CN102952281A

CN102952281A - 一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN102952281A
Application number: CN2012103382846A
Authority: CN
Inventors: 岑莲; 谢淑君; 徐菊美
Original assignee: JIANGSU LONGYUAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIANGSU LONGYUAN BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2032-09-13
Also published as: CN102952281B

Abstract

本发明公开了一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，本发明采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐交联剂来制备透明质酸-壳寡糖的复合凝胶，在中性条件下进行，避免了透明质酸酸性降解问题，促进透明质酸的羧基和壳寡糖的氨基发生反应形成凝胶，反应结束后，通过简单的水洗即可将交联剂从透明质酸-壳寡糖凝胶内彻底去除，保证了透明质酸-壳寡糖凝胶的纯度。采用本发明制备透明质酸-壳寡糖的复合凝胶，兼具透明质酸优异的生物相容性和壳寡糖对细胞的特殊保护作用，而且该凝胶使用方便灵活，具有较广的实用价值。

Description

一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法。

背景技术

透明质酸（Hyaluronic acid, 简称HA）是由N-乙酰氨基葡糖-D-葡萄糖醛酸为双糖单位组成的天然直链高分子多糖（glycosaminoglycan，简称GAG），分子量可以高达1-2000000Da。商品形式的HA主要以透明质酸钠、透明质酸镁或透明质酸钙等盐的形式出售，本文中的HA如不特意指出即指透明质酸钠。近年来一般利用鸡冠萃取法和微生物发酵法制备。HA具有较好的粘弹性，广泛分布于哺乳动物结缔组织的胞外基质、鸡冠和链球菌的夹膜等地方。HA是黏多糖的一种，与细胞表面有密切的相互作用，由于参与了关节的润滑和胶状结缔组织的连接而被认为是生物“胶”。HA在骨骼演变的生长，发育和重建过程中发挥着多种功能，并且在很多重大的生物学过程中也有举足轻重的作用，如细胞迁移，增殖，组织形成，伤口愈合，血管化和器官形成等。最近的报道认为HA能作为配体被干细胞表面的受体CD44所识别，并通过与CD44的作用参与到细胞的黏附，增殖和分化以及受体介导的基因表达。

综上所述，由于HA无种属及脏器特异性，在植入体内时显示出优良的机体生物相容性，是一种理想的天然生物医用材料。HA在体内的吸收很快，容易被肌体组织中的酶降解，良好的水溶性使其在组织中容易被扩散。Chiara Schiraldi等（食品与药品，2012，14（02）：150）报道了HA在皮肤中的半衰期为1天，在眼睛中为1-1.5小时，在软骨中为1-3周，在玻璃液中的半衰期为70天。为了延长HA在体内的存留时间，保持其功效，往往需要对HA进行修饰和交联，再应用于美容除皱，保湿和组织填充，皮肤辅料，药物释放的载体，以及用于构建各种组织如皮肤，软骨，骨，血管，角膜和肌腱等的组织工程用支架材料。

壳寡糖(Chitosan oligosaccharide，简称OCS)，也称几丁寡糖，学名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺。与一般的壳聚糖衍生物不同，OCS是壳聚糖降解后的衍生物，现在把由20个以下氨基葡萄糖组成的低聚壳聚糖称为壳寡糖。OCS具有许多优于高分子量壳聚糖的功能，它有较高的溶解度，能直接溶于中性水溶液，所以很容易被吸收利用，是当今国内外研究、开发的重点前沿领域。目前主要关注的OCS功能有：

a. 免疫功能：实验证明，壳寡糖使白介素-1增加3.4倍，白介素-2增加2.7倍，可激活杀伤细胞，如NK细胞、LAK细胞等并产生INF-γ、TNFα等细胞因子，还可直接作用于B细胞并分泌免疫球蛋白。

b. 辅助防治肿瘤：OCS能保护细胞，防止外来致癌因素的诱变作用，对于肿瘤病人，OCS有直接抑制肿瘤细胞、减少其转移的作用，和减少放疗、化疗副作用的功能，配合常规治疗能提高疗效。

c. OCS的化学结构式中含有氨基，它所具有的特性：（1）碱性，人体对体液酸碱度的要求是非常严格的，pH值需要限制在一个很狭小的范围内，否则生理功能就受到不利影响，严重的会产生酸碱中毒。由于人体的分解代谢产物多是酸性的，因此体液有酸性化的倾向，而OCS的氨基则决定了它的弱碱性；（2）还原性，也就是有抗自由基作用，因为自由基是几乎所有中老年慢性疾病的重要发病机制，因此抗氧化就非常重要。

