CN102978264A - 一种他立韦林的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种他立韦林的制备方法，采用乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作为菌种，包括如下步骤：A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应；B、催化反应液的后处理； C、氨解反应与纯化。与现有技术本相比，本发明具的优点和效果是：1）菌种发酵液催化反应相比化学法条件温和。2）原料成本低。3）步骤简便。4）他立韦林总收率高，达到87.5%～91.5%。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是他立韦林的一种新的制备方法。
背景技术
他立韦林（Taribavirin，商品名viramidine）的化学名称是1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-甲脒盐酸盐，为核苷类似物，是一种能通过腺苷脱氨酶作用转化为利巴韦林的前药，用于治疗丙肝。与利巴韦林相比，他立韦林可降低慢性丙肝患者的贫血发生率，同时可使持续病毒学应答增加。他立韦林具有更小的副作用以及更好的疗效，有可能取代利巴韦林成为安全有效的慢性丙肝治疗药物。
目前，他立韦林的合成主要为化学法。化学法参见文献（Journal of Medicinal Chemistry,16(8),935～937(1973)；Journal of Medicinal Chemistry,32(7),1447～1449(1989)；WO2001/060379）。这类方法采用利巴韦林或者四乙酰核糖为起始原料，价格昂贵；缩合反应温度高达150℃或以上，并且成熔融状态，工业生产难以操作；反应及纯化步骤繁琐，副产物多，产率低，综合成本高；大量使用有机溶剂，安全环保要求高。
上述表明，采用现有技术，需要利用核苷制备四乙酰核糖或者制备利巴韦林作为起始原料，增加成本，并且安全环保要求高，其工业化受到了成本和安全环保的限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种他立韦林的制备方法，工艺简便，生产成本低廉，产物得率高。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种他立韦林的制备方法，采用乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作为菌种，包括如下步骤：A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应，所述的催化底物反应是指在菌种发酵液中加入底物，在55℃～65℃进行酶催化反应20小时～25小时得催化反应液；B、催化反应液的后处理：步骤A催化反应结束后，加入与催化反应液相比，其重量百分含量为0.1～2.5%活性炭，助滤除菌，滤液真空减压浓缩到有固体析出，冷却到10±1℃，过滤除去固体杂质，滤液加入0.3～1.0倍体积乙醇，冷却结晶，5±1℃过滤收集滤饼，60±5℃下真空干燥，得到1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基；C、氨解反应与纯化：在耐压反应釜中加步骤B的1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基、氯化铵和氨甲醇溶液，且氨甲醇溶液的浓度是10%，30℃～50℃反应15小时～36小时；真空减压浓缩至干，加入自身浓度为90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林。
进一步：在上述他立韦林的制备方法中，所述步骤A的酶反应底物是核苷和3-氰基-1,2,4-三氮唑；核苷浓度为10mmol/L～600mmol/L；所述核苷与3-氰基-1,2,4-三氮唑的摩尔比是1:1～1:1.5；所述的核苷是肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或者两种。所述步骤C各物质的摩尔比为1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基:氯化铵等于1:1.0～1:1.5，所述氯化铵与氨甲醇溶液的摩尔比为1:3.8～1:4.2。所述步骤A菌种发酵是指将菌种放入菌种培养基进行发酵处理，所述菌种培养基的重量百分比配制为：葡萄糖0.1%～1.0%，酵母粉1.0%～5.0%，磷酸氢二钾0.35%～1.50%，磷酸二氢钾0.15%～1.50%，氯化钠0.15%～1.00%，自来水90.00%～98.25%，发酵液pH值控制在6.0～6.9。所述步骤A菌种发酵的发酵控制是采用发酵罐通风发酵；罐压为0.010～0.015MPa，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间为25小时～35小时。
本发明所涉及的乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株（公知菌株），购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection,简称ATCC，网址http://www.atcc.org/)。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1）菌种发酵液催化反应相比化学法条件温和。其特征为：采用酶液催化缩合反应，生成1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基。
2）原料成本低。其特征为：采用大规模发酵生产的核苷为起始原材料，比现有技术中的四乙酰核糖或者制备利巴韦林容易获取，价格低廉。
3）步骤简便。其特征为：采用菌种发酵液直接进行下一步催化反应，不需要分离收集菌体，简单方便，并且可以继续利用其中的磷酸盐作为缓冲液。
4）他立韦林总收率高，达到87.5%～91.5%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，制备过程中各个原材料的选择可因地制宜而对结果并无实质性影响。
实施例1
1.菌种发酵液培养基的配制：
