CN102998441A - 快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液和显色液，或生物标志物标准液、反应液、探测液。可在一次试验中同时检测Oct4、Sox2、Nanog和LIN28，或Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4多潜能干细标志物,从而实现快速鉴定多潜能干细胞(iPS细胞)。本发明由于能在同试验中同时检测多个诱导性多潜能干细胞标志物，使得所测得的各标志物的表达量及其比例关系更具可比性,因此能更准确地用于鉴别或鉴定多潜能干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测干细胞的试剂盒,尤其涉及一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒。
背景技术
干细胞(stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源，其最显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力，又有多向分化的潜能。胚胎干细胞(ES)来源于受精卵发育分化的胚胎内细胞团或原始生殖脊一种多能细胞系，它具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，从而可以进一步形成机体的任何组织或器官。
有关ES细胞和治疗性克隆的研究一直存在激烈的伦理学争论，近年来国外学者通过体细胞体外基因转染技术建立诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPS细胞)系。日本京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心长山中伸弥与英国发育生物学家约翰··戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献，因此获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。山中伸弥是诱导多功能干细胞(iPS cell)创始人之一。2007年，他的研究团队通过对小鼠的实验，发现诱导人体表皮细胞使之具有胚胎干细胞活动特征的方法。此方法诱导出的干细胞可转变为心脏和神经细胞，为研究治疗目前多种心血管绝症提供了巨大助力。这一研究成果在全世界被广泛应用，因为其免除了使用人体胚胎提取干细胞的伦理道德制约。诱导多能干细胞(iPS细胞)的研究成果在干细胞研究领域中无疑是具有里程碑意义的突破，多种体细胞经过体外的培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞，并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态，从而阐明了细胞的巨大可塑性。由于iPS细胞研究不再使用人类早期胚胎，故卵母细胞来源的难题得到了合理的解决，伦理学的争论将随之平息，自体iPS细胞来源的细胞移植给患者自身也将使免疫排斥反应的难题迎刃而解。
研究证实采用体外导入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4个转录因子可将小鼠体细胞直接重构成为ES细胞样的多潜能细胞,因此，这类细胞被命名为诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)。同样，转染上述因子或Oct4、Sox2、Nanog、LIN28等4个因子也能够使人类体细胞重构为iPS细胞，后者与人类ES细胞的基本特征相似。
干细胞的鉴定尤其是成体干细胞鉴定是干细胞研究领域的一个难题，目前，对很多种成体干细胞并没有一个一致的鉴定标准。但在诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的鉴定方面,采用标志物Oct4、Sox2、Nanog和LIN28来鉴定人诱导性多潜能干细胞，用标志物Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来鉴定小鼠诱导性多潜能干细基本上在本领域得到了公认。然而，目前对这些生物标志物的检测是分开进行的，这不仅耗费时间，而且各标志物之间的定量关系不能准确地得到反映。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种可在一次试验中同时检测全部多潜能干细标志物,从而实现快速鉴定多潜能干细胞(iPS细胞)的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液和显色液。
一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、生物标志物标准液、反应液、亲和素探测液、样品稀释液、洗涤液和显色液。
所述的检测板是固定了Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原为所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
所述含有Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物的抗原组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内。
所述含有Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上人生物标志物的抗原被分别包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
所述检测板是固定了任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体的固相；所述固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片用玻片或塑胶片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内，所述包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
所述含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体被分别包被在同一个酶标盘或分开酶标盘的不同的反应槽内；所述包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
所述检测板固定了Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原是所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内。
