CN102986538A - 皱木耳菌株kbs-28及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及皱木耳菌株的筛选及制备方法，属于微生物技术领域。本发明的菌株Auricularia delicataKBS-28已于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6705。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于皱木耳的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及皱木耳菌株KBS-28及制备方法。
背景技术
皱木耳Auricularia delicata别名脆木耳、多皱木耳、砂耳等，属于木耳目木耳科木耳属的一种
在皱木耳栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。皱木耳菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于皱木耳的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了皱木耳商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为皱木耳纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行皱木耳资源的保护应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地皱木耳子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备皱木耳液体及固体优良菌种，为皱木耳资源保护提供优良菌种
本发明采用的真菌是皱木耳Auricularia delicata KBS-28；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年10月11日；保藏登记入册的编号CGMCC No.6705
实体一般较小，胶质，耳形或圆盘形，无柄，着生于腐木上，直径1-7 cm×1-4cm。子实层生里面，淡红褐色，有白色粉末，有明显皱褶并形成网格，外面稍皱，红褐色。孢子透明无色，光滑，圆筒形，弯曲，10-13μm×5-6μm，担子棒状，三横隔，40-45μm×4-5μm
本发明的技术方案：
① 采集野生皱木耳子实体；
② 组织分离或孢子分离；
③ 纯化菌株及菌株鉴定；
④ 生物学特性比较及生产性状比较；
⑤ 确定优良菌株；
⑥ 菌种生产及菌种应用；
经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的皱木耳液体菌种专用菌株KBS-28
本发明真菌Auricularia delicata培养方法(以下为重量百分比):
菌种分离纯化培养基：2%皱木耳下脚料、0.001%VB1、2%葡萄糖、2%琼脂；
皱木耳菌株分离及鉴定方法：
1、将皱木耳子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得皱木耳分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得皱木耳纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的皱木耳(Auricularia delicata) Identities=524/537(97%)，Gaps=8/537(1%)，分析确定分离得到的纯培养物为皱木耳菌丝体
本发明皱木耳菌种的制备方法分为：液体培养和固体培养两种
液体菌种制备方法：
液体培养基配方为：30%蔗渣、10~20%麸皮、10~20%土豆、0.5~1%蔗糖，余下为水，pH自然
1、将皱木耳的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min) ；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为20-26℃；通气培养72-96小时，获得皱木耳液体菌种
固体菌种制备方法：
固体培养基配方为：木屑890%、麸皮10%、碳酸钙1%、pH自然
1、将皱木耳的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160 r/min，培养时间5-7天
2、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26℃培养15-20天，直到菌丝长满
具体实施方式：
实施例一：
1、将皱木耳子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得皱木耳分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7天，获得皱木耳纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的皱木耳(Auricularia delicata) Identities=525/528(99%)，Gaps=1/528(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为皱木耳菌丝体
4、将Auricularia delicata KBS-28的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18℃下培养7天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为30%蔗渣、10%麸皮、10%土豆、0.5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min) ；搅拌转速为120r/min；接种量为5%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为22℃；通气培养96小时，获得皱木耳液体菌种
实施例二：
菌种制备的步骤与实施例一相同
1、将皱木耳子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得皱木耳分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养6天，获得皱木耳纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的皱木耳(Auricularia delicata) Identities=525/528(99%)，Gaps=1/528(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为皱木耳菌丝体
4、将Auricularia delicata KBS-28的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养6天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为30%蔗渣、15%麸皮、15%土豆、0.6%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1：0.8v/(v·min) ；搅拌转速为140r/min；接种量为8%；罐压：0.04Mpa； pH为6.0；温度为24℃；通气培养84小时，获得皱木耳液体菌种
实施例三：
1、将皱木耳子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得皱木耳分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得皱木耳纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的皱木耳(Auricularia delicata) Identities=525/528(99%)，Gaps=1/528(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为皱木耳菌丝体
4、将Auricularia delicataKBS-28的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为30%蔗渣、20%麸皮、20%土豆、0.5%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑890%、麸皮10%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养15天，获得皱木耳固体菌种
实施例四：
1、将皱木耳子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得皱木耳分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得皱木耳纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的皱木耳(Auricularia delicata) Identities=525/528(99%)，Gaps=1/528(0%)，分析确定分离得到的纯培养物为皱木耳菌丝体
4、将Auricularia delicataKBS-28的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中（每瓶装200ml）液体培养基中，培养基配方为30%蔗渣、18%麸皮、10%土豆、1%蔗糖、10%玉米粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑890%、麸皮10%、碳酸钙1%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于20℃培养20天，获得皱木耳固体菌种。
Claims (2)
1.一种皱木耳菌株，其特征在于所述菌株为（Auricularia delicata）KBS-28，该菌株的保藏号为CGMCC NO.6705。
2.根据权利要求1所述的皱木耳菌株的制备方法，所述菌株是经过常规的液体和固体发酵培养获得的，其特征在于所述液体和固体发酵培养基配方如下：
液体培养基配方为：5-10%麸皮、0.5-1%黄豆粉、0.5-1%麦芽糖、1-3%玉米粉，余下为水，pH自然；
固体培养基配方为：木屑75-90%、麸皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊。
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| CN101473758A (zh) * | 2009-01-19 | 2009-07-08 | 北京林业大学 | 木耳菌种的组织分离方法 |
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