CN103004601A - 一种化血胆组织培养快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种化血胆组织培养快速繁殖的方法，特别是一种野生药用植物化血胆［Melasma arvense (Benth.) Hand.-Mazz. ］组织培养快速繁殖的方法。属野生药用植物种苗繁殖技术领域。本发明方法包括外植体选择消毒、诱导增殖培养、生根培养三个阶段，具有繁殖率高、繁殖速率快等优点，解决了化血胆繁殖率低、种子育苗困难、生长缓慢等问题，可以在短时间内提供大量种苗。本发明提供了一种工厂化大规模提供化血胆成品苗快速繁殖的方法，满足了中药资源开发的迫切需要。
Description
技术领域：
本发明涉及一种化血胆组织培养快速繁殖的方法，特别是一种利用野生药用植物化血胆［Melasma arvense (Benth.) Hand.-Mazz. ］茎枝进行组织培养快速繁殖的方法。属野生药用植物种苗繁殖技术领域。
背景技术：
化血胆为玄参科植物黑蒴[Melasma arvense (Benth.) Hand.-Mazz.]的根，系多年生草本植物，主要分布于云南省南部地区，为云南省苗族、彝族、拉祜族等民族民间珍稀药材，云南多家医院主要用于治疗白血病、肿瘤、心脑血管病、黄疸型肝炎、肝肿大、跌打伤瘀肿、痛经等疾病。化血胆具有可开发为治疗早期白血病、抗肿瘤和化血、溶血特效药品的潜力。长期以来，化血胆药材来源全部依赖于野生植物资源，随着天然药品市场的需求量与日俱增，化血胆野生资源受到严重破坏，目前野生资源已经很难找到。
化血胆地域分布狭窄，种子自然萌发率极低（小于0.3%），利用种子直播育苗困难，加之近年来掠夺式过度采挖，目前全草鲜品已经超过4000元/公斤，处于有价无货，极度珍稀、濒临灭绝。急需对其进行资源保护和人工种苗快速繁殖技术研究。
经文献检索，还未见到任何有关化血胆种苗快速繁殖、种子萌发、野生资源调查、人工种植等公开发表的内容。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种利用化血胆茎枝进行组织培养快速繁殖的方法。本方法通过外植体的选择消毒、增殖培养、生根培养等到技术环节的调控，能有效实现化血胆组织培养快速繁殖。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种化血胆［Melasma arvense (Benth.) Hand.-Mazz. ］组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包含下列步骤：
A.外植体的选择和消毒：
剪取化血胆生长旺盛的紫色/红色带节嫩茎枝，清洗、消毒后去除叶片，带入无菌操作台。用75%乙醇浸泡5S，快速取出后用无菌水清洗2次，再将茎枝放入2%次氯酸钠溶液中浸泡5min，取出后用无菌水清洗3次，用剪刀将取枝条剪切成带节小茎段，接种于诱导增殖培养基上。
B.诱导增殖培养：
诱导增殖培养基成分为1/2MS+6-BA0.5mg/L+Pt50g/L+Bn80g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂,培养基pH值为5.8～6.0；诱导培养条件为光照强度1500-2000lx，光照10h/d，温度22～24℃；在诱导培养基培养5～10d后，节上会出现大量分枝，待芽枝长到5～10cm，切取芽枝在相同培养条件下连续培养，可实现不断增殖。
C．生根培养：
切取2～3cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上；生根培养基成分为1/2MS+NAA0.1mg/L+Pt30g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂+0.2g/L活性炭,培养基pH值为5.8～6.0；生根培养条件为光照强度2000～3000lx，光照12h/d，温度22～24℃；在生根培养基培养40～60d后可成苗。
本发明的优点在于：通过采用外植体选择消毒、诱导增殖培养、生根培养相结合的配套技术，能通过化血胆组织培养实现种苗快速繁殖。
本发明属首次进行化血胆组织培养成果，本发明技术方法简单，成本较低，便于操作，适宜于实际生产应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，本发明用具体实例对外植体的选择处理、诱导增殖培养和生根培养等技术的研究筛选过程进行了充分的说明，以证明本研究成果的正确性，但并非说明本发明仅限用于这些例子。
不同外植体的选择研究
为了研究化血胆不同器官培养的效果，选择出最佳的培养材料。本研究分别采用化血胆的叶片、休眠芽、根、带节嫩茎枝、果实未开裂的成熟种子、未成熟种子为外植体。各种外植体采取用75%乙醇浸泡5～8S，快速取出后用无菌水清洗2次，再放入2%次氯酸钠溶液中浸泡8-15min，取出后用无菌水清洗3次，然后接种于MS+6-BA1.0mg/L+Pt150g/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，叶、芽、根和茎枝每瓶接种3个，种子每瓶按100粒；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度22℃下培养，40d时观察比较各处理的萌发时间、萌发率和新芽生长情况。
