CN103025881A - 脂溶性生理活性物质的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脂溶性生理活性物质的制备方法，该方法包括：在特定的表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，将脂溶性生理活性物质提取到有机溶剂相中。通过所述制备方法，可以不使用特殊的脱水、干燥设备，并且可以在不存在因溶剂与菌体成分的分离性恶化而导致的收率降低的情况下而进行提取，可以有效的工业生产。

Description

脂溶性生理活性物质的制备方法
技术领域
本发明涉及脂溶性生理活性物质的制备方法。具体而言，涉及通过从含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液中提取脂溶性生理活性物质，从而制备脂溶性生理活性物质的方法。
背景技术
生物体中有用的脂溶性生理活性物质已知有很多。其中，辅酶Q是广泛分布于从细菌至哺乳动物的生物体内的必需成分，已知是作为生物体内细胞中的线粒体电子传递体系的组成成分。辅酶Q除了在线粒体中被反复的氧化和还原，承担电子传递体系中的传递成分的功能外，辅酶Q中的还原型辅酶Q已知还具有抗氧化作用。在人中，辅酶Q的侧链具有10个重复结构的辅酶Q10是主成分，在生物体内，其通常存在约40-90%的还原型。辅酶Q的生理作用可列举通过线粒体活化作用激活能量生产、激活心脏机能、稳定细胞膜的效果、通过抗氧化作用而保护细胞的效果等。
一直以来，辅酶Q10中的氧化型辅酶Q10被用作充血型心力衰竭药或健康食品；近年来，逐渐认知具有更高生理活性作用的还原型辅酶Q10。
辅酶Q10等脂溶性生理活性物质可以通过例如合成、发酵、自天然物中提取等而获得。必要时，还可以将获得的提取物，通过层析纯化、析出结晶而结晶化，获得更高纯度的物质。例如，为了获得辅酶Q10，一般可以培养生产辅酶Q10的微生物，使用有机溶剂从该微生物的悬浮液中提取微生物中的辅酶Q10的方法。
一直以来，关于提取微生物细胞中所包含的有用成分的操作，已知有将培养后的微生物的水性悬浮液脱水，形成湿菌体，并使其与有机溶剂接触的方法；将水性悬浮液脱水后进一步干燥，将干燥菌体与有机溶剂接触的方法；直接将水性悬浮液与有机溶剂接触，在液-液之间提取的方法。
专利文献1中记载了离心处理培养后的Phaffia酵母的悬浮液，回收菌体，将回收了的菌体喷雾干燥后，用己烷、乙醇等混合溶剂边破碎菌体边提取菌体中的虾青素(astaxanthin)的例子。此外，还已知培养genus Mortierella的菌体，在将菌体悬浮液脱水、干燥后，通过己烷提取含有花生四烯酸的油的例子(专利文献2)；将培养了genus Mucor菌体的培养液破碎，冷冻干燥后，通过己烷等溶剂提取γ-亚麻酸的例子(专利文献3)。在这些提取方法中，将干燥菌体与作为提取溶剂的有机溶剂混合，完成提取操作后，通过固液分离去除菌体残渣，可以获得含有目标物质的有机相。
专利文献4中公开了，使含有辅酶Q10的微生物的湿菌体或干燥菌体在低温下与甲醇接触，去除菌体内外的杂质后，再在高温下与甲醇接触，提取辅酶Q10的例子。在此类固-液提取操作中，由于菌体和提取溶剂的比重差大，因此具有易于提取后固液分离，目标物质损失少，可以高效提取的优点。
但是，在这些方法中，在提取前，从培养后的微生物的水性悬浮液中将大量的水分通过离心分离、喷雾干燥器、冷冻干燥机等装置而脱水、干燥的步骤是必需的，而且由于菌体中残留的含水率，存在不能获得充分的提取率的情况，此外还有装置成本、运输成本高等问题。
将微生物的水性悬浮液不进行脱水、干燥而提取的例子已知有：直接将培养后的微生物的破碎悬浮液与己烷、2-丙醇等有机溶剂接触，提取菌体内的辅酶Q10(专利文献5)。在此类液-液提取操作中，不进行脱水、干燥微生物，可以以高收率、大处理量提取目标物质，但是，在使用有机溶剂提取微生物细胞或该细胞破碎物的水性悬浮液，特别是该细胞破碎物的水性悬浮液，尤其是物理处理的该细胞破碎物的水性悬浮液的情况下，由于存在一部分蛋白质等细胞成分而易于发生乳化现象等，使含有目标物质的有机相大量困于微生物细胞的破碎悬浮液中，不仅存在不能有效分离有机相，导致收率降低的问题，而且存在所用的提取溶剂的回收率低的问题。此外，还存在除疏水性有机溶剂外，必须使用一定量的亲水性有机溶剂等，使操作复杂化、成本增加的问题。
此外一直以来，在液-液提取中使用表面活性剂的情况下，由于因界面效果而增加了水相和有机溶剂相的亲和性，易于产生均相化，导致常常需要长时间来分离水相和有机溶剂相，或者即使花费了时间也不能分离，必须根据情况通过离心分离等操作来强制分离。因此，在一般的液-液提取中，在提取步骤中使用表面活性剂被认为不是优选的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特开平7-41687号公报
专利文献2:特开2009-120840号公报
专利文献3:特开平5-17796号公报
专利文献4:专利第4275621号公报
专利文献5:特开2008-253271号公报
发明内容
发明要解决的问题
如上所述，一直以来，在从微生物细胞中提取脂溶性生理活性物质等有用成分的提取操作中，提取前对微生物脱水或干燥等必需要特殊的设备，提取后含有有用成分的溶剂与菌体成分的分离性差，收率不充分，还必须使用多种溶剂等，导致操作复杂化、成本增加的问题。
本发明的一个目的是，提供从含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞中，提取脂溶性生理活性物质，可以有效进行工业生产的制备方法，所述方法不使用特殊的脱水、干燥设备，并且不存在由于溶剂与菌体成分的分离性恶化而导致收率降低。
发明解决问题的手段
为了解决上述问题进行深入研究，结果发现：使含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中存在特定的表面活性剂，进行使用有机溶剂的提取操作，不仅可以提高有机溶剂与水性悬浮液的亲和性，而且在混合、静置后，可以加快油水分离，有效提取脂溶性生理活性物质，也适合工业生产，完成本发明。
换言之，本发明为如下所述。
［1］脂溶性生理活性物质的制备方法，该方法包括：在选自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂和烷基醚型表面活性剂中的至少一种非离子型表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，提取脂溶性生理活性物质。
［2］上述［1］记载的制备方法，其中，脂溶性生理活性物质是辅酶Q10。
［3］上述［2］记载的制备方法，其中，辅酶Q10是还原型辅酶Q10，或是还原型辅酶Q10和氧化型辅酶Q10的混合物。
［4］上述［1］-［3］的任一项记载的制备方法，其中，非离子型表面活性剂至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂。
[5]上述[1]-[4]的任一项记载的制备方法，其中，相对于微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液，非离子型表面活性剂的添加量为0.01重量%以上。
[6]上述[1]-[5]的任一项记载的制备方法，其中，有机溶剂是疏水性有机溶剂。
[7]上述[6]记载的制备方法，其中，还组合使用了亲水性有机溶剂。
[8]上述[1]-[7]的任一项记载的制备方法，其中，提取是连续提取。
[9]脂溶性生理活性物质的纯化方法，该方法包括：在选自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂和烷基醚型表面活性剂中的至少一种非离子型表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，提取脂溶性生理活性物质。
