CN102978144A - 极暗黄链霉菌 - Google Patents

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Abstract

一种极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2012519。本菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，对水稻纹枯病菌的抑制效果尤为明显。

Description

极暗黄链霉菌
技术领域
本发明涉及一种微生物技术领域，具体指一种对农作物病具有广谱拮抗作用，尤其对水稻纹枯病具有明显抑制作用的极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40。
背景技术
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhzioeotniasoalni)引起的导致水稻减产的重要病害，可造成10%-30%的产量损失，发病严重时减产可达50%。近几年，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，水稻纹枯病的危害越来越严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井冈霉素与一些化学药剂为主，长期单一使用井冈霉素易导致立枯丝核菌产生抗药性，近年井冈霉素每季用药次数已从20年前2次增加到现在的3-5次，用药量也从1.5 kg/hm2上升到4.5-6.0kg/hm，而化学药剂存在毒性、残留、环境污染等缺点，且由于立枯丝核菌腐生能力强和寄主范围广的特点，国内外至今尚未发现对该病的高抗品种。
且，随着化学杀菌剂对生态环境、有益生物及人体所引致负作用的加大，以及植物病原菌日益增加的抗药性，利用一些生物防治菌作为生物杀菌剂来防治植物病害，以减轻化学农药对环境污染的研究引起各界的密切关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种对农作物病具有广谱拮抗作用的极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40，尤其对水稻纹枯病菌具有良好的抑制效果。
本发明所述的极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40，已于2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2012519，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明菌株CZB40具有以下性质：
形态特征：使用插片法在高氏1号培养基上28℃培养7d后，分别用光学显微镜和电子显微镜观察发现，本菌株具有典型的链霉菌属特征，菌落紧密、表面皱折，皮壳状，青褐色。气生菌丝和基内菌丝均很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝呈螺旋状，孢子呈短圆柱形，见图1。
生理生化特性：本发明菌株CZB40在高氏一号固体培养基中生长产生暗黄色色素。本菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，使淀粉水解，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固，也不能产生硫化氢。
利用参照I.M. Kauffmann等及Jasmina Nikodinovic等的方法提取本发明菌株的基因组DNA，根据放线菌16SrDNA的结构特点及其保守区设计特异引物（引物由上海生工生物工程公司合成）：
正向引物16sF：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG（见SEQ ID NO.1）；
反向引物16sR：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA（见SEQ ID NO.2）。
以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增（50μL反应体系）：94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸8min。扩增产物经上海生工生物工程技术有限公司测序，序列经BLAST分析并构建系统发育树（见图2）表明，本发明菌株CZB40与极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）的相似性达99%。结合形态和生理生化特征分析，将其鉴定为极暗黄链霉菌（Streptomycesfulvissimus）的一个新种，命名为极暗黄链霉菌（Streptomycesfulvissimus）CZB40。
培养及发酵条件
培养基中的营养源并无特殊的规定，培养基中可含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中，碳源可为葡萄糖、麦芽糖、马铃薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖等。氮源可为NaNO3、(NH4)2SO4、酵母粉、蛋白胨、大豆粉等。其他营养源可为含镁、钠、钾之类的金属盐等。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于本发明菌株的生长为宜。
将本发明菌株CZB40接种于发酵培养基中，可获得发酵液，发酵培养基为：玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4  0.2-1g、NaCl 0.2-1g、K2HP O4 0.2-1g、1000ml水，pH 5-9；发酵条件为：接种量1-10%（体积）、温度 26-30℃、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48-96h。通过单因素试验和均匀设计法对本发明菌株CZB40的发酵培养基和发酵条件进行优化，得到最佳培养基（1000ml水）为：25g玉米粉、5g酵母粉、0.2gMgSO4 、0.8gNaCl、0.4gK2HPO4 pH 6；最佳发酵条件为：接种量5%、温度29℃、转速200r/min、发酵时间72h。
本发明菌株对农作物病具有广谱拮抗作用，对辣椒疫霉病菌、桃树褐腐病菌、及水稻稻瘟病菌有较好的抑制作用，尤其对水稻纹枯病菌抑制效果明显。
附图说明
图1是本发明菌株CZB40的孢子形态图。
图2是本发明菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，本文中提及的各病原菌均由湖南农业大学植物病理系提供。
实施例1
将从湖南省郴州市采集的土样于室温下风干，称取土样10g放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用无菌移液管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，混匀。从此试管中吸取1ml注入另一支盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制备10－2、10－3、10－4、10－5、10－6的土壤稀释液。用无菌移液管吸取10－2、10－4、10－6稀释液0.1mL分别滴加到加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀，静置30min后，将培养皿放在28℃温箱中倒置培养。及时挑单菌落至高氏一号培养基上划线纯化，得到本发明菌株。
其中，添加有3%的抑菌剂(K2Cr2O7)的培养基配方为：可溶性淀粉20g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4· 7H2O 0.01g、琼脂 20g、水 1000mL、pH 7.2，加入的抑菌剂(K2Cr2O7)3mL。
实施例2
将本发明菌株CZB40接种5%（体积）于发酵培养基（玉米粉25g、酵母粉5g、MgSO4  0.2g、NaCl 0.8g、K2HP O4 0.4g、1000ml水；pH6），28℃下以200r/min转速摇瓶发酵培养72h，用细菌过滤器（直径=0.22μm）过滤，得发酵液。
实施例3 本发明菌株对水稻纹枯病菌的抑制作用
于培养皿中加入3ml本发明菌株发酵液与12mlPDA，混匀制成平板（以3ml无菌水与12mlPDA混匀制成平板做对照），将培养在PDA上的水稻纹枯病菌的小菌饼（直径=5mm）倒置放到平板中央，重复3次。静置1h后放入28℃温箱倒置培养1-2d。用十字交叉法测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈透明程度和边缘整齐程度，记录结果并按下式计算抑制率：
菌落直径=相垂直的两直径的平均值－菌饼直径
抑制率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/(对照菌落直径－菌饼直径）×100%。（这里提及的菌饼直径皆是指水稻纹枯病菌的小菌饼（直径=5mm））
结果表明：本发明菌株的抑菌率为89.3%，说明了本发明菌株对水稻纹枯病菌的生长有较强的抑制作用，并能抑制水稻纹枯病菌菌核的形成。
实施例4 本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为辣椒疫霉病菌，结果表明：本发明菌株对辣椒疫霉病菌的抑制率为52.94%，有较好的抑菌效果。
实施例5本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为桃树褐腐病菌，结果表明：本发明菌株对桃树褐腐病菌的抑制率为80.29%，有较好的抑菌效果。
实施例6本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制作用
参照实施例3的步骤，只是将病原菌换为水稻稻瘟病菌，结果表明：本发明菌株对水稻稻瘟病菌的抑制率为52.94%，抑菌效果较好。
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Claims (8)