通过试验比较发现：化血胆带节嫩茎芽作为外植体培养效果最好，表现为萌发时间最短，萌发数量最多，40 天左右萌发的新芽可达20～22mm；休眠芽和成熟种子虽然能萌发，但表现为萌发速度较慢、萌发率较低、萌发后芽的生长速度较慢；叶片、根和未成熟种子都未萌发；各处理有显著差异。研究结果表明化血胆的带节嫩茎枝为最佳接种外植体。
表1化血胆不同器官培养萌发情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中不同基本培养基的筛选研究
为了筛选出化血胆带节嫩茎枝培养中最佳基本培养基种类。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，分别以采取了MS、1/2MS、B5三种不同基本培养基，二种的6-BA浓度（2.0mg/L、1.0mg/L）进行培养。在各处理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2～3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度22℃下培养，20d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现各处理差异著；处理3结果最佳，表现为接种后5～7天就开始萌发，同时萌发后的茎枝节上腋芽开始萌动侧枝，接种20d主枝平均长到时3～4cm，增殖明显；其次为处理1、4和5，虽然能萌发，但与处理3相比，萌发时间延迟，同时萌发芽数量较少，新芽生长速度慢，增殖不明显；处理2和处理6未能萌发。研究结果表明1/2MS可作为化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养的最佳基本培养基。
表2 不同基本培养基对化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中细胞分裂素种类和浓度的筛选研究
为了筛选出化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养中最佳细胞分裂素种类和浓度。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，以1/2MS为基本培养基，选择3种不同的细胞分裂素种类（6-BA、KT、ZT），3种不同浓度（1.5mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L）进行培养。在各处理中都添加相同的Pt150g/L+25g/L蔗糖+6g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度22℃下培养，20d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现各处理差异著；处理1萌发增殖效果最佳，表现为接种后3～7天就开始萌发，同时萌发后的茎枝节上腋芽开始萌动侧枝，接种单茎萌发数可达6～8个，接种20d主枝平均长到时6～7cm，为侧枝增殖非常明显；其次为处理2、4和7，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理1相比，同时萌发芽数量减少，新芽生长速度减慢；其余处理萌发增殖效果较差。研究结果表明化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养基配方中最佳的细胞分裂素种类为6-BA,其较适宜的浓度为0.5 mg/L。
表3 不同细胞分裂素对化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝诱导增殖培养培养的最佳添加有机物的筛选研究
为了摸清化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养的最适宜的有机添加物种类。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，选择5种不同有机添加物（椰子汁、香蕉泥、马铃薯汁、苹果汁、香蕉泥马铃薯汁混合）种类进行培养，每种有机添加物的量为130g/L。