含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原被分别包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
所述检测板是固定了含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
含有任何两种及以上识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内；所述预包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体被分别包被在同一个酶标盘或分开酶标盘的不同的反应槽内；所述的预包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
本发明的有益效果是：可在一次试验中同时检测多个或诱导性多潜能干细胞标志物,从而实现快速鉴定多潜能干细胞(iPS细胞)。本发明由于能在同试验中同时检测多个诱导性多潜能干细胞标志物，使得所测得的各标志物的表达量及其比例关系更具可比性,因此能更准确地用于鉴别或鉴定多潜能干细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液和显色液。
本发明的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、生物标志物标准液、反应液、亲和素探测液、样品稀释液、洗涤液和显色液。
所述的检测板是固定了Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原为所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
所述含有Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物的抗原组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内。
所述含有Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上人生物标志物的抗原被分别包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
所述检测板是固定了任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体的固相；所述固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
所述含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内，所述包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
所述含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体被分别包被在同一个酶标盘或分开酶标盘的不同的反应槽内；所述包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
所述检测板固定了Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原是所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内。
含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原被分别包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
所述检测板是固定了含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
含有任何两种及以上识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体的组合被包被在酶标盘的同一个反应槽内；所述预包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体被分别包被在同一个酶标盘或分开酶标盘的不同的反应槽内；所述的预包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
所述生物芯片的基片为玻片、塑膠片、矽片和膜等,免疫印迹膜为硝酸纤维素膜或PVC膜。
为了避免歧义，本发明就涉及的诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)标志物Oct4、Sox2、Nanog、LIN28、c-Myc,Klf4作如下定义：
本发明所述的诱导性多潜能人干细胞(iPS细胞)标志物:人Oct4基因代码为NM_002701.4,全名：Octamer-binding transcription factor 4,别称：POU5F1,OCT3,OTF3.
本发明所述的诱导性多潜能人干细胞(iPS细胞)标志物:人Sox2基因代码为NM_003106.3,全名:Homo sapiens SRY(sex determining region Y)-box2(SOX2),别称：ANOP3,MCOPS3。
本发明所述的诱导性多潜能人干细胞(iPS细胞)标志物:人Nanog基因代码为NM_024865.2,全名：Nanog homeobox,别称：NANOG,nanOg。
本发明所述的诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)标志物:人LIN28基因代码为NM_024674.4,含有业内公知别称:CSDD1,LIN-28,ZCCHC1,Lin-28A.
本发明所述的诱导性多潜能鼠干细胞(iPS细胞)标志物:鼠Oct4基因代码为NM_001252452全名：Mus musculus POU domain,class 5,transcriptionfactor 1,Mus octamer-binding transcription factor 4,别称：POU5F1,OCT3,OTF3.
本发明所述的诱导性多潜能鼠干细胞(iPS细胞)标志物:鼠Sox2基因代码为NM_011443.3,Mus musculus SRY-box containing gene 2,含有业内公知别称：lcc,Sox-2,ysb。
本发明所述的诱导性多潜能鼠干细胞(iPS细胞)标志物:鼠c-Myc,基因代码为:NM_001177352.1,全名：Mus musculus myelocytomatosis oncogene,别称:AU016757;bHLHe39;Myc2;Niard;Nird.
本发明所述的诱导性多潜能鼠干细胞(iPS细胞)标志物:鼠Klf4,基因代码为:NM_010637.3,全名：Mus musculus Kruppel-like factor 4含有业内公知别称:EZF;Gklf;Zie.
