CN103018226B - 一种检测芳香植物鲜花含油量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及芳香植物育种与产品深加工技术，旨在提供一种检测芳香植物鲜花含油量的方法。该方法是先充分抽提、蒸馏分离芳香植物鲜花中的精油，加入二甲基亚砜使其与精油互溶；利用尼罗红能与芳香植物鲜花精油结合并发出特异波长荧光的特性，于490nm光子激发下检测450～700nm的荧光发射光谱；将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测芳香植物鲜花样品中精油含量。本方法与传统的称量法相比，原料用量少，具有更高的灵敏度和简便性，省时省力，且可实现高通量测量，可为芳香植物鲜花育种、栽培、精油提取工艺等研发提供了必要的技术方法。
Description
技术领域
本发明涉及芳香植物育种与产品深加工技术，特别涉及芳香植物含油量的检测方法。
背景技术
芳香植物也称香料植物、芳香花草或香草，大部分生长在温暖地区，具有香味，部分和全部可用在料理、茶饮、花艺、工艺、保健、香料、染色及药用和造园等方面的多功能植物。据不完全统计，世界上芳香植物有80多个科3600多种， 而迄今为止被有效开发利用的只有400多种；我国已发现有开发利用价值的香料植物种类有60多科400多种，其中进行批量生产的天然香料品种已达100多种。薰衣草、代代、栀子、桂花树和中国水仙等绝大多数芳香植物的芳香物质都存在于它的鲜花中，且这些芳香物质的主要成分为油脂，这也是芳香植物中具开发利用价值的主要生物活性成分，因其含量少而珍贵，故通常称其为“精油”[陈金秀. 福建省芳香植物资源的分布及开发利用的对策.福建轻纺. 2004, 177(2): 7-14]。因此，培育精油含量高的芳香植物新品种、建立高得率的精油提取技术工艺，是当前国内外芳香植物鲜花精油领域研发的热点之一。但值得指出的是，当前测定芳香植物鲜花精油含量仍沿用传统方法，即将5~10公斤鲜花用水蒸气蒸馏，馏出液通过油水分离器分离获得精油馏分并称量，进而计算测得鲜花中精油的含量[单银花等, 芳香植物鲜花精油提取与纯化工艺研究进展. 精细与专用化学品. 2008, 16: 15-17]。这种方法因原料用量大、耗时费力，而难以满足以高产精油的芳香植物新品种选育及高效提取技术工艺研制的实际需求。因此，迫切需要建立一种快速、微量测定芳香植物鲜花精油含量的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种快速检测芳香植物鲜花中精油含量的微量方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种检测芳香植物鲜花精油含量的方法：先用液氮和石英沙将芳香植物鲜花充分研细，加入蒸馏水和二甲基亚砜（DMSO）后进行超声处理及加热回流，使芳香植物鲜花中的精油充分抽提至二甲基亚砜水溶液中，再通过蒸馏方式将精油分离出来，获得精油与蒸馏水的混合液，并加入二甲基亚砜使其与精油互溶；利用尼罗红能与芳香植物鲜花精油结合并发出特异波长荧光的特性，在含精油的二甲基亚砜水溶液中加入足量的尼罗红，于490 nm光子激发下检测450～700 nm的荧光发射光谱，并获得被测芳香植物鲜花精油-尼罗红产物的特征峰（λC）及其荧光发射光强度（I）；将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测芳香植物鲜花样品中精油含量。
本发明具体包括以下步骤：
（1）称取5～10 g芳香植物鲜花放入陶瓷研钵中，加入石英沙和液氮，并用研杵将芳香植物鲜花研磨成细泥；
（2）将芳香植物鲜花细泥转至圆底离心管中，加入10 ml蒸馏水和1ml二甲基亚砜并混匀；在冰浴条件下以超声波处理60 s；
（3）将超声波处理后的样品转至圆底蒸馏烧瓶中，加入15 ml蒸馏水并摇匀后安装至冷凝回流器上；置100℃水浴中冷凝回流2 h后，停止加热继续通冷却水，使系统冷却至室温；
（4） 卸下带试样的圆底蒸馏烧瓶，将其安装到具冷凝管的蒸馏提取器上，置100℃水浴中蒸馏，冷凝管通冷却水，用25 ml容量瓶收集馏分，当馏分达20 ml时，停止蒸馏；
（5）在制得的馏分中依次加入二甲基亚砜1 ml和25 μg/mL的尼罗红溶液1 ml，并用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测450-700 nm的荧光发射光谱，并获得被测芳香植物鲜花精油-尼罗红产物的特征峰（λC）及其荧光发射光强度（I）；