在各处理中都添加相同的1/2MS+6-BA0.5mg/L +25g/L蔗糖+8g/L琼脂,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照10h/d，温度22℃下培养，20d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现，处理1和4萌发增殖效果最佳，二者无显著差异，表现为接种后3～7天就开始萌发，接种单茎萌发数可达8～10个，接种20d主枝平均长到时7～8cm，为侧枝增殖非常明显；其次为处理1和3，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理1相比，同时萌发芽数量减少，新芽生长速度减慢；再次为3，虽然也表现出一定的萌发增殖效果，但萌发芽数量和新芽生长速度都减慢，说明浓度过高的马铃薯会表现出一定的抑制性；所有处理中，处理5效果最差，说明带节嫩茎枝诱导增殖培养中添加苹果，效果不佳。研究结果表明，椰子汁和香蕉+马铃薯作为化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养的最适宜添加的有机物，但综合考虑材料来源、价格、成本等因素，选择香蕉和马铃薯混合添加最佳。
表4 不同有机添加物对化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝诱导增殖培养培养条件的研究
为了摸清化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养最适宜的培养条件。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，设置5种不同的培养温度（18℃、20℃、22℃、24℃、26℃）、2种光照强度（1500～2000lx、2500～3000lx）进行培养。在各处理中都添加相同培养基1/2MS+6-BA0.5mg/L+Pt50g/L+Bn80g/L+25g/L蔗糖+8~10g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后都在光照10h/d，20d时观察比较各处理的萌发时间、萌发情况和芽的生长情况。
通过比较发现，处理5和处理7萌发增殖效果最佳，单茎平均增殖数和芽生长显著高于其它处理，表现为接种后3-7天就开始萌发，接种单茎萌发数可达8-10个，接种20d主枝平均长到时7-8cm；其次为处理6、8、3和4，也表现出较好萌发增殖效果，但与处理5相比，同时萌发芽数量减少，出现丛生芽，且新芽生长速度减慢，少数会出现新稍枯黄；效果最差为1和2处理，虽然也能增殖萌发，但萌发芽数量和新芽生长速度显著低于其它处理。由以上结果说明低血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养，其最佳培养温度为22～24℃，其最适应的光照强度为1500～2000LX，温度过高或过低，光照过强也会显著抑制芽的诱导增殖效果。
表5 不同培养条件对化血胆嫩茎枝诱导增殖培养中芽的萌发情况比较
9注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆生根培养中生长素种类和浓度的筛选研究
为了筛选出化血胆带节嫩茎枝生根培养中最佳生长素种类和浓度。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，设置3种不同的生长素种类（2,4-D、NAA、IAA），4种不同浓度（0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L）进行培养。在各处理都添加相同1/2MS+Pt50g/L+Bn80g/L+25g/L蔗糖+0.2g/LCN+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500～2000lx，光照12h/d，温度22℃下培养，40d时观察比较各处理的发根时间、发根数、根系长度和苗的生长情况。
通过比较发现，处理5和处理6生根培养殖效果最佳，表现为接种后20-30天就开始生根，平增多生根条数5-7条，根长可达1-3cm，植株整体表为生长较快，分枝多，茎杆较粗呈紫红色，根系较粗，二者平均生根时间和平均根长无显著差异，而根的条数处5显著高于处理6；生根培养较果较好的处理为10和11，但其生根培养效果显著低于最佳的处理5和处理6，表现为平均生根时间推迟，根的条数减少，平均根较短，植物整体表现为生长较慢、分枝少、叶色淡、茎细呈绿色、根系弱；在所有处理中处理1、2、3、4生根培养效果最差，说明2,4-D不太适宜作为化血胆生根培养的添加生长素类型。研究结果表明化血胆生根培养基配方中最佳的生长素种类为NAA,其较适宜的浓度为0.1 mg/L。
表6 不同生长素对化血胆嫩茎枝生根培养情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝生根培养的最佳有机添加物的筛选研究
为了摸清化血胆带节嫩茎枝生根培养的最适宜的有机添加物种类。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，选择4种不同有机添加物（香蕉泥、马铃薯汁、香蕉泥50g/+马铃薯汁80g、香蕉泥30g/+马铃薯汁100g）种类进行培养，每种有机添加物的量为130g/L。在各处理都添加相同1/2MS+NAA0.1mg/L+25g/L蔗糖+0.2g/LCN+8g/L琼脂，培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500-2000lx，光照12h/d，温度22℃下培养，40d时观察比较各处理的发根时间、发根数、根系长度和苗的生长情况。
