貌和尺寸均匀可调且易于控制（其中纳米颗粒的粒径为10-200nm，纳米棒和纳米管的直径10-200nm，长度500nm-100μm），适合产业化生产；

4）载药量高（大于90%）；

5）该方法应用面广，适用于各种疏水药物和成像造影剂；

6）使一种或多种造影剂和药物同时且定量成比例的进入同一剂型；

7）能够精确控制具有最佳治疗效果的诊疗协同释放体系的制备过程。

综上所述，本发明使一种或多种造影剂和药物同时且定量成比例的进入同一剂型并精确控制制备具有最佳治疗效果的诊疗协同释放体系，操作简单、成本低、产率高、体系组分和比例可调、形貌可控、尺寸小、粒径分布窄、对环境无污染的纳米诊疗协同体系制备方法，为新一代高载药量诊疗制剂的研制及应用研究提供物质基础与技术保障，可用于癌症诊断和治疗领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

本发明所包含的附图用于提供对本发明的进一步理解。

在附图中：

图1：空白AAO模板的扫描电子显微镜（SEM）图片（a.正面图，b.侧面图）；

图2：AAO模板法制备的吉非替尼（GET）和4-(二氰乙烯基)-2-叔丁基-6-(1,1,7,7-四甲基久落尼定基-4-乙烯基)-4H-吡喃（DCJTB）（1:1）纳米颗粒的SEM图片；

图3：AAO模板法制备的GET和DCJTB（1:1）诊疗协同纳米颗粒释放体系的储存稳定性数码照片表征结果（左瓶：功能化的诊疗协同纳米颗粒释放体系；右瓶：未功能化的诊疗协同纳米颗粒体系）；

图4：AAO模板法制备的GET和DCJTB（1:1）的储存稳定性表征（a.透射电子显微镜，b.动态光散射）；

图5：AAO模板法制备的GET和DCJTB（1:1）储存稳定性的紫外可见吸光光度法表征结果；

图6：AAO模板法制备的GET和DCJTB（1:1）的细胞内吞结果（激光共聚焦荧光显微镜测试结果，a.0min,b.10min,c.30min,d.1h,e.2h）；

图7：AAO模板法制备的GET和DCJTB（1:1）的细胞毒性（MTT比色法测试结果）；

图8：PEG-PMHC18的生物相容性研究（MTT比色法测试结果）。

图9：AAO模板法制备的不同比例吉非替尼（GET）和DCJTB（a.1:4；b.2:3；c.3:2；d.4:1）纳米颗粒的SEM图片；

图10：AAO模板法制备的吉非替尼（GET）+10-羟基喜树碱（HCPT）+DCJTB（10:10:1）纳米颗粒的SEM图片；

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

模板法制备单分散性疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和疏水红光染料4-(二氰乙烯基)-2-叔丁基-6-(1,1,7,7-四甲基久落尼定基-4-乙烯基)4H-吡喃（DCJTB）（摩尔比1:1）诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，包括如下步骤：

1）制备AAO模板：用高纯铝片（99.999%）作为原料，丙酮溶液中超声10min，除去表面污染物；然后在10V电压下，将铝片在高氯酸/乙醇（体积比1:4）溶液中电解30min，清除表面的氧化物，得到光亮的铝片；以铝片为阳极，铂片为阴极，在180V电压、15℃下，以5wt%H₃PO₄+C₂H₅OH（体积比1:3）为电解液，电解7小时；然后采用CuCl₂溶液除去Al基底，10wt%H₃PO₄溶液除掉阻挡层，得到两端开口的模板，如图1所示；

2）制备诊疗协同纳米颗粒：依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-DMF中对AAO模板超声10min进行表面处理；选择疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和疏水红光染料4-(二氰乙烯基)-2-叔丁基-6-(1,1,7,7-四甲基久落尼定基-4-乙烯基)-4H-吡喃（DCJTB），在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中配制成15mmol/L的混合溶液，并精确控制两种物质的摩尔比为1:1；将处理后的AAO模板在混合溶液中浸泡5分钟，然后晾干；重复该操作10次，得到处理后的AAO模板；

3）去除模板：用2-5mL的浓度为1mol/L的NaOH溶液溶解2小时彻底除去AAO模板；

4）纯化纳米颗粒：用去离子水稀释并以20000转/分钟的转速离心去除模板后的混合溶液，弃去上层清液，重复水洗5次得到纯的单分散诊疗协同纳米颗粒；

5）合成表面活性剂：以末端为氨基的PEG-5000为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐作为疏水端，通过NH₂和COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18的两亲性表面活性剂；

6）制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：取1mL的浓度为50umol/L的GET+DCJTB（摩尔比1:1）纳米颗粒溶液，加入200uL的浓度为1mg/mL的PEG-PMHC18的水溶液，超声20min使其稳定包裹。