同时，在20 ml蒸馏水中依次加入二甲基亚砜1 ml和25 μg/mL的尼罗红溶液1 ml，并用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测特征波长λC处的荧光发射光强度（IB），以此为对照；
待测芳香植物鲜花中精油的相对荧光强度值IS=I-IB；
（6）分别在5只25 ml容量瓶中加入20 ml蒸馏水和1 ml 二甲基亚砜，再分别加入0、2.5、5、7.5、10 mg三油酸甘油酯，混匀后各加入25 μg/mL的尼罗红溶液1 ml，并分别用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min；以未加三油酸甘油酯的为对照，利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测584 nm的相对荧光发射光强度值（IR），以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、IR为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到线性拟合方程IR=f(m)；
（7）以步骤（5）中测得芳香植物鲜花中精油的相对荧光强度值IS替代步骤（6）线性拟合方程IR=f(m)中的IR，通过计算即可行知步骤（1）中所秤取的芳香植物鲜花中精油的质量m，其单位为mg；进而可算得待测芳香植物鲜花鲜花中的精油含量CR=(m/M)×0.001。
本发明中，所指芳香植物鲜花可以是薰衣草、代代、栀子、桂花树和中国水仙等的鲜花。
本发明中，设定超声波发生仪频率为20 kHz，发射功率为150 W，变幅杆伸至样品液面下2 cm，以2 s开/ 1 s关的间歇执行超声波处理。
本发明中，25 μg/mL的尼罗红溶液配制方法为，称取2.5 mg尼罗红，用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至100 ml。
与现有技术相比，本发明的显著优点：
本方法是用光度法检测芳香植物鲜花精油含量，与传统的称量法相比，原料用量少，具有更高的灵敏度和简便性，省时省力，且可实现高通量测量，可为芳香植物鲜花育种、栽培、精油提取工艺等研发提供了必要的技术方法。
具体实施方式
尼罗红（9-(diethylamino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one）是一类亲脂性的噁嗪类染料，它能与芳香植物鲜花中的油脂结合并发出特异波长的荧光，因而在尼罗红足量的前提下，通过测定荧光强度值即可表征被测样品的脂质含量。本发明方法先用液氮和石英沙将芳香植物鲜花充分研细，再加入具“万能溶剂”之称的二甲基亚砜后超声及加热回流，其目的是让鲜花中的精油充分抽提至溶剂中，便于蒸馏出来。同时，在尼罗红染色荧光检测体系中加入二甲基亚砜是让精油能充分溶于水剂中，以便精油能与尼罗红充分结合生成荧光产物。本方法用光度法的原理与技术方法检测芳香植物鲜花精油含量，比传统的称量法具更高的灵敏度、重复性和简便性，且可实现高通量测量。
下面通过具体实施例子，对本发明的实现方式进行详细描述。
本发明的技术方案可以通过以下步骤实现：
1、选用样本材料：为公知的代代（Citrus aurantium car.amara）花、薰衣草（lavandula pedunculata）、栀子（Gardenia jasminoides）、桂花树（Osmanthus fragrans）和中国水仙（Narcissuspseudonarcissus），这些芳香植物品种在我国大部分地区，特别是南方有广泛栽培，在发明人所在的浙江大学芳香植物研发基地也有大量栽培，可按需提供鲜花样本。
2、试剂和仪器：本发明中所用的尼罗红（NR）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、三油酸甘油酯标准品均为美国Sigma 公司产品，丙酮等为国产，均为分析纯；JY92-II型超声波发生仪由宁波新芝生物科技股份有限公司生产；冷凝回流器、具冷凝管的蒸馏提取器由常熟市德顺化工设备公司生产；TE214S型电子天平为北京赛多利斯产品；RF-5301PC型荧光分光光度计为日本岛津产品。
3、测定芳香植物鲜花精油含量的步骤如下：
（1）先将采自浙江大学芳香植物研发基地的各种待测芳香植物鲜花分别剪成大小不超过5×5 mm的碎片，用电子天平分别称取的代代花5.1 g、薰衣草花8.4 g、栀子花6.7 g、桂花5.3 g和中国水仙花9.8 g，分别放入100 ml的陶瓷研钵中并加入2 g石英沙；