OCS对细胞的作用首先是促进细胞增生，被实验证实的就有皮肤、骨骼、胰岛、心肌、神经、肝脏等。另一方面对细胞有保护作用，可以延长细胞在体内的存活时间，具有加速表皮细胞的代谢和再生及极好的保湿吸湿功能，能有效地阻止皮肤粗糙和老化，抑菌抗皮肤病和吸收紫外线功能。OCS可明显消除人体氧负离子自由基，活化机体细胞，延缓衰老，抑制皮肤表面有害菌滋生，因此是日化领域的基础原料。OCS不但具备水溶性，使用方便，而且抑制腐败菌性能效果显著，兼备多种功能作用，是性能优良的天然食品防腐保鲜剂。总之，壳寡糖具有增强细胞功能，促进伤口和病灶愈合，抗衰老，使细胞再生能力增强和减少细胞损伤的功能。

因此，若是利用OCS来修饰HA，可以进一步增强HA的功能。相对于目前市场上流行的用于美容除皱的单纯HA凝胶材料（如瑞蓝），HA-OCS凝胶除了优异的美容除皱，保湿功能外，还具有难能可贵的抗菌性、抗氧化性、延缓衰老、促伤口愈合和保护肌体内细胞等特效，是HA凝胶所没有的独特性能。例如，用作药物载体时，除了具备HA原有的优异生物相容性，HA-OCS凝胶又具有独特的免疫及肿瘤防治功效；用作皮肤膜辅料时，其抗菌性能和促进伤口愈合功能更是和单纯HA凝胶的功能相得益彰；用作组织工程支架材料时，其促进细胞增生和加强细胞功能的作用也弥补了单纯HA凝胶的不足，尤其适合于皮肤和软骨组织的构建。

目前，还未见壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、易操作的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）原料液的准备：取透明质酸溶于蒸馏水中，在室温下搅拌24h，得到均一稳定的透明质酸溶液；取壳寡糖溶解于蒸馏水中，搅拌24 h后，除去未溶解的杂质；取水溶性碳二亚胺交联剂溶解于蒸馏水中；

（2）交联反应：在上述配制的透明质酸溶液中加入氯化钠，溶解完全后，向其中加入上述壳寡糖溶液，搅拌均匀，再滴加上述水溶性碳二亚胺交联剂溶液，充分搅拌，待混合均匀后，将混合液置于常温下进行交联反应，反应时间为48h，得到凝胶，最后，将形成的凝胶置于蒸馏水中，除去未交联的反应物。

优选的，所述透明质酸的羧基与壳寡糖的氨基摩尔比为1:1-5，所述水溶性碳二亚胺交联剂与透明质酸的羧基摩尔比为0.8-2.0:1，所述氯化钠在混合液中的含量为1mol/l。

优选的，所述透明质酸的羧基与壳寡糖的氨基摩尔比为1:1，所述水溶性碳二亚胺交联剂与透明质酸的羧基摩尔比为0.8:1。

优选的，所述水溶性碳二亚胺交联剂为单碳二亚胺或双碳二亚胺。

优选的，所述水溶性碳二亚胺交联剂为单碳二亚胺。

优选的，所述单碳二亚胺为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。

本发明的有益效果包括以下三点：

1. 本发明采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐交联剂来制备透明质酸-壳寡糖的复合凝胶，交联剂本身则充当了催化剂的作用，能使透明质酸的羧基和壳寡糖的氨基相连形成肽键，交联剂并不连接在透明质酸和壳寡糖的分子链上，反应后能通过简单水洗从透明质酸-壳寡糖凝胶内彻底去除，保证了透明质酸-壳寡糖凝胶的纯度，使其性能不受残留交联剂的存在和交联剂不降解的负面影响。因此所得凝胶性能要优于常用的透明质酸交联剂二缩水甘油醚交联所得的凝胶。如1,4丁二醇二缩水甘油醚，虽然1,4丁二醇二缩水甘油醚交联剂毒性较小，但最终是作为连接分子存在于透明质酸的分子链上；

2. 本发明的交联反应是在中性条件下进行的，由于透明质酸和壳寡糖均能溶于中性水溶液，克服了高分子壳寡糖必须溶于酸性水溶液的缺点，并且在酸性条件下，透明质酸的降解会加快，因此交联反应进行的同时也伴随着部分透明质酸分子量的降低，而本发明在中性条件下则无需考虑酸性降解的问题；

3. 本发明制备透明质酸-壳寡糖的复合凝胶，兼具透明质酸优异的生物相容性和壳寡糖对细胞的特殊保护作用，具体特点如下：一方面，复合凝胶发挥功效的有效时间能明显长于单纯透明质酸或者单纯壳寡糖，克服单纯透明质酸和壳寡糖由于良好水溶性而被肌体快速扩散并吸收的缺点；另一方面，复合凝胶使用方便灵活，具有较广的实用价值，本工艺制备的凝胶可以采用无创伤的注射方式应用于人体。