经检测，所得到的单分散疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和DCJTB（摩尔比1:1）诊疗协同纳米颗粒的粒径为100-110纳米，如图2所示，载药量为90%。

将所制备的功能化的诊疗协同释放体系与未功能化的诊疗协同纳米颗粒体系同时在生理缓冲液中室温放置6个月，图3所示为两者6个月前后的对比数码照片，右瓶为未功能化的诊疗协同纳米颗粒体系，6个月后发生了沉降，左瓶为本实施例制备的诊疗协同纳米颗粒释放体系，未发生沉降，具有优良的储存稳定性，可以在生理环境中稳定6个月不沉降。此外，透射电子显微镜（图4左）、动态光散射法（图4右）、紫外可见吸光光度法（图5）也证明了本实施例制备的诊疗协同释放体系具有优良的稳定性。

图6所示为激光共聚焦荧光显微镜测试本实施例制备的诊疗协同纳米颗粒释放体系的细胞内吞过程，结果表明该诊疗体系可以被肿瘤细胞有效且快速内吞。

通过小鼠肿瘤治疗实验来表征本实施例制备的纳米诊疗协同释放体系的体内诊断和治疗效果，并采用MTT比色法进行测试不同剂型对肿瘤细胞的杀伤效果，如图7所示，结果表明纳米颗粒诊疗体系具有比分子态更强的治疗效果。

PEG分子无毒，具有良好的安全性；图8所示为生物相容性研究结果，可以看出，细胞在200ug/mL的表面活性剂中培养时仍然能保持95%以上的存活率，说明本实施例制备的诊疗协同纳米颗粒释放体系具有良好的生物相容性。

实施例2：

模板法制备单分散性疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和疏水红光染料4-(二氰乙烯基)-2-叔丁基-6-(1,1,7,7-四甲基久落尼定基-4-乙烯基)-4H-吡喃（DCJTB）（摩尔比分别为1:9,2:8,3:7,4:6,6:4,7:3,8:2,9:1）纳米诊疗协同释放体系的方法，包括如下步骤：

1）制备AAO模板：同实施例1；

2）制备诊疗协同纳米颗粒：依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-DMF中对AAO模板超声10min进行表面处理；选择疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和疏水红光染料DCJTB，在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中配制成15mmol/L的混合溶液，并精确控制两种物质的摩尔比分别为1:9,2:8,3:7,4:6,6:4,7:3,8:2,9:1；将处理后的AAO模板在混合溶液中浸泡5分钟，然后晾干；重复该操作10次，得到处理后的AAO模板；

3）去除模板：同实施例1；

4）纯化纳米颗粒：同实施例1；

5）合成表面活性剂：同实施例1；

6）制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：取1mL不同比例的GET+DCJTB纳米颗粒溶液（100umol/L），加入300uL PEG-PMHC18的水溶液（1mg/mL），搅拌30min使其稳定包裹。

经检测，所得到的单分散疏水抗癌药物吉非替尼（GET）和疏水染料DCJTB诊疗协同纳米颗粒的粒径为80-100纳米，如图9所示，载药量为90%。

实施例3：

模板法制备双药（GET、10-羟基喜树碱（HCPT））和疏水红光染料4-(二氰乙烯基)-2-叔丁基-6-(1,1,7,7-四甲基久落尼定基-4-乙烯基)4H-吡喃（DCJTB）（摩尔比10:10:1）纳米诊疗协同释放体系的方法，包括如下步骤：

1）制备AAO模板：同实施例1；

2）制备三组分诊疗协同纳米颗粒：依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃-DMF中对AAO模板超声10min进行表面处理；选择两种疏水抗癌药物（GET、HCPT）和一种疏水染料DCJTB，在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中配制成30mM/L的混合溶液，并精确控制三种组分的摩尔比为10:10:1；将处理后的AAO模板在混合溶液中浸泡10分钟，然后晾干；重复该操作15次，得到处理后的AAO模板；

3）去除模板：用2-5ml的浓度为10wt%的H₃PO₄溶液溶解4小时彻底除去AAO模板；

4）纯化纳米诊疗剂：同实施例1；

5）合成表面活性剂：同实施例1；

6）制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：取1mL的浓度为1000umol/L的GET+HCPT+DCJTB纳米诊疗剂溶液，加入10mL PEG-PMHC18的水溶液（0.1mg/mL），超声30min使其稳定包裹。

经检测，所得到的单分散疏水双药（GET、10-羟基喜树碱（HCPT））和染料DCJTB（10:10:1）诊疗协同纳米颗粒的粒径为30-35纳米，如图10所示，载药量为91%。