按以下步骤（2）-（7）分别对5种芳香植物鲜花样品进行操作：
（2）研钵中分别加入30 ml液氮，并及时用研杵将芳香植物鲜花轻轻敲碎，再加入30 ml液氮并及时用研杵将芳香植物鲜花研磨成细泥；
（3）将芳香植物鲜花细泥分别转至25 ml的圆底离心管中，加入10ml蒸馏水1 ml二甲基亚砜并混匀，在冰浴条件下，设定超声波发生仪频率为20 kHz，发射功率为150 W，变幅杆伸至样品液面下2 cm，以2 s / 1 s (开/关) 间歇处理样品60 s；
（4）将超声波处理后的芳香植物鲜花样品转至100 ml的磨口圆底蒸馏烧瓶中，加入15 ml蒸馏水并摇匀后安装至冷凝回流器上；
（5）置100℃水浴中冷凝回流2 h后，停止加热并继续通自来水将系统冷却至室温；
（6）从冷凝回流器上卸下带试样的磨口圆底蒸馏烧瓶，将其装到具冷凝管的蒸馏提取器上，置100℃水浴中蒸馏，冷凝管通自来水冷却，用25 ml容量瓶收集馏分，当馏分达20 ml时，停止蒸馏；
（7）在制得的馏分中依次加入二甲基亚砜1 ml和25 μg/mL的尼罗红溶液（称取2.5 mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至100 ml。）1 ml，并用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，再利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测450-700 nm的荧光发射光谱，并获得被测芳香植物鲜花精油-尼罗红产物的特征峰（λC）及其荧光发射光强度（I）；同时，在20 ml蒸馏水中依次加入二甲基亚砜1 ml 和 25 μg/mL的尼罗红溶液1ml，并用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，进而利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测特征波长λC处的荧光发射光强度（IB），以此为对照；芳香植物鲜花中精油的相对荧光强度值IS=I-IB。
（8）分别在5只25 ml容量瓶中加入20 ml蒸馏水和1 ml 二甲基亚砜，再分别加入0、2.5、5、7.5、10 mg三油酸甘油酯，混匀后各加入25 μg/mL的尼罗红溶液（称取2.5 mg尼罗红并用5 ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至100 ml。）1 ml，并用蒸馏水定容至25 ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10 min，进而以未加三油酸甘油酯的为对照，利用荧光分光光度计于490 nm光子激发下检测565 nm的相对荧光发射光强度值（IR），以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、IR为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到线性拟合方程IR=f(m)；
（9）以步骤（7）中测得5种芳香植物鲜花精油的相对荧光强度值IS替代步骤（8）线性拟合方程IR=f(m)中的IR，通过计算即可分别求得步骤（1）中所称M克芳香植物鲜花中精油的质量m（单位为mg）；
（10）待测芳香植物鲜花中精油含量CR=(m/M)×0.001。
4、结果与分析
根据实验结果，以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、IR为纵坐标，所得标准曲线的线性拟合方程IR=81.64m，相关系数（R2）为0.998，实验测得采自浙江大学芳香植物研发基地的5.3 g代代花、8.5 g薰衣草花、6.4 g栀子花、5.2 g桂花和9.8 g中国水仙花的精油-尼罗红产物特征峰λC依次在568、574、578、565和575 nm处，相对荧光强度值IS依次为8744、5486、18597、11249和1604，以它们替代线性拟合方程IR=81.64m中的IR，计算得到对应的精油质量依次为0.107、0.067、0.228、0.138和0.020 g，因此它们的精油含量依次为2.02%、0.79%、3.56%、2.65%和0.20%。同时，用传统称量法测上述代代花、薰衣草花、栀子花、桂花和中国水仙花的精油含量依次为1.97%、0.76%、3.61%、2.60%和0.19%。可见，新建方法与传统方法所得的测量结果相吻合。