[10]上述[9]记载的纯化方法，其中，脂溶性生理活性物质是辅酶Q10。
[11]上述[10]记载的纯化方法，其中，辅酶Q10是还原型辅酶Q10，或是还原型辅酶Q10和氧化型辅酶Q10的混合物。
[12]上述[9]-[11]的任一项记载的纯化方法，其中，非离子型表面活性剂至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂。
[13]上述[9]-[12]的任一项记载的纯化方法，其中，相对于微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液，非离子型表面活性剂的添加量为0.01重量%以上。
[14]上述[9]-[13]的任一项记载的纯化方法，其中，有机溶剂是疏水性有机溶剂。
[15]上述[14]记载的纯化方法，其中，还组合使用了亲水性有机溶剂。
[16]上述[9]-[15]的任一项记载的纯化方法，其中，提取是连续提取。
发明的效果
一直以来，从微生物细胞中提取有用成分的方法就存在设备、制备成本等方面、操作稳定性的问题，脂溶性生理活性物质的制备方法也具有同样的问题，但是，通过本发明的制备方法，可以通过液-液提取操作有效的进行脂溶性生理活性物质的提取，也适合工业生产。
进一步的，本发明发现在液-液提取操作时使用优选的特定表面活性剂，可以在提取时使含有目标物质的分散相在提取溶剂中微细分散，促进目标物质向提取溶剂中移动，同时，由于有机相和水相静置后的油水分离也能快速进行，不仅可以稳定的以高收率制备脂溶性生理活性物质，而且可以抑制由于有机相移动至水相中而造成的提取溶剂的损失。此外，一直以来，为了以更高的收率获得目标物质，在提取操作中必须使用多种提取溶剂，与该情况相对的，本发明可以仅使用单一溶剂而进行高收率的操作，因此可以获得实现简化装置、操作，而且可以获得减少用于溶剂回收的能量，以及降低环境负荷等效果。
本发明的实施方式
以下文详细的说明了本发明的实施方式。
本发明是脂溶性生理活性物质的制备方法，该方法包括：在后述特定的非离子型表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，将脂溶性生理活性物质提取到有机溶剂相中。
在本发明的制备方法中，作为提取对象的脂溶性生理活性物质只要是微生物细胞中生产的、对有机溶剂具有亲和性(脂溶性)，且对生物体有用的生理活性物质即可，没有特殊的限制。其具体例子可列举例如，辅酶Q10等辅酶Q类；维生素A、维生素D、维生素E或维生素K等维生素类；胡萝卜素、虾青素或岩藻黄质等类胡萝卜素类；脂溶性多酚类、黄酮类、麦角甾醇等甾醇类、α-硫辛酸、L-肉毒碱等。其中，辅酶Q10或虾青素、麦角甾醇等是优选的，辅酶Q10是特别优选的。
如上所述，辅酶Q10存在氧化型和还原型。本发明的辅酶Q10可以以氧化型辅酶Q10、还原型辅酶Q10中任一种为对象，但优选是含有还原型辅酶Q10的辅酶Q10，即，以单独地还原型辅酶Q10，或者是还原型辅酶Q10与氧化型辅酶Q10的混合物这样的辅酶Q10为对象。需要说明的是，在本说明书中，在仅记载辅酶Q10的情况下，表示不论氧化型辅酶Q10还是还原型辅酶Q10，且在两种混合存在的情况下，表示混合物全体。
用于本发明中的含有脂溶性生理活性物质的微生物只要是在菌体内产生作为目标的脂溶性生理活性物质或其前体的微生物，或本身就含有一定量以上的所述物质的微生物即可，可以不限制的使用细菌、酵母、霉菌中的任一种。其中，在菌体内产生所述脂溶性生理活性物质的微生物是优选的。
具体而言，上述微生物可列举例如：农杆菌(Agrobacterium)属、曲霉(Aspergillus)属、乙酸杆菌(Acetobacter)属、氨基杆菌(Aminobacter)属、气单孢菌属(Agromonas)属、嗜酸菌(Acidiphilium)属、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)属、布勒掷孢酵母(Bullera)属、短波单胞菌(Brevundimonas)属、隐球菌(Cryptococcus)属、Chionosphaera属、念珠菌(Candida)属、Cerinosterus属、Exisophiala属、外担菌(Exobasidium)属、Fellomyces属、线黑粉菌(Filobasidiella)属、线黑粉酵母(Filobasidium)属、地霉(Geotrichum)属、果黑粉菌(Graphiola)属、葡糖杆菌(Gluconobacter)属、考克娃酵母(Kockovaella)属、克氏担孢酵母(Kurtzmanomyces)属、Lalaria属、白冬孢酵母(Leucosporidium)属、军团杆菌(Legionella)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、枝动杆菌(Mycoplana)属、卵孢酵母(Oosporidium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、Psedozyma属、副球菌(Paracoccus)属、石座菌(Petromyces)属、红酵母(Rhodotorula)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、根单胞菌(Rhizomonas)属、红菌(Rhodobium)属、红游动菌(Rhodoplanes)属、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属、红细菌(Rhodobacter)属、掷孢酵母(Sporobolomyces)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、Saitoella属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属、孢子丝菌(Sporotrichum)属、Sympodiomycopsis属、Sterigmatosporidium属、外囊菌(Tapharina)属、银耳(Tremella)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、腥黑粉菌(Tilletiaria)属、腥黑穗病菌(Tilletia)属、稗凝黑穗病菌(Tolyposporium)属、Tilletiopsis属、黑粉菌(Ustilago)属、Udeniomyces属、Xanthophllomyces属、黄色(无芽胞)杆菌(Xanthobacter)属、拟青霉(Paecilomyces)属、支顶孢(Acremonium)属、Hyhomonus属、根瘤菌(Rhizobium)属、红发夫酵母(Phaffia)属、雨生红球藻(Haematococcus)属等微生物。从易于培养、生产性观点出发，优选细菌或酵母，细菌中的非光合细菌是更优选的，进一步的，可列举农杆菌(Agrobacterium)属、葡糖杆菌(Gluconobacter)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、副球菌(Paracoccus)属、红细菌(Rhodobacter)属等，酵母中的裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、Saitoella属、红发夫酵母(Phaffia)属等为特别优选的例子。
需要说明的是，在菌体外产生脂溶性生理活性物质，即在培养液中产生所述物质的微生物也包括在本发明中。
