CN103033581A - 一种鱼类鲜度k值测定样品前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法,该方法取0.8-1.2g鱼肉样品,放入容器中,添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液,鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1,在冰水浴条件下搅拌10-20分钟;然后往容器中添加浓度为1M的KOH,调节pH值至2-3.5;最后加蒸馏水或去离子水定容至20mL,通过0.45微米的微滤膜过滤除去可能含有的杂质。在滤液中添加0.2-1mL的浓度为0.1M、pH为7.5的磷酸缓冲液,即得到K值分析用的预处理样品;本发明的方法简单易行,省时省力,降低对仪器的依赖,提高了处理效率,确保测定精度。
Description
技术领域
本发明涉及分析测试技术领域,尤其涉及一种改进的鱼类鲜度K值测定样品前处理方法。
背景技术
鲜度是水产品价值的重要衡量指标。K值是表示鲜度的一个指标,自1959年提出这个概念后,测定K值所需的提取ATP关联化合物的方法却没有很大改进。
鱼死亡早期,其自身的酶活性仍在活动,鱼的早期鲜度取决于自身的生物化学反应。将肌苷和次黄嘌岭之和对ATP 各级降鲜产物之和的比值即K值作为评定鱼类鲜度的重要化学指标,该法对鱼类鲜度进行评定行之有效,目前已为世界各国采用。测定的关键在于对鱼肉样品中所含核苷酸不同阶段的分解物进行定量。而核苷酸及其分解产物的提取是否充分,提取过程是否迅速高效,对K值的测定精度具有极大的影响。
传统的样品处理方法是将鱼肉在高氯酸中匀浆,使得与ATP及其关联产物分解相关的酶失活,同时抽提出酸可溶性核苷酸分解产物。离心分离上清液,沉淀多次重复抽提,最后合并上清液。为防止ATP在酸性条件下分解,抽提出的上清液应尽快用KOH中和。另外,采用KOH中和还能除去高氯酸,避免其阻碍ATP关联产物在后续离子交换树脂的吸附。以上操作,步骤较多,处理不便,多个步骤必然造成系统误差,导致测定精度的低下;且处理时间长,有可能导致ATP关联产物的非生理性分解,导致测定误差。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种改进的鱼类鲜度K值测定样品前处理方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法,包括以下步骤:
(1)取0.8-1.2g鱼肉样品,放入容器中,添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液,鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1(g/mL),在冰水浴条件下搅拌10-20分钟;
(2)往容器中添加浓度为1M的KOH,调节pH值至2-3.5;
(3)加蒸馏水或去离子水定容至20mL,通过0.45微米的微滤膜过滤除去可能含有的杂质。在滤液中添加0.2-1mL的浓度为0.1M、pH为7.5的磷酸缓冲液,即得到K值分析用的预处理样品。
本发明的有益效果是,本发明的方法简单易行,省时省力,降低对仪器的依赖,提高了处理效率,确保测定精度。
具体实施方式
一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法,包括以下步骤:
1、取0.8-1.2g鱼肉样品,放入容器中,添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液,鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1(g/mL),在冰水浴条件下搅拌10-20分钟。
高氯酸可使鱼肉中含有的ATP及其关联产物分解酶类失活,传统方法为提高ATP及其关联产物的提取得率,采用匀浆的方法使得鱼肉微细化。但是,附聚在匀浆机器件及容器皿上的样品收集比较困难;样本较多时,匀浆处理亦耗时耗力。研究发现,若样品为0.8-1.2g,无论是直接在鱼肉中添加高氯酸,还是把鱼肉样品切成若干小块,或者经过细致均匀的剁碎,添加高氯酸水溶液后抽提出的核苷酸关联物的量测定结果没有明显的差异。故本发明略去细切、剁碎、匀浆的操作,直接在0.8-1.2g鱼肉样品中添加高氯酸,以玻璃棒搅拌,提取10-20分钟。
传统方法为确保ATP及其关联产物的提取得率,至少重复抽提2次以上,即通过离心分离,将上清液转移到其他容器中,所得沉淀继续添加高氯酸匀浆后再离心,弃去沉淀,合并上清液。研究发现,一次提取所得上清液中ATP及其关联产物的得率最高,重复抽提液中亦能测定到很低含量的产物。考虑传统方法中经离心分离操作,这些少量可测定产物很可能是附着在离心管壁上的残留物。另外,提取时间从5分钟到30分钟,所得结果大致相同。本发明结合后续步骤,省略多次离心转移容器的操作,采用1次高氯酸提取10-20分钟,无需离心,保留沉淀,直接进入后续的中和操作。
2、往容器中添加浓度为1M的KOH,调节pH值至2-3.5。