具体实施方式

为了使公众能充分了解本发明的技术实质和有益效果，申请人将在下面对本发明的具体实施方式详细描述，但申请人对实施例的描述不是对技术方案的限制，任何依据本发明构思作形式而非实质的变化都应当视为本发明的保护范围。

一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）溶液的配制：取0.6g的透明质酸溶于30ml蒸馏水中，在室温下搅拌24 h，得到均一稳定的透明质酸溶液；取0.8604g-4.3018g的壳寡糖溶解于50ml蒸馏水中，搅拌24h后，除去未溶解的杂质；取0.227g-0.567g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐交联剂（EDC）溶解于1ml蒸馏水中；

（2）交联反应：取上述配制所得的30ml透明质酸溶液加入2.6298g氯化钠（保持混合液中氯化钠的终浓度为1mol/l），溶解完全后，向其中加入14ml的壳寡糖溶液，搅拌均匀，再滴加1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐交联剂溶液，充分搅拌，待混合均匀后，将混合液置于常温下进行交联反应，反应时间为48h，得到凝胶，最后，将形成的凝胶置于蒸馏水中，除去未交联的反应物。

实施例1

考察不同壳寡糖与透明质酸相对含量对凝胶形成的影响，其制备方法同上述过程，其凝胶生成情况如下表1所示：

表1 不同壳寡糖与透明质酸相对含量对凝胶形成的影响

。

收率的计算：WAC = (W W₀)/W₀ × 100%；其中W是凝胶充分吸水后的重量，W₀是凝胶干燥后的重量。

由上表1可知，随着透明质酸中羧基与壳寡糖中氨基的摩尔比的降低，凝胶的收率和性状影响很大。当摩尔比从1:1降低到1:1.2，凝胶收率从634.0%降低到576.7%，凝胶的流动性稍增大，倾斜凝胶形状稍变形，凝胶颜色略变深；而当摩尔比从1:2降低到1:5时，凝胶收率急剧下降，从576.7%降至254.0%，即凝胶的溶胀率降低，且倾斜凝胶，其形状变形较严重，凝胶不澄清，凝胶颜色进一步加深。因此，透明质酸中羧基与壳寡糖中氨基最合适摩尔比为1:1。

实施例2

考察EDC用量对凝胶形成的影响，其制备方法同上述过程，其凝胶生成情况如下表2所示：

表2 EDC用量对凝胶形成的影响

。

由上表2可知，随着EDC用量的增加，凝胶的收率降低，形状如颜色略有加深，澄清度略差，但是影响不大。当EDC与透明质酸中羧基的摩尔比从0.8:1增加到1.0:1时，凝胶收率从747.9%降低到710.8%，凝胶的流动性变化不明显，倾斜后凝胶形状变化也不明显，颜色变化也不明显；当摩尔比从1.0:1增加到1.5:1时，凝胶收率从710.8%降低到684.7%，凝胶的流动性变化不明显，倾斜后凝胶形状变化也不明显，颜色略有加深；当摩尔比从1.5:1增加到2.0:1时，凝胶收率从684.7%降低到664.9%，凝胶的流动性变化不明显，倾斜后凝胶形状变化也不明显，颜色则略有加深。因此，EDC最合适的用量为：EDC与透明质酸中羧基的摩尔比为0.8:1。

Claims

1. 一种壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）原料液的准备：取透明质酸溶于蒸馏水中，在室温下搅拌24 h，得到均一稳定的透明质酸溶液；取壳寡糖溶解于蒸馏水中，搅拌24 h后，除去未溶解的杂质；取水溶性碳二亚胺交联剂溶解于蒸馏水中；

2.根据权利要求1所述的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于：所述透明质酸的羧基与壳寡糖的氨基摩尔比为1:1-5，所述水溶性碳二亚胺交联剂与透明质酸中羧基的摩尔比为0.8-2.0:1，所述氯化钠在混合液中的含量为1mol/l。

3.根据权利要求2所述的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于：所述透明质酸的羧基与壳寡糖的氨基摩尔比为1:1，所述水溶性碳二亚胺交联剂与透明质酸的羧基摩尔比为0.8:1。

4.根据权利要求1所述的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于：所述水溶性碳二亚胺交联剂为单碳二亚胺或双碳二亚胺。

5.根据权利要求4所述的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于：所述水溶性碳二亚胺交联剂为单碳二亚胺。

6.根据权利要求5所述的壳寡糖和透明质酸交联凝胶的制备方法，其特征在于：所述单碳二亚胺为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。