本发明所述的诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的快速检测试剂盒,可以通过下述措施例来实现，所述的措施例只是为更好理解,而不是限制本发明的精神实质和内涵。
所述的生物标志物相关蛋白的抗原制备:
本发明的诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)的快速检测试剂盒,所述的各生物标志物的抗原可以按公知的基因重组方法或天然组织提取方法来获得。所述的各生物标志物相关蛋白抗原在用作免疫前得先纯化，然后与弗氏完全佐剂(第一次免疫)或与弗氏不完全佐剂(后续免疫)一起乳化后用于免疫接种。
本发明所述生物标志物相关抗原也可以是按所述生物标志物的氨基酸序列人工合成的多肽(petites)片段。
本发明所述生物标志物相关抗原可以是含有所述生物标志物的氨基酸序列的整个蛋白或仅含有所述相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
本发明所述生物标志物相关抗原也可以是含有所述生物标志物的氨基酸序列中引入个别氨基酸变异或缺失的序列。
上述生物标志物相关抗原也可以进一步与载体蛋白(比如BSA，KLH)相偶联，以提高免疫原性。
本发明所述生物标志物相关抗原还可以是基于DNA的疫苗，它可以在免疫动物体内按基因表达程序产生含有所述生物标志物相关氨基酸序列的部分或完整的蛋白。
1.本发明的生物标志物相关抗体的制备:
本发明所述的各生物标志物相关的抗体可以按公知的多克隆抗体制备方法或单克隆抗体制备方法来获得。
2.诱导性多潜能人干细胞(iPS细胞)快速检测试剂盒的制备例：
1)所述的检测试剂盒含有,但不局限于：检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液。
2)检测板制备:
用PBS缓冲液将兔抗鼠的抗体稀释至浓度0.1ug/ml-30ug/ml，再添加100ul该抗体稀释液到96-孔酶标板的孔内,在室温下孵育1-4小时或低温(4-8°C)下孵育10-24小时;用PBS+0.1％吐温20的洗液冲洗酶标板孔3-5次;然后,在酶标板的孔内添加200ul的2％BSA-PBS封闭液,室温下孵育1-4小时,再用PBS+0.1％吐温20的洗液冲洗酶标板孔3-5次;
用PBS缓冲液配制浓度为0.1ug/ml-10ug/ml的下述4个人生物标志物特异的鼠抗体溶液,按酶标板布局表（表1）所示,在酶标板上1-12列的孔内分别添加100微升下述生物标志物特异的抗体溶液:Oct4(列1,5,9)、Sox2(列2,6,10)、Nanog(列3,7,11)、LIN28(列4,8,12);
在室温下孵育0.5-4小时(或低温(4-8°C)孵育10-24小时),用PBS+0.1％吐温20洗液冲洗酶标板孔3-5次;然后,45°C下干燥，将该盘抽真空密封于铝袋内,储存在低温干燥冰箱备用。
3)阳性对照液制备：
阳性对照是用纯化的并经准确定量的各生物标志物按实验要求的检出浓度制备(各生物标志物阳性对照浓度不尽相同),将阳性对照用各生物标志物溶解于含1％BSA的PBS溶液里配成适当的浓度,低温储存备用。:
4)阴性对照液:
定量用:阴性对照液是含1％BSA的PBS溶液;低温储存备用。
定性用:将阴性细胞溶解液稀释于含1％BSA的PBS溶液里配成等同于定性检测时细胞溶解液的稀释度,比如：1/10,低温储存备用。
5)样品稀释液:
样品稀释液是含1％BSA的PBS溶液;制备：将1克BSA蛋白溶解于100毫升PBS缓冲液,低温储存备用。
6)示踪剂：
示踪剂是标记分子与纯化的生物标志物共价偶联物。所述的标记分子可以是常用的过氧化氢酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光分子、量子点等。如:HRP-Oct4示踪剂可以按公知的方法制备。比如通过EDC介导羧基与胺基反应来获得。例：将EDC、HRP、Oct4蛋白按摩尔数20：4：1溶解于PBS缓冲液，并在室温反应2小时，然后通过透析去除游离的EDC；也可进一步通过HPLC纯化获得高纯度HRP-Oct4偶联物。将示踪剂溶解于含1％BSA的PBS溶液里配成0.001-0.1%浓度备用。
7)洗涤液:
含0.1%吐温20(Tween20)的PBS溶液.