葡萄糖0.5%，酵母粉4.5%，磷酸氢二钾0.8%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钠0.2%，用自来水配制，发酵液pH值控制在6.8；
2.菌种发酵液的发酵控制：
采用30L发酵罐,将菌种接入发酵培养基，通风发酵；罐压为0.012MPa，发酵温度为36℃，发酵时间为26小时；
3.菌种发酵液催化底物反应：
在3L三口瓶中加入1L上述菌种发酵液、21.46g（80mmol）肌苷和7.53g（80mmol）3-氰基-1,2,4-三氮唑，搅拌加热，在60℃温度下进行酶催化反应24小时；催化反应过程中采用TLC（展开剂，乙酸乙酯：异丙醇：氨水=2:4:1）监控反应情况。
4.催化反应液的后处理：
酶催化反应结束后，在反应液中加入2.0g活性炭，搅拌，抽滤，滤饼弃去，滤液真空减压浓缩到约200ml，有少量固体析出；取出搅拌降温，冷却到10℃，抽滤，除去固体杂质；滤液加入0.5倍体积乙醇，搅拌冷却结晶，5℃过滤收集滤饼，60℃真空干燥，得到1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基17.19g（95%）。
5.氨解反应与纯化：
在耐压反应釜中加入11.31g（50mmol）1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基、2.67g（50mmol）氯化铵和200ml氨甲醇溶液，35℃反应24小时；真空减压浓缩至干，加入100ml90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林13.42g（96%），熔点177-179℃；按照高效液相色谱法检测纯度为99.5%；检测方法和条件如下（下面的实施例使用相同的方法和条件）：
仪器：高效液相色谱仪(Agilent 1200)
色谱柱：BDS C18 4.6mmx250mm 5μm
流动相：5%甲醇+95%50mmol/L(NH4)H2PO4
流速：1ml/min
波长：216nm
实施例2
1.菌种发酵液培养基的配制：
葡萄糖0.5%，酵母粉4.0%，磷酸氢二钾0.8%，磷酸二氢钾0.3%，氯化钠0.2%，用自来水配制，发酵液pH值控制在6.8；
2.菌种发酵液的发酵控制：
采用30L发酵罐,将菌种接入发酵培养基，通风发酵；罐压为0.012MPa，发酵温度为36℃，发酵时间为30小时；
3.菌种发酵液催化底物反应：
在3L三口瓶中加入1L上述菌种发酵液、22.66g（80mmol）鸟苷和7.53g（80mmol）3-氰基-1,2,4-三氮唑，搅拌加热，在60℃温度下进行酶催化反应24小时；催化反应过程中采用TLC（展开剂，乙酸乙酯：异丙醇：氨水=2:4:1）监控反应情况。
4.催化反应液的后处理：
酶催化反应结束后，在反应液中加入2.0g活性炭，搅拌，抽滤，滤饼弃去，滤液真空减压浓缩到约200ml，有少量固体析出；取出搅拌降温，冷却到10℃，抽滤，除去固体杂质；滤液加入0.5倍体积乙醇，搅拌冷却结晶，5℃过滤收集滤饼，60℃真空干燥，得到1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基17.37g（96%）。
5.氨解反应与纯化：
在耐压反应釜中加入11.31g（50mmol）1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基、2.67g（50mmol）氯化铵和200ml氨甲醇溶液，35℃反应24小时；真空减压浓缩至干，加入100ml90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林13.28g（95%），熔点177-179℃；按照高效液相色谱法检测纯度为99.6%。
Claims (5)
1.一种他立韦林的制备方法，采用乙酰短杆菌Brevibacterium acetylicum ATCC39311菌株作为菌种，其特征在于包括如下步骤：
A、将菌种先进行发酵得菌种发酵液，再将菌种发酵液进行催化底物反应，所述的催化底物反应是指在菌种发酵液中加入底物，在55℃～65℃进行酶催化反应20小时～25小时得催化反应液；
B、催化反应液的后处理：步骤A催化反应结束后，加入与催化反应液相比，其重量百分含量为0.1～2.5%活性炭，助滤除菌，滤液真空减压浓缩到有固体析出，冷却到10±1℃，过滤除去固体杂质，滤液加入0.3～1.0倍体积乙醇，冷却结晶，5±1℃过滤收集滤饼，60±5℃下真空干燥，得到1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基；
C、氨解反应与纯化：在耐压反应釜中加步骤B的1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基、氯化铵和氨甲醇溶液，30℃～50℃反应15小时～36小时；真空减压浓缩至干，加入浓度为90%乙醇溶液结晶，抽滤，滤饼烘干，得到他立韦林。
2.根据权利要求1所述的他立韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤A的酶反应底物是核苷和3-氰基-1,2,4-三氮唑；核苷浓度为10mmol/L～600mmol/L；所述核苷与3-氰基-1,2,4-三氮唑的摩尔比是1:1～1:1.5；所述的核苷是肌苷、鸟苷或腺苷中的一种或者两种。
3.根据权利要求2所述的他立韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤C中1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-氰基与氯化铵的摩尔比为1:1.0～1:1.5。
4.根据权利要求1所述的他立韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤A菌种发酵是指将菌种放入菌种培养基进行发酵处理，所述菌种培养基的重量百分比配制为：葡萄糖0.1%～1.0%，酵母粉1.0%～5.0%，磷酸氢二钾0.35%～1.50%，磷酸二氢钾0.15%～1.50%，氯化钠0.15%～1.00%，自来水90.00%～98.25%，发酵液pH值控制在6.0～6.9。
5.根据权利要求4所述的他立韦林的制备方法，其特征在于：所述步骤A菌种发酵的发酵控制是采用发酵罐通风发酵；罐压为0.010～0.015MPa，发酵温度为35℃～40℃，发酵时间为25小时～35小时。
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