传统方法在离心上清液中尽快添加KOH进行中和反应,以防止沉淀中的鱼肉蛋白质变性,在中和后复溶,影响核苷酸及其关联产物的测定。但是,因为添加的KOH为强碱,中和终点附近pH变化较快,很难迅速达到中和终点,且pH计或pH试纸必不可少,pH的测定与调节需要耗时耗力。研究发现,调节pH至2-3.5之间,经高氯酸溶解的核苷酸及其关联产物在此酸碱度范围内测定值较稳定,但pH4-6范围内,测定值不够稳定,有受变性蛋白影响的可能。故本发明用KOH中和不是到中性的pH7.0,而是调整反应体系至pH3.0附近。另外,采用1次性添加高氯酸提取后保留沉淀,不离心处理,直接在提取体系中添加KOH。因为添加的高氯酸量是已知的,可通过酸碱反应方程式计算相应添加的碱量,一次性添加碱液后,迅速达到预期pH值,无需依赖pH仪器或试纸,也省略了测定调节的操作,省时省力,特别有利于户外采样。采集样本较多时,尤其具有优势。
3、加蒸馏水或去离子水定容至20mL,通过0.45微米的微滤膜过滤除去可能含有的杂质。在滤液中添加0.2-1mL的浓度为0.1M、pH为7.5的磷酸缓冲液,即得到K值分析用的预处理样品。
一般认为ATP在酸性条件下不能长期稳定存在,而高效液相色谱法测定时耗时3-4个小时,样品较多时预处理样品需较长时间保存。研究发现,在ATP溶液中添加1-5%的高氯酸,室温下放置13小时后,5%的高氯酸可使60%的ATP分解;1%的高氯酸可使20%的ATP分解。不同pH范围,ATP变性程度亦不相同。pH1.0条件下,室温放置13小时,15%左右的ATP分解,pH3.0-pH7.0范围内只有不到2%左右的ATP发生分解。通过高效液相色谱进行检测,发现pH1.0条件下保藏13小时后,15%的ATP分解成ADP,但未继续分解成AMP或IMP。但是,在pH3.0 和pH7.0的条件下,同样保藏,则未检测到显著的ATP分解。
K值的测定目前通用的方法为高效液相分离。使用的分离体系一般为酸性磷酸缓冲液。研究发现,将样品体系pH调节至3.0后,在滤液中添加pH7.5磷酸缓冲液可有效使抽提出的ATP及其关联产物混合体系达到pH7.0,用于预处理样品的长期保存,有助于户外采样和样品的批量处理。另外,在样品预处理时经磷酸缓冲液处理,可有效防止预处理样品中混有的蛋白质上柱后在酸性条件下沉淀,堵塞高效液相分离柱。
综上可见,本发明在传统方法的基础上省去匀浆,离心,调节pH,建立了一个简单可行的方法。
下面根据实施例详细描述本发明,本发明的目的和效果将变得更加明显。
实施例1:
取0.8g鱼肉,加入冷却的5%高氯酸10mL,冰浴条件下混合物在50mL离心管中用玻璃棒挤压搅拌15分钟进行提取。在提取液中加入1M KOH,使pH为2.0。加蒸馏水清洗玻璃棒,至20mL。静置30分钟,取上清液通过0.45μm微滤膜过滤,取滤液0.8mL,加0.2mL0.1M 磷酸缓冲液(pH 7.5),得到1mL HPLC样品。实验证明,本实例中通过以上预处理所得样品经高效液相分离,图谱清晰,重复性较高。
实施例2:
取1.0g鱼肉,加入冷却的2.5%高氯酸10mL,冰浴条件下混合物在50mL离心管中用玻璃棒挤压搅拌20分钟进行提取。在提取液中加入1M KOH,使pH为3.0。加去离子水清洗玻璃棒,至20mL。静置30分钟,取上清液通过0.45μm微滤膜过滤,取滤液4mL,加1mL 0.1M 磷酸缓冲液(pH 7.5),得到5mL HPLC样品。实验证明,本实例中通过以上预处理所得样品经高效液相分离,图谱清晰,重复性较高。
实施例3:
取1.2g鱼肉,加入冷却的10%高氯酸10mL,冰浴条件下混合物在50mL离心管中用玻璃棒挤压搅拌10分钟进行提取。在提取液中加入1M KOH,使pH为3.5。加蒸馏水清洗玻璃棒,至20mL。静置35分钟,取上清液通过0.45μm微滤膜过滤,取滤液4mL,加1mL 0.1M 磷酸缓冲液(pH 7.5),得到5mL HPLC样品。实验证明,本实例中通过以上预处理所得样品经高效液相分离,图谱清晰,重复性较高。
上述实施例用来解释说明本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明作出的任何修改和改变,都落入本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取0.8-1.2g左右鱼肉样品,放入容器中,添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液,鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1(g/mL),在冰水浴条件下搅拌约10-20分钟;
(2)往容器中添加浓度为1M的KOH,调节pH值至2-3.5;
(3)加蒸馏水或去离子水定容至20mL,通过0.45微米的微滤膜过滤除去可能含有的杂质;在滤液中添加0.2-1mL的浓度为0.1M、pH为7.5的磷酸缓冲液,即得到K值分析用的预处理样品。
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