作为产生脂溶性生理活性物质的微生物，不仅可以为上述微生物的野生型，还可以优选使用例如，将与上述微生物的目的脂溶性生理活性物质的生物合成相关的基因的转录和翻译活性、或表达蛋白质的酶活性进行了改良的变体或重组体。
通过培养上述微生物，可以获得含有辅酶Q10等脂溶性生理活性物质的微生物细胞。培养方法没有特殊的限制，可以恰当的选择适合作为对象的微生物，或适合作为目的的脂溶性生理活性物质生产的培养方法。培养时间也没有特殊的限制，只要可以在微生物细胞中产生所需目标量的脂溶性生理活性物质即可。在上述情况下的脂溶性生理活性物质的产量(含量)根据目的没有特殊的限制，就例如单位培养基中的脂溶性生理活性物质的含量而言，可以是例如0.5μg/mL以上，优选1μg/mL以上，更优选2μg/mL以上。
在本发明的制备方法中，从上述含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞中提取脂溶性生理活性物质时，可以从微生物细胞中直接提取，也可以根据需要破碎上述微生物细胞成为微生物细胞破碎物，从所述破碎物中提取。破碎细胞有助于有效提取微生物细胞中产生、积累的脂溶性生理活性物质。关于细胞破碎处理，在细菌的情况下有时并非必需采用，对于使用酵母或霉菌细胞的情况，进行细胞破碎处理是特别优选的。在使用酵母或霉菌细胞的情况下，如果不破碎细胞，则对细胞中产生、积累的脂溶性生理活性物质的回收效率降低。不言而喻的是细胞破碎和提取也可以同时进行。
此外，本发明中的“破碎”是指细胞壁等表面结构受到能够达到提取目标脂溶性生理活性物质的程度的损伤即可，不一定要破坏微生物细胞，或使其碎片化。
在本申请中，“微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液”是指将微生物细胞或其微生物细胞破碎物悬浮在水、生理盐水、缓冲液、培养基等水性溶剂中，优选悬浮在水和/或培养基中。
作为上述细胞破碎的对象的微生物细胞的形态，可以是微生物细胞的水性悬浮液、培养液、将培养液浓缩而得到的物质、从培养液中采集的微生物细胞的湿菌体、将上述这些洗净而得的物质、将湿菌体悬浮在溶剂(包括例如水、生理盐水、缓冲液等)中而得的物质、干燥上述湿菌体后得到的干燥菌体、将干燥菌体悬浮在溶剂(包括例如水、生理盐水、缓冲液等)中而得的物质等，优选微生物细胞的水性悬浮液、培养液、浓缩培养液或这些洗净后的物质，根据操作性等方面，更优选的是培养液、浓缩培养液或其洗净后而得到的物质。
上述微生物细胞的破碎可以按任意顺序进行下列一个或多个破碎方法。破碎方法可列举例如物理处理、化学处理、酶处理，此外，加热处理、自消化、渗透压溶解、质壁分离(原形質溶解)等。
上述物理处理可列举例如使用高压匀浆器、旋转刃式匀浆器、超声波匀浆器、弗氏压碎器、球磨机等，或这些的组合。
上述化学处理可列举例如使用盐酸、硫酸等酸(优选强酸)处理；使用氢氧化钠或氢氧化钾等碱(优选强碱)处理等，或这些的组合。
上述酶处理可列举例如使用溶菌酶、酵母破碎酶(zymolyase)、葡聚糖酶、novozyme、蛋白酶、纤维素酶等的方法，也可以恰当的使用这些的组合。
上述加热处理可列举例如在60-140℃下处理30分钟-3小时左右。
上述自消化可列举例如通过乙酸乙酯等溶剂处理。
此外，通过使用与细胞内的盐浓度不同的溶液进行处理，也可以引起细胞的渗透压溶解或原生质体溶解。但是，仅用这些方法破碎细胞的效果常会不充分，优选与上述物理处理、化学处理、酶处理、加热处理、自消化等组合使用。
在本发明中，作为提取、回收脂溶性生理活性物质的预处理的细胞破碎方法，可以是上述破碎方法中的，优选物理处理、化学处理(特别是酸处理，优选强酸(例如，水溶液中pKa在2.5以下的酸)处理)或加热处理是优选的，从破碎效率的角度，更优选物理处理。
在本发明中，使含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞，或如上所述获得的含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞的破碎物，以水性悬浮液的状态，进行脂溶性生理活性物质的提取。在本发明中，制备微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液的方法没有特殊的限制，可以是例如，培养产生脂溶性生理活性物质的微生物后的培养液、将所述培养液浓缩和/或洗净而得到物质、将所述微生物细胞的湿菌体或干燥菌体悬浮在水或水性溶剂中而制备。或者可以通过上述方法破碎微生物细胞的水性悬浮液而制备。
在本发明的制备方法中，作为提取对象的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中的菌体浓度，没有特殊的限制，按菌体干重换算，通常是在1-25重量%的范围，经济地优选在10-20重量%的范围内实施。
在本发明的制备方法中，在特定的非离子型表面活性剂的存在下，将上述含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，通过液-液提取来提取有机溶剂相中的脂溶性生理活性物质，优选不需强制性油水分离的步骤，静置混合液而油水分离，从分离的有机溶剂相中进行回收脂溶性生理活性物质。即，可以将从所述水性悬浮液和有机溶剂的混合液中提取脂溶性生理活性物质的步骤、静置混合液而油水分离的步骤连续地进行，从而有效的获得所述物质。
在本发明的制备方法中，作为提取时使用的非离子型表面活性剂，使用甘油脂肪酸酯类、蔗糖脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂或烷基醚型表面活性剂是必要的。此外，可以组合使用2种以上的这些非离子型表面活性剂，也可以将这些非离子型表面活性剂与其他表面活性剂组合使用。
作为上述甘油脂肪酸酯类，可列举例如，脂肪酸的部分甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、聚甘油缩合蓖麻醇酸酯等。脂肪酸的部分甘油酯可列举例如，单甘油单辛酸酯、单甘油单癸酸酯、单甘油二辛酸酯、单甘油二癸酸酯、单甘油二月桂酸酯、单甘油二豆蔻酸酯、单甘油二硬脂酸酯、单甘油二油酸酯、单甘油二芥酸酯、单甘油二山萮酸酯等单甘油脂肪酸酯；单甘油辛酸琥珀酸酯、单甘油硬脂酸柠檬酸酯、单甘油硬脂酸乙酸酯、单甘油硬脂酸琥珀酸酯、单甘油硬脂酸乳酸酯、单甘油硬脂酸二乙酰酒石酸酯、单甘油油酸柠檬酸酯等单甘油脂肪酸有机酸酯等。聚甘油脂肪酸酯可列举例如，在以聚合度2至10的聚甘油为主要成分的聚甘油中，聚甘油的一个以上的羟基被碳原子数分别为6-22的脂肪酸酯化而得的聚甘油脂肪酸酯。具体而言，可列举例如六甘油单辛酸酯、六甘油二辛酸酯、十甘油单辛酸酯、三甘油单月桂酸酯、四甘油单月桂酸酯、五甘油单月桂酸酯、六甘油单月桂酸酯、十甘油单月桂酸酯、三甘油单豆蔻酸酯、五甘油单豆蔻酸酯、五甘油三豆蔻酸酯、六甘油单豆蔻酸酯、十甘油单豆蔻酸酯、二甘油单油酸酯、三甘油单油酸酯、四甘油单油酸酯、五甘油单油酸酯、六甘油单油酸酯、十甘油单油酸酯、二甘油单硬脂酸酯、三甘油单硬脂酸酯、四甘油单硬脂酸酯、五甘油单硬脂酸酯、五甘油三硬脂酸酯、六甘油单硬脂酸酯、六甘油三硬脂酸酯、六甘油二硬脂酸酯、十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油三硬脂酸酯等。聚甘油缩合蓖麻醇酸酯可列举例如，聚甘油的平均聚合度为2-10、聚蓖麻醇酸的平均缩合度(蓖麻醇酸的平均缩合数)为2-4的聚甘油缩合蓖麻醇酸酯，可列举例如四甘油缩合蓖麻醇酸酯、五甘油缩合蓖麻醇酸酯、六甘油缩合蓖麻醇酸酯等。