8)显色液:
过氧化氢酶用显色底物溶液:将TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)以0.2mg/ml的浓度溶于10mM(pH4)柠檬酸缓冲液,再加0.03%过氧化氢(H2O2),避光低温储存备用。适于测定波长：370nm或450nm(用等量1M硫酸终止后)。
碱性磷酸酶用显色底物溶液：将pNPP(对硝基苯磷酸盐)以10mmol／L的浓度溶于含1mmol／L MgCl2的0．1mol／L二乙醇胺缓冲液(pH 9．8),避光低温储存备用。适于测定波长：405nm。
3.诱导性多潜能人干细胞(iPS细胞)相关的多生物标志物筛查用检测试剂盒的检测方法例：
1)待测样品制备：使用MERCK公司的ProteoExtract全蛋白质组抽提试剂盒(产品目录号：539779)提取待测动物细胞的总蛋白。基本步骤如下：将待测细胞洗涤后放入-20°C以下冰箱冷冻10分钟以上，然后取出并加入冰镇的细胞悬浮液，置于冰上解冻，用移液枪头反复吸喷15分钟使细胞溶解，将其移到室温，加入提取剂及晃动提取5分钟，加入核酸内切酶BenzonaseR再用移液枪头反复吸喷20次，室温摇动提取30分钟，高速离心30分钟，取上清便得待测细胞总蛋白提取液--待测样品。
2)按表1上方所示,在检测板(预包被的酶标板)的列1-12的孔内分别添加50ul下述示踪剂:HRP-Oct4(列1,5,9)，HRP-Sox2(列2,6,10)，HRP-Nanog(列3,7,11)，HRP-LIN28(列4,8,12);
3)按表1所示,再分别在A和B行的孔内添加50ul阳性对照液,阴性对照液;在C，D，E，F，G和H行的孔内添加50ul待测试样1-18;在室温下孵育0.5-4小时或4-8°C孵育10-24小时;
酶标板布局表1:
4)洗板:在酶标板的每个孔内添加300ul PBS缓冲液,反复冲洗2-5次,把酶标板倒扣甩在吸水纸上。
5)显色:在酶标板的每个孔内添加100ul TMB溶液,室温下孵育,直到适当的颜色深度出现为止，加入100ul 1M硫酸溶液,终止发色。在450nm波长下读盘(测各个孔的OD值)。
6)结果分析：比较各样品的每一个生物标志物与其对应的阳性对照，阴性对照颜色深浅程度以确定该被检样品中该生物标志物是阳性还是阴性。
由于是竞争性结合,在正常情况下,阳性对照不显色或极微显色，阴性对照显深蓝色(终止发色前)或深黄色(终止发色后);被检样品的颜色越深越趋于阴性，越浅越趋于阳性。如果某一被检样品的颜色明显比阴性对照浅，说明该被检样品为阳性；如果某一被检样品的颜色与阴性对照相同或更深说明该被检样品为阴性。
4.诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)相关的生物标志物定量用检测试剂盒的制备例：
所述的定量用检测试剂盒含有,但不局限于：检测板、生物标志物标准液、反应液、探测液、样品稀释液、洗涤液、显色液。
1)检测板制备:
用PBS缓冲液将下述4个鼠抗待测生物标志物的单克隆抗体稀释至浓度4ug/ml,按表2所示位置分别添加100u l到96-孔酶标板的孔内,在室温下孵育4小时或低温(4-8°C)下孵育12小时;用PBS+0.1％吐温20洗液冲洗酶标板孔3-5次;然后,在酶标板的孔内添加200ul的2％BSA-PBS封闭液,在室温下孵育4小时,用PBS+0.1％吐温20洗液冲洗酶标板孔3-5次,然后,45°C下干燥，将该盘抽真空密封于铝袋内,储存在低温干燥冰箱备用。
如酶标板布局表2所示,4个鼠单克隆抗体及添加位置分别是:Oct4单抗(列1-3)、Sox2单抗(列4-6)、Nanog单抗(列7-9)、LIN28(列10-12)。
酶标板布局表2:
生物标志物标准液制备：
使用纯化的并经准确定量的各生物标志物,将Oct4、Sox2、Nanog、LIN28各生物标志物溶解于含1％BSA的PBS溶液里,配成10ng/ml的浓度,低温储存备用。
2)反应液配制：分别将生物素标记的多克隆抗体：兔抗Oct4-bio,兔抗Sox2-bio,兔抗Nanog-bio,兔抗LIN28-bio溶解于含1％BSA的PBS溶液里,配成50ug/ml的浓度并分别装在不同的试剂瓶里，低温储存备用。生物素标记抗体可以按公知的方法制备,比如通过EDC介导羧基与胺基反应来获得。例：将EDC、生物素、兔抗Oct4抗体按摩尔数20：15：1溶解于PBS缓冲液，并在室温反应2小时，然后通过透析去除游离的EDC和生物素；也可进一步通过HPLC纯化获得高纯度Oct4-bio偶联物。
3)探测液配制：将亲和素标记的过氧化氢酶(可以通过市场购得)溶解于含1％BSA的PBS溶液里,配成50ug/ml的浓度，低温储存备用。
4)样品稀释液是含1％BSA的PBS溶液;制备：将1克BSA蛋白溶解于100毫升PBS缓冲液,低温储存备用。
5)洗涤液:含0.1%Tween-20的PBS溶液.