1.一种极暗黄链霉菌，其特征在于：该菌株为极暗黄链霉菌（Streptomyces fulvissimus）CZB40，2012年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2012519。
2.一种发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于：发酵所用菌株为权利要求1所述的极暗黄链霉菌CZB40，发酵培养基为：玉米粉10-30g、酵母粉3-7g、MgSO4  0.2-1g、NaCl 0.2-1g、K2HP O4 0.2-1g、水1000ml，pH 5-9；发酵条件为：接种量1-10%、温度 26-30℃、摇瓶转速150-250r/min、发酵培养时间为48-96h。
3.如权利要求2所述的发酵法制备极暗黄链霉菌发酵液的方法，其特征在于：所述培养基为：1000ml培养基中25g玉米粉、5g酵母粉、0.2g MgSO4 、0.8gNaCl及0.4gK2HPO4 pH 6；发酵条件为：接种量5%、温度29℃、转速200r/min、发酵时间72h。
4.如权利要求2或3所述方法得到的发酵液。
5.如权利要求1所述的菌株在抑制水稻纹枯病中的应用。
6.如权利要求1所述的菌株在抑制辣椒疫霉病菌中的应用。
7.如权利要求1所述的菌株在抑制桃树褐腐病菌中的应用。
8.如权利要求1所述的菌株在抑制水稻稻瘟病菌中的应用。
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