实施例4：

模板法制备单药替尼泊苷（TEN）和双染料（DCJTB、苝二酰胺（PTCDI））（摩尔比为10:1:1）纳米诊疗协同释放体系的方法，包括如下步骤：

1）制备AAO模板：同实施例1；

2）制备三组分纳米诊疗协同颗粒：依次在水-乙醇-丙酮-四氢呋喃中对AAO模板超声10min做表面处理；选择一种疏水抗癌药物TEN和两种疏水染料（DCJTB、PTCDI），在四氢呋喃（THF）中配制成10mM/L的混合溶液，并精确控制三种物质的摩尔比为10:1:1；将处理后的AAO模板在混合溶液中浸泡10分钟后晾干；重复该操作25次，得到处理后的AAO模板；

3）去除模板：同实施例3；

4）纯化诊疗纳米颗粒：同实施例1；

5）合成表面活性剂：同实施例1；

6）制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：取1mLTEN+DCJTB+PTCDI（摩尔比为10:1:1）诊疗协同纳米颗粒溶液（500umol/L），加入100uL PEG-PMHC18的水溶液（100mg/mL），超声30min使其稳定包裹。

经检测，所得到的单分散疏水药物TEN和双染料（DCJTB、PTCDI）（摩尔比为10:1:1）诊疗协同纳米颗粒的粒径为150-160纳米，载药量为93%。

实施例5：

模板法制备纳米诊疗协同释放体系的普适性研究，包括如下步骤：

1）制备AAO模板：同实施例1；

2）制备其他体系的诊疗协同纳米颗粒：对AAO模板进行表面改性处理；选择具有协同效应的疏水药物和成像造影剂，作为诊疗协同体系的基本组分，在这些组分的良性溶剂中配制成一定浓度的混合溶液，并精确控制各组分的比例（以便筛选最佳效果所对应的比例），将表面改性处理后的AAO模板在混合溶液中浸泡一定时间后晾干，调整每次浸泡时间和浸泡次数以获得所需的浓度和形貌；

3）去除模板：用酸或碱溶解一定时间彻底除去AAO模板；

4）纯化纳米诊疗颗粒：用水洗-离心、透析、抽滤-洗涤等方法纯化纳米诊疗颗粒。

5）合成表面活性剂：同实施例1；

6）制备诊疗协同纳米颗粒释放体系：调节适当的纳米诊疗颗粒的浓度和PEG的比例，其余步骤同实施例1。

检测所得到的诊疗协同纳米颗粒的粒径和载药量。

将所制备的功能化诊疗协同释放体系在生理缓冲液中室温放置一定时间，数码照片、电子显微镜、动态光散射法、紫外可见吸光光度法、荧光发射法测定体系的储存稳定性；激光共聚焦荧光显微镜测试纳米诊疗体系的细胞内吞过程，通过小鼠肿瘤治疗实验表征新剂型的体内诊断和治疗效果，并采用MTT比色法测试并对比不同剂型对肿瘤细胞的杀伤效果及生物相容性，分析本发明所制备的纳米诊疗协同释放体系的优良效果。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备AAO模板；

5）表面活性剂的合成：以末端为氨基的PEG为亲水端，含有18个碳链长度的马来酸酐为疏水端，通过NH₂和COOH的缩合反应，制备PEG-PMHC18的两亲性表面活性剂；

6)诊疗协同纳米颗粒释放体系的制备：将步骤4）所制备的诊疗协同纳米颗粒溶于水中，制得诊疗协同纳米颗粒水溶液；将步骤5）合成的表面活性剂溶于水中，制得表面活性剂水溶液；将诊疗协同纳米颗粒水溶液与表面活性剂水溶液混合，使两个体系混合均匀，超声、震荡或机械搅拌实现表面活性剂对诊疗协同纳米颗粒的稳定包裹，制得诊疗协同纳米颗粒释放体系。

2.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤1）中，制备AAO模板的条件如下：取纯度≥99.999%的铝片并对其进行预处理，电解液为3wt%-20wt%的硫酸、磷酸或草酸溶液；加入适量乙醇调控模板的制备过程；氧化电压20-200V，氧化温度0-32℃，氧化时间为0.5-12小时。

3.如权利要求2所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，所述预处理包括退火、去油渍、抛光和清洗步骤。

4.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，疏水药物为一种或两种以上，成像造影剂为一种或两种以上。

5.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤2）中，所述有机溶剂选自下列物质中的一种或几种：乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜。

6.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤2）中，所述AAO表面改性是指将AAO置于下列物质中的一种或多种中进行超声处理8-12分钟：水、乙醇、丙酮、异丙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中；且表面改性最后选择的溶剂与诊疗协同溶液中的有机溶剂相同。

7.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤4）中所述离心转速为4000-24800转/分钟。

8.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤6）中所述诊疗协同纳米颗粒水溶液的浓度为10umol/L-1000umol/L。

9.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤5）中所述表面活性剂水溶液的浓度为0.1mg/mL-100mg/mL。

10.如权利要求1所述的模板法制备诊疗协同纳米颗粒释放体系的方法，其特征在于：优选地，步骤5）中所述诊疗协同纳米颗粒水溶液与表面活性剂水溶液的体积比为1:10-10:1。