6)显色液:将TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)以0.2mg/ml的浓度溶于10mM(pH4)柠檬酸缓冲液,再加0.03%过氧化氢(H2O2),避光低温储存备用。适于测定波长：370nm或450nm(用等量1M硫酸终止后)。
5.诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)相关的生物标志物定量用检测试剂盒的检测方法例
1)待测样品制备：
使用MERCK公司的ProteoExtract全蛋白质组抽提试剂盒(产品目录号：539779)提取待测动物细胞的总蛋白。基本步骤如下：将待测细胞洗涤后放入-20°C以下冰箱冷冻10分钟以上，然后取出并加入冰镇的细胞悬浮液，置于冰上解冻，用移液枪头反复吸喷15分钟使细胞溶解，将其移到室温，加入提取剂及晃动提取5分钟，加入核酸内切酶BenzonaseR再用移液枪头反复吸喷20次，室温摇动提取30分钟，高速离心30分钟，取上清便得待测细胞总蛋白提取液--待测样品。
2)加样及加标准液:
用样品稀释液适当(比如1：1)稀释待测样品(最好包含一阴性样品)并编号1-8,每个稀释后样品量不少于300ul;将生物标志物溶液:Oct4、Sox2、Nanog、LIN28用样品稀释液分别3倍逐级稀释成：1000，333，111，37，12，4，1及0pg/ml的8个梯度浓度，并按酶标板布局表2所示在酶标板相应位置的孔中分别添加100ul/孔,既:
●在A1孔至H1孔分别添加Oct4标准液的浓度：1000，333，111，37，12，4，1及0pg/ml;
●在A4孔至H4孔分别添加Sox2标准液的浓度：1000，333，111，37，12，4，1及0pg/ml;
●在A7孔至H7孔分别添加Nanog标准液的浓度：1000，333，111，37，12，4，1及0pg/ml;
●在A10孔至H10孔分别添加LIN28标准液的浓度：1000，333，111，37，12，4，1及0pg/ml;
按酶标板布局表2所示,
●在列2-3的各孔(A2,A3孔至H2,H3孔)内,分别添加100ul事先稀释好的待测样品1-8;
●在列5-6的各孔(A5,A6孔至H5,H6孔)内,分别添加100ul事先稀释好的待测样品1-8;
●在列8-9的各孔(A8,A9孔至H8,H9孔)内,分别添加100ul事先稀释好的待测样品1-8;
●在列11-12的各孔(A11,A12孔至H11,H12孔)内,分别添加100ul事先稀释好的待测样品1-8;
在室温下孵育2小时或4-8°C孵育12小时。
3)洗板:倒空酶标板,洗板3-5次:在酶标板的每个孔内添加300ul洗涤液,反复冲洗2-5次,把酶标板倒扣甩在吸水纸上。
4)添加反应液：
●在列1-3的各孔(A1孔至H3孔)内,各添加100ul兔抗Oct4-bio反应液,
●在列4-6的各孔(A4孔至H6孔)内,各添加100ul兔抗Sox2-bio反应液,
●在列7-9的各孔(A7孔至H9孔)内,各添加100ul兔抗Nanog-bio反应液,
●在列10-12的各孔(A10孔至H12孔)内,各添加100ul兔抗LIN28-bio反应液,
在室温下孵育1-2小时或4-8°C孵育12小时。
5)洗板:倒空酶标板,洗板3-5次:在酶标板的每个孔内添加300ul洗涤液,反复冲洗2-5次,把酶标板倒扣甩在吸水纸上。
6)添加探测液：在酶标板的每个孔内添加100ul亲和素探测液;在室温下孵育1-2小时。
7)洗板:倒空酶标板,洗板3-5次:在酶标板的每个孔内添加300ul洗涤液,反复冲洗2-5次,把酶标板倒扣甩在吸水纸上。
8)显色:在酶标板的每个孔内添加100ul TMB溶液,室温下孵育,直到理想的颜色梯度出现为止(观察加标准液的列)，加入100ul 1M HCL停止发色;在450nm波长下检测吸光度。
9)结果分析：通过电脑计算,制作生物标志物的标准曲线,再通过与标准曲线比较,计算出被测样品中该生物标志物的浓度。每一个生物标志物有一个标准曲线。
●根据A1孔至H1孔吸光度及相应的标准液浓度,制作生物标志物Oct4的标准曲线,再将A2孔至H3孔所测得的样品吸光度与Oct4标准曲线比较,并考虑被测样品的稀释倍数计算出各个被测样品中Oct4的浓度;
●根据A4孔至H4孔吸光度及相应的标准液浓度,制作生物标志物Sox2的标准曲线,再将A5孔至H6孔所测得的样品吸光度与Sox2标准曲线比较,并考虑被测样品的稀释倍数计算出各个被测样品中Sox2的浓度;
●根据A7孔至H7孔吸光度及相应的标准液浓度,制作生物标志物Nanog的标准曲线,再将A8孔至H9孔所测得的样品吸光度与Nanog标准曲线比较,并考虑被测样品的稀释倍数计算出各个被测样品中Nanog的浓度;