作为上述蔗糖脂肪酸酯类，可列举蔗糖的一个以上的羟基被碳原子数分别为6-18，优选6-12的脂肪酸酯化而得的蔗糖脂肪酸酯。具体而言，可列举蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯等。
作为上述脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，可列举脱水山梨糖醇类的一个以上的羟基被碳原子数分别为6-18，优选6-12的脂肪酸酯化而得的脱水山梨糖醇脂肪酸酯。具体而言，可列举脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯等。
作为上述聚醚多元醇型表面活性剂，可列举例如株式会社ADEKA生产的Adecanol LG系列(LG-109、LG-126、LG-294、LG-295S、LG-299、LG-805)等。
作为上述聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂，优选是在碳原子数为12-22的脂肪族醇上聚合添加氧化乙烯而获得的表面活性剂，可列举例如花王株式会公司生产的Emulgen系列(103、104P、105、106、108、109P、120、123P、147、150、210、220、306P、320P、350、404、408、409PV、420、430、705、707、709、1108)等。
作为上述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂，可以是在聚丙二醇两端添加氧化乙烯而获得的嵌段共聚物，除在氧化乙烯(EO)链之间具有氧化丙烯(PO)链的共聚物(EOｘPOyEOｚ)之外，还包括反向聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等。
作为上述在氧化乙烯(EO)链之间具有氧化丙烯(PO)链的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列举例如株式会社ADEKA生产的普朗尼克(Pluronic)L系列(L-31、L-34、L-44、L-61、L-62、L-64、L-71、L-72、L-101、L-121)、普朗尼克P系列(P-65、P-84、P-85、P-103、P-105、P-123)、普朗尼克F系列(F-68、F-108、F-127)或ＢASF公司生产的普朗尼克PE系列等。
作为上述反向聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列举例如株式会社ADEKA生产的普朗尼克R系列(25R-1、25R-2、17R-2、17R-3、17R-4)或ＢASF公司生产的普朗尼克RPE系列等。
作为上述乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列举例如，株式会社ADEKA生产的普朗尼克TR系列(TR-701、TR-702、TR-704)或ＢASF公司生产的Tetronic系列(poloxamine)等。
进一步的，与聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂同样地，在本发明的制备方法中，还可以使用具有与聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂相似的结构、在2个氧化乙烯(EO)链之间具有氧化丁烯(ＢO)链的三嵌段共聚物型表面活性剂(EOｘＢOyEOｚ)。
在上述这些聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(及其类似物)中，优选质量平均分子量在500-8000范围内的表面活性剂，更优选质量平均分子量在1000-4000范围内的表面活性剂。
作为上述烷基醚型非离子型表面活性剂，可列举例如株式会社ADEKA生产的Adekatol LＢ系列(LＢ-53Ｂ、LＢ-720、LＢ-820、LＢ-54C、LＢ-83、LＢ-93、LＢ-103、LＢ-1220、LＢ-1520)、Adekatol LA系列(LA-675Ｂ、LA-775、LA-875、LA-975、LA-1275)等。
不言而喻的是，可以组合使用2种以上的、本文中所示的非离子型表面活性剂。
在上述非离子型表面活性剂中，优选至少使用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂。在此情况下，可以单独使用1种聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂，特别优选的是组合使用2种以上的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂，或者组合使用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂和其以外的非离子型表面活性剂。作为与聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂组合使用的非离子型表面活性剂，可列举上述的非离子型表面活性剂，即，甘油脂肪酸酯类、蔗糖脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂、烷基醚型表面活性剂。其中，优选是2种聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂的组合，或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂与蔗糖脂肪酸酯类的组合，更优选是2种聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂的组合，特别优选是在氧化乙烯(EO)链之间具有氧化丙烯(PO)链的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物与乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的组合。
在聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂与其以外的非离子型表面活性剂的组合情况下，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂的使用量优选多于其以外的非离子型表面活性剂，例如，优选相对于所使用的非离子型表面活性剂的总量，其用量是50重量%以上，更优选60重量%以上，更优选75重量%以上。
在液-液提取操作中使用这样的表面活性剂，可以在提取时，使含有作为目标物质的脂溶性生理活性物质的分散相在作为提取溶剂的有机溶剂中细微分散化。其结果是，提高了提取溶剂与脂溶性生理活性物质的接触效率，促进了脂溶性生理活性物质向有机溶剂相移动。另一方面，一直以来，当在液-液提取中使用表面活性剂时，由于因界面效果而使得水相与有机溶剂相的亲和力增加，易于发生均相化，常有水相与有机溶剂相的分离需要较长时间，或者即使花费了时间也不能分离的情况，需要根据情况通过离心分离等操作进行强制性的分离。因此，迄今为止，在一般的液-液提取中，提取步骤中使用表面活性剂被认为不是优选的。但是，本发明首次发现：当使用有机溶剂，从含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中，液-液提取有机溶剂相中的脂溶性生理活性物质时，使上述特定的表面活性剂，特别是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂在提取时共存，不仅可以提高有机溶剂与水性悬浮液的亲和性，而且在混合、静置后，可以快速进行油水分离。因此，用本发明的制备方法，可以稳定且高收率地回收溶解了作为目标物质的脂溶性生理活性物质的有机溶剂相。