作为验证的实例，我们分别选取栽培于杭州植物园公知的两种芳香植物——白玉兰（Magnolia denudata）和含笑（Magnoliaceae）的鲜花为试验材料，利用本发明方法测得它们的精油含量依次为0.21%和0.46%，而用传统称量法测得的结果依次为0.22%和0.45%。该例子进一步说明本发明建立的快速测定芳香植物鲜花精油含量的方法是可行的。
Claims (4)
1.一种检测芳香植物鲜花精油含量的方法，其特征在于，该方法是：
先用液氮和石英沙将芳香植物鲜花充分研细，加入蒸馏水和二甲基亚砜后进行超声处理及加热回流，使芳香植物鲜花中的精油充分抽提至二甲基亚砜水溶液中，再通过蒸馏方式将精油分离出来，获得精油与蒸馏水的混合液，并加入二甲基亚砜使其与精油互溶；利用尼罗红能与芳香植物鲜花精油结合并发出特异波长荧光的特性，在含精油的二甲基亚砜水溶液中加入足量的尼罗红，于490nm光子激发下检测450～700nm的荧光发射光谱，并获得被测芳香植物鲜花精油-尼罗红产物的特征峰(λC)及其荧光发射光强度(I)；将所得结果与空白样本进行比较后，再与油脂标准品——三油酸甘油酯的荧光发射光强度曲线进行比较，通过对应的光强度值得到被测芳香植物鲜花样品中精油含量；
该方法具体包括以下步骤：
(1)称取5～10g芳香植物鲜花放入陶瓷研钵中，加入石英沙和液氮，并用研杵将芳香植物鲜花研磨成细泥；
(2)将芳香植物鲜花细泥转至圆底离心管中，加入10ml蒸馏水和1ml二甲基亚砜并混匀；在冰浴条件下以超声波处理60s；
(3)将超声波处理后的样品转至圆底蒸馏烧瓶中，加入15ml蒸馏水并摇匀后安装至冷凝回流器上；置100℃水浴中冷凝回流2h后，停止加热继续通冷却水，使系统冷却至室温；
(4)卸下带试样的圆底蒸馏烧瓶，将其安装到具冷凝管的蒸馏提取器上，置100℃水浴中蒸馏，冷凝管通冷却水，用25ml容量瓶收集馏分，当馏分达20ml时，停止蒸馏；
(5)在制得的馏分中依次加入二甲基亚砜1ml和25μg/mL的尼罗红溶液1ml，并用蒸馏水定容至25ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10min，再利用荧光分光光度计于490nm光子激发下检测450～700nm的荧光发射光谱，并获得被测芳香植物鲜花精油-尼罗红产物的特征峰(λC)及其荧光发射光强度(I)；
同时，在20ml蒸馏水中依次加入二甲基亚砜1ml和25μg/mL的尼罗红溶液1ml，并用蒸馏水定容至25ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10min，进而利用荧光分光光度计于490nm光子激发下检测特征波长λC处的荧光发射光强度(IB)，以此为对照；
待测芳香植物鲜花中精油的相对荧光强度值IS＝I-IB；
(6)分别在5只25ml容量瓶中加入20ml蒸馏水和1ml二甲基亚砜，再分别加入0、2.5、5、7.5、10mg三油酸甘油酯，混匀后各加入25μg/mL的尼罗红溶液1ml，并分别用蒸馏水定容至25ml，充分混匀后于黑暗中40℃染色10min；以未加三油酸甘油酯的为对照，利用荧光分光光度计于490nm光子激发下检测584nm的相对荧光发射光强度值(IR)，以三油酸甘油酯加入量m为横坐标、IR为纵坐标，作两者的标准曲线，并得到线性拟合方程IR＝f(m)；
(7)以步骤(5)中测得芳香植物鲜花中精油的相对荧光强度值IS替代步骤(6)线性拟合方程IR＝f(m)中的IR，通过计算即可行知步骤(1)中所称取的芳香植物鲜花中精油的质量m，其单位为mg；进而可算得待测芳香植物鲜花鲜花中的精油含量CR＝(m/M)×0.001，M为芳香植物鲜花的质量，单位为g。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所指芳香植物鲜花是薰衣草、代代、栀子、桂花树或中国水仙的鲜花。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，设定超声波发生仪频率为20kHz，发射功率为150W，变幅杆伸至样品液面下2cm，以2s开/1s关的间歇执行超声波处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，25μg/mL的尼罗红溶液配制方法为，称取2.5mg尼罗红，用5ml丙酮溶解，再用蒸馏水定容至100ml。
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