●根据A10孔至H10孔吸光度及相应的标准液浓度,制作生物标志物LIN28的标准曲线,再将A11孔至H12孔所测得的样品吸光度与LIN28标准曲线比较,并考虑被测样品的稀释倍数计算出各个被测样品中LIN28的浓度。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
Claims (10)
1.一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、示踪液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液和显色液。
2.一种快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,包括：用于快速检测诱导性人或鼠多潜能干细胞的检测板、生物标志物标准液、反应液、探测液、样品稀释液、洗涤液和显色液。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述的检测板是固定了Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原为所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列的多肽。
4.根据权利要求3所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述含有Oct4、Sox2、Nanog、LIN28中任何两种及以上的人生物标志物的抗原被合并地包被在酶标盘的同一个反应槽内，或被分别地包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
5.根据权利要求1或2所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述检测板是固定了任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体的固相；所述固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、Nanog、LIN28人生物标志物的特异抗体被合并地包被在酶标盘的同一个反应槽内，或被分别地包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内，所述包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
7.根据权利要求1或2所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述检测板固定了Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、生物芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述抗原是所述生物标志物的整个蛋白或仅含相关蛋白的部分氨基酸序列多肽。
8.根据权利要求7所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,含有Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4中任何两种及以上的小鼠生物标志物抗原被合并地包被在酶标盘的同一个反应槽内，或被分别地包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内。
9.根据权利要求1或2所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,所述检测板是固定了含有任何两种及以上能识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体的固相；所述的固相为酶标盘的反应槽、蛋白芯片的基片、免疫印迹膜、磁珠；所述的特异抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的快速检测诱导性多潜能干细胞的试剂盒，其特征在于,含有任何两种及以上识别Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4小鼠生物标志物的特异抗体被合并地包被在酶标盘的同一个反应槽内，或被分别地包被在同一个酶标盘或分开的酶标盘的不同的反应槽内；所述预包被酶标盘包括使用直接或间接的方法将所述的特异抗体包被在酶标盘的反应槽内。
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