此外，在本发明的制备方法中，当使用糊状和薄片状的非离子型表面活性剂时，优选使用用于溶解表面活性剂的溶剂。此外，当使用液态表面活性剂时，在其粘性高时优选使用溶剂。此时使用的溶剂，优选是水或醇类，可以分别单独使用，也可以以水和醇的混合溶剂的形式使用。
在本发明的制备方法中，就提取操作时上述特定的非离子型表面活性剂的使用量而言，以相对于微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液的浓度表示，优选是0.01重量%以上，更优选是在0.01-10重量%的范围内，更优选是在0.1-5重量%的范围内，特别优选是在0.5-5重量%的范围内。当上述表面活性剂的添加量在0.01重量%以下时，不能促进有机溶剂中的水性悬浮液的细微分散化，不能保证充分的提取效率。另一方面，当上述表面活性剂的添加量超过10重量%时，由于将有机溶剂与水性悬浮液的亲和性提高至必要以上，因此，虽然促进了有机溶剂中的水性悬浮液的细微分散化，但静置处于混合状态的有机溶剂与水性悬浮液时的油水分离性恶化。
在本发明的制备方法中，作为上述在特定非离子型表面活性剂的存在下进行提取的方法没有特殊的限制，只要是在提取时可以在水性悬浮液与有机溶剂的混合液中共存设定量的表面活性剂的方法即可，没有特殊的限制，可列举：在提取前向微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中添加表面活性剂的方法；向提取时使用的有机溶剂中添加表面活性剂的方法；向有机溶剂与水性悬浮液的混合液中添加表面活性剂的方法；此外，还可以是在制备微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液之时或之前预先添加表面活性剂的方法；或直接在提取时使用破碎微生物细胞时使用的表面活性剂的方法等。
在本发明的制备方法中，作为提取时使用的有机溶剂，可列举烃类、脂肪酸酯类、醚类、醇类、脂肪酸类、酮类、氮化合物类(包括腈类、酰胺类)、含硫化合物类等。
作为烃类，没有特殊的限制，可列举例如脂肪族烃、芳香族烃、卤代烃等。其中优选脂肪族烃、芳香族烃，更优选脂肪族烃。
作为脂肪族烃，不论环状或非环状，不论饱和或不饱和，都没有特殊的限制，一般优选使用饱和的。使用的碳原子数一般是3-20个，优选碳原子数5-12个，更优选碳原子数5-8个。具体例子可列举：例如丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷异构体(例如，2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷)、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、2-戊烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、p-薄荷烷、环己烯等。优选戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、壬烷、2，2，5-三甲基己烷、癸烷、十二烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷、p-薄荷烷等。更优选戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等；更优选戊烷、己烷、环己烷、甲基环己烷等。
作为芳香族烃，没有特殊的限制，一般使用碳原子数6-20，优选碳原子数6-12，更优选碳原子数7-10的芳香族烃。具体例子可列举例如：苯、甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、异丙基苯、三甲基苯、四氢化萘、丁基苯、对异丙基苯甲烷、环己基苯、二乙基苯、戊基苯、二戊基苯、十二烷基苯、苯乙烯等。优选甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、异丙基苯、三甲基苯、四氢化萘、丁基苯、对异丙基苯甲烷、环己基苯、二乙基苯、戊基苯等。更优选甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、异丙基苯、四氢化萘等。最优选是异丙基苯。
作为卤代烃，不论环状或非环状，也不论饱和或不饱和，都没有特殊的限制，一般优选使用非环状的。更优选的卤代烃是氯代烃、氟代烃，更优选的是氯代烃。此外，适合使用的是碳原子数是1-6个，优选碳原子数1-4个，更优选碳原子数1-2个。具体例子可列举例如：二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1,1,2-四氯乙烷、1,1,2,2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1,2-二氯丙烷、1,2,3-三氯丙烷、氯苯，1,1,1,2-四氟乙烷等。优选是二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、1,1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。更优选是二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1,1,1,2-四氟乙烷等。
作为脂肪酸酯类，没有特殊的限制，可列举例如丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。优选是乙酸酯、甲酸酯，更优选是乙酸酯。酯基没有特殊的限制，一般使用碳原子数1-8个的烷基酯、碳原子数7-12个的芳烷基酯，优选碳原子数1-6个的烷基酯，更优选碳原子数1-4个的烷基酯。
丙酸酯的具体例子可列举例如丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸异戊酯等。优选丙酸乙酯等。
乙酸酯的具体例子可列举例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲-丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸仲-己酯、乙酸环己酯、乙酸苄酯等。优选乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸仲-丁酯、乙酸戊酯、乙酸异戊酯、乙酸仲-己酯、乙酸环己酯等。更优选乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯等，最优选乙酸乙酯。
甲酸酯的具体例子可列举例如甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸异丙酯、甲酸丁酯、甲酸异丁酯、甲酸仲-丁酯、甲酸戊酯等。优选甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸异丁酯、甲酸戊酯等。最优选甲酸乙酯。
作为醚类，不论环状或非环状，也不论饱和或不饱和，都没有特殊的限制，一般优选使用饱和的。一般使用碳原子数3-20，优选碳原子数4-12，更优选碳原子数为4-8个的醚。具体例子可列举例如：二乙基醚、甲基叔-丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、二己基醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二
Figure BDA00002760776500151
烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇单甲基醚、乙二醇单乙基醚、乙二醇单丁基醚等。优选二乙基醚、甲基叔-丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、二己基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二
Figure BDA00002760776500152
烷、2-甲基呋喃、四氢呋喃、四氢吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇单甲基醚、乙二醇单乙基醚等。更优选二乙基醚、甲基叔-丁基醚、苯甲醚、二
Figure BDA00002760776500153
烷、四氢呋喃、乙二醇单甲基醚、乙二醇单乙基醚等。更优选二乙基醚、甲基叔-丁基醚、苯甲醚等，最优选甲基叔-丁基醚。
作为醇类，不论环状或非环状，也不论饱和或不饱和，都没有特殊的限制，一般优选使用饱和的。使用的碳原子数一般是1-20个，优选碳原子数1-12个，更优选碳原子数1-6个。其中，碳原子数1-5个的一元醇、碳原子数2-5个的二元醇、碳原子数为3个的三元醇是优选的。
作为这些醇类的具体例子，可列举例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、炔丙醇、苄醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等一元醇；1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇、1,5-戊二醇等二元醇；甘油等三元醇。
作为一元醇，优选是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、1-十二烷醇、苄醇、环己醇、1-甲基环己醇、2-甲基环己醇、3-甲基环己醇、4-甲基环己醇等。更优选的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、环己醇等。更优选的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特别优选的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇等，最优选是2-丙醇。
作为二元醇，优选是1,2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇等，最优选是1,2-乙二醇。三元醇优选是甘油。
脂肪酸类可列举例如甲酸、乙酸、丙酸等。优选是甲酸、乙酸，最优选是乙酸。
酮类没有特殊的限制，适合使用的是碳原子数3-6个。具体的例子可列举例如丙酮、甲基乙酮、甲基丁酮、甲基异丁酮等。优选是丙酮、甲基乙酮，最优选是丙酮。
作为腈类，不论环状或非环状，也不论饱和或不饱和，都没有特殊的限制，一般优选使用饱和的。使用的碳原子数一般是2-20个，优选碳原子数2-12个，更优选碳原子数2-8个。
具体的例子可列举例如：乙腈、丙腈、丙二腈、丁腈、异丁腈、丁二腈、戊腈、戊二腈、己腈、庚腈、辛腈、十一烷腈、十二烷腈、十三烷腈、十五烷腈、十八烷腈、氯乙腈、溴乙腈、氯丙腈、溴丙腈、甲氧基乙腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、甲苯基腈、苯基腈、氯苯基腈、溴苯基腈、氰基安息香酸、硝基苯基腈、茴香腈、酞菁、溴甲苯基腈、甲氰基安息香酸、甲氧基苯基腈、乙酰基苯基腈、萘甲腈、联苯腈、苯丙腈、苯丁腈、甲基苯基乙腈、二苯基乙腈、萘基乙腈、硝基苯基乙腈、氯苯乙腈、环丙腈、环己腈、环庚腈、苯基环己腈、甲苯基环己腈等。
优选是乙腈、丙腈、丁二腈、丁腈、异丁腈、戊腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、苄腈、苄基腈、氯丙腈，更优选是乙腈、丙腈、丁腈、异丁腈，最优选是乙腈。
作为除了腈类以外的含氮化合物类，可列举例如甲酰胺、N-甲基甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺类，或硝基甲烷、三乙胺、吡啶等。
含硫化合物类可列举例如二甲亚砜、环丁砜等。
上述有机溶剂中，优选考虑沸点、熔点、粘性等性质来进行选择。例如，就沸点而言，从可以进行为了提高溶解度的恰当加热，并且容易进行从湿体干燥去除溶剂或晶析滤液等中回收溶剂的观点考虑，沸点优选是在1个大气压下，约30-150℃的范围；就熔点而言，从在室温操作时和在室温以下冷却时难以凝固的观点考虑，熔点是约20℃以下，优选约10℃以下，更优选约0℃以下；就粘性而言，优选例如在20℃时约10Cp以下等较低的粘性。
在上述有机溶剂中，在从微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液提取回收脂溶性生理活性物质的目的中，从进行采用2相系统的液-液提取的观点考虑，优选使用疏水性有机溶剂或含有疏水性有机溶剂的溶剂作为提取溶剂。
作为在此情况下使用的疏水性有机溶剂，没有特殊的限制，可以使用上述有机溶剂中的完全不与水混溶的、形成2相系统的疏水性有机溶剂，优选使用烃类、脂肪酸酯类、醚类等疏水性有机溶剂，更优选烃类，更优选脂肪族烃类。在脂肪族烃类中，适合使用碳原子数5-8的烃。作为上述碳原子数5-8的脂肪族烃类的具体例子，可列举例如戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2,2-二甲基丁烷、2,3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2,3-二甲基戊烷、2,4-二甲基戊烷、辛烷、2,2,3-三甲基戊烷、异辛烷、环戊烷、甲基环戊烷、环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷等。特别优选的是己烷、庚烷、甲基环己烷，最优选的是己烷、庚烷。
在本发明的制备方法中，在表面活性剂的存在下进行提取，可以提高微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液与上述疏水性有机溶剂的亲和性，获得充分的提取效率；此外，作为提取时所用的有机溶剂，在上述疏水性有机溶剂的基础上，辅助性地组合使用亲水性有机溶剂，可以进一步地促进有机溶剂中的水性悬浮液更加微细化、提高静置时的高油水分离的稳定性，是更加优选的。
在本发明的制备方法中，作为与疏水性有机溶剂组合使用的亲水性有机溶剂，没有特殊的限制，可以使用上述有机溶剂中的亲水性的溶剂，优选是醇类。在醇类中，适合使用碳原子数1-5个的一元醇。其具体例子是例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特别优选的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，最优选的是2-丙醇。
在本发明的制备方法中，作为提取溶剂使用的疏水性有机溶剂的使用量，没有特殊的限制，相对于提取体系的总溶液(微生物细胞或该细胞破碎物的水性悬浮液、提取溶剂、非离子型表面活性剂等的混合溶液)体积，以提取时的浓度表示，优选在25-80体积%的范围内使用，更优选在50-75体积%的范围内使用。此外，上述的组合使用亲水性有机溶剂时的亲水性有机溶剂的使用量只要在可以维持2相体系的范围内即可，没有特殊的限制，相对于总溶液体积，优选在0.1-50体积%的范围内使用，更优选在0.1-10体积%的范围内使用，更优选在0.2-5体积%的范围内使用。就亲水性有机溶剂的使用量而言，即使是相对于总溶液的体积在0.2-2体积%这样少的量，也可以在本发明中发挥其效果。