通过比较发现，处理4生根培养殖效果最佳，表现为接种后20-30天就开始生根，平增多生根条数5-8条，根长可达1-3cm，植株整体表为生长较快，分枝多，茎杆较粗呈紫红色，根系较粗，其根的条数和平均根长显著好于其它处理；生根培养较果较好的处理为1和3，但其生根培养效果显著低于最佳的处理4，表现为平均生根时间推迟，根的条数和平均根长显著低于处理4，但植物整体表现与处理4差异不明显；在所有处理中处理2生根培养效果最差，说明化血胆生根培养中有机添加物单独使用马铃薯，会对显著抑制生根效果。研究结果表明化血胆生根培养基配方中最佳有机添加物为香蕉和马铃薯混合使用，建议采用较多的香蕉加入少量的马铃薯。
表7 不同有机添加物对化血胆嫩茎枝生根培养情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
化血胆嫩茎枝生根培养的最佳培养光照时间的筛选研究
为了摸清化血胆带节嫩茎枝生根培养的最适宜光照时间。本研究以带节嫩茎枝为接种材料，在设置5种不同光照时间（8、10、12、14、16）种类进行培养，各处理培养基都为1/2MS+NAA0.1mg/L+Pt30g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂+0.2g/L活性炭,培养基pH值为5.8；每处理接种5瓶，每瓶接种3个2-3cm带2个节嫩茎枝；接种后的材料在光照强度1500-2000lx，温度22℃下培养，40d时观察比较各处理的发根时间、发根数、根系长度和苗的生长情况。
通过比较发现，处理3、4和5生根培养殖效果最佳，表现为接种后20-30天就开始生根，平增多生根条数6-8条，根长可达1-2cm，植株整体表为生长较快，分枝多，茎杆较粗呈紫红色，根系较粗，苗较壮，其生根培养效果显著好于其它处理，但三者无显著差异；生根培养效果较好的处理为2，但其生根培养效果显著低于最佳的处理3、4和5，表现为根的条数和平均根长显著减少，植株生长缓慢，分枝少，茎较细；在所有处理中处理1生根培养效果最差，表现为生长慢，分枝少，茎细，苗较弱。研究结果表明化血胆生根培养培养阶段需要较长的光照时间，适宜光照时间为12～16 h/d，因考虑成本的问题，建议化血胆生根培养光照时间12 h/d较为适宜。
表8 不同有机添加物对化血胆嫩茎枝生根培养情况比较
注: 同一列上不同的字母,分别表示在P<0.05水平上的差异显著性；表中数据为5个重复的平均数。
本发明提供了一种利用化血胆茎枝，进行组织培养快速繁殖的方法。对于保护野生化血胆资源，提高繁殖系数，促进化血胆资源可持续利具有现实意义。
Claims (3)
1.一种化血胆组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包含下列步骤：
A.外植体的选择和消毒：剪取化血胆生长旺盛的带节嫩茎枝，清洗、消毒后去除叶片，带入无菌操作台；用75%乙醇浸泡5S，快速取出后用无菌水清洗2次，再将茎枝放入2%次氯酸钠溶液中浸泡5min，取出后用无菌水清洗3次，用剪刀将取枝条剪切成带节小茎段，接种于诱导增殖培养基上；
B.诱导增殖培养：诱导增殖培养基成分为1/2MS+6-BA0.5～1.0mg/L+Pt50g/L+Bn80g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂,培养基pH值为5.8～6.0；诱导培养条件为光照强度1500-2000lx，光照10h/d，温度22～24℃；在诱导培养基培养5～10d后，节上会出现大量分枝，待芽枝长到5～10cm，切取芽枝在相同培养条件下连续培养，可实现不断增殖；
C．生根培养：切取2～3cm生长健壮的新梢转接到生根培养基上；生根培养基成分为1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+Pt30g/L+Bn100g/L+25g/L蔗糖+8～10g/L琼脂+0.2g/L活性炭,培养基pH值为5.8～6.0；生根培养条件为光照强度2000～3000lx，光照12h/d，温度22～24℃；在生根培养基培养40～60d后可成苗。
2.根据权利要求1所述的化血胆组织培养快速繁殖的方法，其特征在于所述步骤（A）中化血胆茎枝为带节嫩茎枝为最佳接种外植体，其作为化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养的最佳诱导增殖培养基为1/2MS培养基。
3.根据权利要求1所述的化血胆组织培养快速繁殖的方法，其特征在于化血胆带节嫩茎枝诱导增殖培养基配方和生根培养基配方。
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