在本发明的制备方法中，当组合使用亲水性有机溶剂和疏水性有机溶剂时，对各种溶剂的添加方法没有特殊的限制，可以将亲水性有机溶剂和疏水性有机溶剂进行恰当混合，然后作为提取溶剂使用，也可以在向微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中添加亲水性有机溶剂，然后再添加疏水性有机溶剂，也可以相反的操作。
在本发明的制备方法中，提取时的温度没有特殊的限制，一般可以在0-60℃，优选20-50℃的范围内实施。
作为提取方法，可以用分批提取、连续提取的任一种方法进行，在工业上，连续提取在生产性方面优选的，连续提取中的逆流多级提取是特别优选的。分批提取时的搅拌时间没有特殊的限制，一般是5分钟以上，连续提取时的平均滞留时间没有特殊的限制，一般是10分钟以上。
在本发明的制备方法中，通常，在实施了将微生物细胞或该细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂以及上述表面活性剂混合设定时间而提取后，静置这些的混合液，使其分离为水相和包含脂溶性生理活性物质的有机溶剂相，在油水界面的分离非常慢的情况下，可以使用离心机、连续离心机、液体旋风分离器(cyclone)等强制性分离。
采用上述本发明的制备方法，可以高效提取包含在微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中的脂溶性生理活性物质。本发明的制备法中的提取率通常是70%以上，更优选80%以上，更优选90%以上。
在本文中所述的提取率是指，相对于提取前的微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液中所含的脂溶性生理活性物质的总量，提取操作结束后的提取液中所含的脂溶性生理活性物质的量的比例，具体而言，可如下文所述实施例而求得。
在本发明的制备方法中，通过上述操作，可以从含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或微生物细胞破碎物中，通过将脂溶性生理活性物质提取到有机溶剂中而分离、回收脂溶性生理活性物质。所获得的含脂溶性生理活性物质的有机溶剂溶液可以直接利用，也可以继续施加常规纯化方法，进一步高度纯化。
例如，也可以用活性炭或白陶土等吸附剂纯化后，去除有机溶剂，作为含脂溶性生理活性物质的提取物或脂溶性生理活性物质的纯化物。此外，也可以施加通过常用的柱层析或液-液分配、其他的水或有机溶剂洗涤等纯化处理。需要说明的是，这些纯化处理可以单独进行，或多种组合进行。此外，必要时，还可以增加皂化、氧化、还原、其他合成反应处理等步骤。此外，还可以用结晶析出操作等，获得作为目标的脂溶性生理活性物质的晶体。
例如，在以辅酶Q10作为目标脂溶性生理活性物质的情况下，可以通过本发明的制备方法，从含有辅酶Q10的微生物细胞或其微生物细胞破碎物中，将辅酶Q10提取到有机溶剂中，将获得的含有辅酶Q10的提取液，用本身公知的方法纯化，获得辅酶Q10。例如，可以根据期望，使用活性炭或白陶土等吸附剂处理或柱层析等进行纯化，在其前后，根据需要进行氧化或还原处理，使用析出结晶的操作，获得高纯度辅酶Q10的结晶。
作为本发明的其他形态，列举了脂溶性生理活性物质的纯化方法，该方法包括：在选自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂和烷基醚型表面活性剂中的至少一种非离子型表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，提取脂溶性生理活性物质。各定义或条件等与上述列举的相同。
实施例
下文通过实施例更具体的说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
各实施例中的提取率如下计算。向进行提取前的含有辅酶Q10的微生物细胞破碎液1mL中，加入甲醇-氯仿(3：1)混合液至总量50mL，在25℃下搅拌30分钟后，固液分离菌体来源的固体物质，在下列HPLC条件下测量所获得的液层部分的辅酶Q浓度，计算包含在微生物细胞破碎液中的提取对象辅酶Q的量。同样的，在下列HPLC条件下测量提取操作后的提取液中的辅酶Q浓度，计算提取的辅酶Q的量，通过下式计算提取率。
提取率(%)＝提取液中所含的辅酶Q的重量/提取前的微生物细胞破碎液中所含的辅酶Q的重量×100
(HPLC分析条件)
柱：YMC-Pack4.6×250mm(YMC.Co.，LTD.生产)
流动相：甲醇/正己烷＝85/15
流速：1mL/分
检测：UV275nm
(实施例1)
使用10L培养基(蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L、葡萄糖20g/L、pH6.0)，将产生辅酶Q10的Saitoella complicata IFO10748株在25℃下好氧培养72小时。通过压力式匀浆器(Rannie公司生产)，在破碎压力80Mpa下破碎所获得的包含微生物菌体的培养液2次，制备含有辅酶Q10的微生物细胞破碎液。
向获得的微生物细胞破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62，ADEKA公司生产)至3.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与己烷70体积份混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，相对于混合液的总液量，提取残渣(下层的包含源自微生物的固体物质的水相部分)的体积比是0.37。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为90.8%。
(实施例2)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62，ADEKA公司生产)至1.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与己烷69体积份、2-丙醇1体积份混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣相对于总液量的体积比是0.33。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为92.5%。
(实施例3)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，加入聚醚多元醇型表面活性剂(Adecanol LG-126，ADEKA公司生产)至3.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.39。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为79.5%。
(实施例4)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，加入烷基醚型表面活性剂(Adekatol LA-775，ADEKA公司生产)至3.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.35。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为85.3%。
(实施例5)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，加入烷基醚型表面活性剂(Adekatol LA-1275，ADEKA公司生产)至0.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，然后通过离心机实施强制性油水分离。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为71.3%。
(实施例6)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，分别加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62，ADEKA公司生产)至1.3重量%、蔗糖硬脂酸酯(S-1670，三菱化学食品公司生产)至0.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.32。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为84.6%。
(实施例7)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，分别加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62，ADEKA公司生产)至1.3重量%、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物型表面活性剂(普朗尼克TR-702，ADEKA公司生产)至0.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.30。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为83.0%。
(实施例8)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中，分别加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62，ADEKA公司生产)至1.3重量%、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物型表面活性剂(普朗尼克TR-701，ADEKA公司生产)至0.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.31。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为89.9%。
(实施例9)
使用10L培养基(蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麦芽提取物3g/L、葡萄糖20g/L、pH6.0)，将产生麦角甾醇的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFO0309株在28℃下好氧培养72小时。通过压力式匀浆器(Rannie公司生产)，在破碎压力80Mpa下破碎所获得的微生物菌体2次，制备含有麦角甾醇的微生物细胞破碎液。
向获得的微生物细胞破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂(普朗尼克L-62、ADEKA公司生产)至3.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.35，收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，麦角甾醇的提取率是89.1%。
(比较例1)
将与实施例1相同制备的菌体破碎液30体积份和己烷70体积份混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.35，收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为60.2%。
(比较例2)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中加入溶血卵磷脂(Degussa公司生产)至0.7重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，由于油水分离没有进展，因此通过离心机实施强制性油水分离。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为62.2%。
(比较例3)
向与实施例1相同制备的菌体破碎液中加入聚乙烯醇(和光纯药公司生产)至3.3重量%的浓度，将30体积份的上述混合物与70体积份己烷混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.35，收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为61.9%。
(参考例)
将按与实施例1相同制备的菌体破碎液30体积份、己烷52体积份、2-丙醇18体积份的比例混合，在45℃下进行60分钟分批提取操作。在混合设定的时间后，静置，确认了有快速的油水分离，提取残渣与总液量的体积比是0.48，结果是所使用的提取溶剂向水相中移动的量非常多。收集分离的己烷相作为提取液，进行HPLC分析，辅酶Q10的提取率为91.5%。
表1中显示了实施例1-9、比较例1-3和参考例中的加入条件、脂溶性生理活性物质的提取率和提取残渣的体积比的结果。
上文详细的说明了本发明的各具体形态，本领域技术人员能够根据本发明的启示和优点，在实际上不脱离的范围内对所示的特定形态进行各种修饰和改变。因此，这些修饰和改变也全部包括在由后述权利要求范围所要求的本发明的精神和范围内。
本申请以在日本申请的特愿2010-164531为基础，其内容全文整合到本说明书中。

Claims (8)

1.脂溶性生理活性物质的制备方法，该方法包括：
在选自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂、蔗糖脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯类、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类、聚醚多元醇型表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚型表面活性剂和烷基醚型表面活性剂中的至少一种非离子型表面活性剂的存在下，将含有脂溶性生理活性物质的微生物细胞或其微生物细胞破碎物的水性悬浮液与有机溶剂混合，提取脂溶性生理活性物质。
2.权利要求1记载的制备方法，其中，脂溶性生理活性物质是辅酶Q10。
3.权利要求2记载的制备方法，其中，辅酶Q10是还原型辅酶Q10，或者是还原型辅酶Q10和氧化型辅酶Q10的混合物。
4.权利要求1-3中任一项记载的制备方法，其中，非离子型表面活性剂至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性剂。
5.权利要求1-4中任一项记载的制备方法，其中，相对于微生物细胞或微生物细胞破碎物的水性悬浮液，非离子型表面活性剂的添加量为0.01重量%以上。
6.权利要求1-5中任一项记载的制备方法，其中，有机溶剂是疏水性有机溶剂。
7.权利要求6记载的制备方法，其中，还组合使用了亲水性有机溶剂。
8.权利要求1-7中任一项记载的制备方法，其中，提取是连续提取。
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